塞來昔布對人成骨細(xì)胞增殖的影響及其作用機(jī)制

高 杰，桂斌捷，胡孔足，王斯晟

塞來昔布對人成骨細(xì)胞增殖的影響及其作用機(jī)制

高 杰，桂斌捷，胡孔足，王斯晟

摘要目的 觀察塞來昔布對人成骨細(xì)胞增殖的影響及其作用機(jī)制。方法 將人成骨細(xì)胞分為3個組：空白對照組、IL-1刺激組（陰性對照組）、塞來昔布＋I(xiàn)L-1刺激組（藥物干預(yù)組），用RT-PCR法和Western blot法分別檢測三組成骨細(xì)胞環(huán)氧化酶-2（COX-2）、膜相關(guān)前列腺素E2合成酶1 （mPGES-1）mRNA和蛋白的表達(dá)。MTT法檢測塞來昔布對陰性對照組人成骨細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果 RT-PCR法和Western blot法實驗結(jié)果顯示，同空白對照組相比，陰性對照組的人成骨細(xì)胞中COX-2、mPGES-1 mRNA和蛋白的表達(dá)均增加；同陰性對照組相比，藥物干預(yù)組的COX-2、mPGES-1 mRNA和蛋白的表達(dá)均降低。塞來昔布對IL-1刺激的人成骨細(xì)胞的生長具有抑制作用，呈現(xiàn)劑量依賴性，濃度越大，抑制作用越大；并且隨著作用時間的延長，細(xì)胞的抑制作用增大。結(jié)論 塞來昔布可以抑制炎性狀態(tài)下人成骨細(xì)胞的生長，可能是通過調(diào)控COX-2、mPGES-1 mRNA和蛋白的表達(dá)，使其表達(dá)下調(diào)而發(fā)揮作用。

關(guān)鍵詞環(huán)氧化酶-2；塞來昔布；成骨細(xì)胞；異位骨化

2015-03-09接收

作者單位：安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨科，合肥 230000

異位骨化是指在軟組織出現(xiàn)成骨細(xì)胞，并形成骨組織。研究［1-2］表明環(huán)氧化酶-2（cyclooxyenase-2，COX-2）和膜相關(guān)前列腺素E2合成酶（membraneassociated PEG2 synthase，mPGES-1）是花生四烯酸生成前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）過程的重要催化酶，PGE2可以讓原始的間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化成成骨細(xì)胞，促進(jìn)成骨細(xì)胞的生長，并能調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞的分化和功能，提示COX-2和mPGES-1可能對異位骨化的形成發(fā)揮重要作用。研究［3-4］表明IL-1能夠刺激人成骨細(xì)胞的COX-2及mPGES-1的表達(dá)，參與細(xì)胞病理及炎性過程。該研究用COX-2選擇性抑制劑塞來昔布抑制COX-2和mPGES-1的表達(dá)，減少PGE2的生成，研究塞來昔布在炎性狀態(tài)下對成骨細(xì)胞中COX-2、mPGES-1 mRNA和蛋白表達(dá)的影響，同時觀察不同濃度的塞來昔布對炎性狀態(tài)下成骨細(xì)胞增殖的影響，探討COX-2和mPGES-1對成骨細(xì)胞增殖分化的作用和對異位骨化可能的影響，旨在為臨床預(yù)防和治療異位骨化提供新的理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1 材料 人成骨細(xì)胞購自中科院上海細(xì)胞庫；塞來昔布購自中國輝瑞制藥有限公司；無水乙醇溶液、氯仿、異丙醇、甲醇溶液、甘氨酸均購自上海國藥集團(tuán)；白細(xì)胞介素-1（interleukin-1，IL-1）、DMEM高糖培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）購自杭州四季青生物材料有限公司；胰蛋白酶購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。PBS為本實驗室自己配置，TRIzol試劑購自美國Invitrogen生物公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及RT-PCR試劑盒均購自Sigma生物試劑公司；COX-2和mPGES-1單抗均購自美國Proteintech Group公司；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）和鼠、兔二抗均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；Marker購自美國Thermo Scientific公司；BCA蛋白定量試劑盒購自原平皓生物技術(shù)有限公司。

1.2 主要儀器 穩(wěn)壓穩(wěn)流蛋白電泳儀購自美國Bio-Rad公司；ELX-800型光吸收酶標(biāo)儀購自美國Bio-Tek公司；PCR擴(kuò)增儀購自德國Biomatra公司；凝膠密度掃描儀、紫外投射儀均購自上海Tanon科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人成骨細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)液（90%）和胎牛血清（10%）混合培養(yǎng)基中貼壁生長，在5%CO2、37℃的溫箱中培養(yǎng)。2～3 d傳代一次，使保持細(xì)胞處于對數(shù)生長期。

1.3.2 RT-PCR法檢測塞來昔布對成骨細(xì)胞增殖的影響 實驗將處于對數(shù)生長期的人成骨細(xì)胞用胰酶消化后，用DMEM培養(yǎng)基配制成細(xì)胞密度為1× 105個／ml的細(xì)胞懸液分別加入到6孔板中，待細(xì)胞貼壁后將其分為3組：空白對照組、IL-1刺激組（陰性對照組）、塞來昔布＋I(xiàn)L-1刺激組（藥物干預(yù)組），IL-1的濃度為10 ng／ml，塞來昔布的濃度為20

μmol／L，處理24 h后，取出處理的人成骨細(xì)胞，棄培養(yǎng)液，加PBS輕輕地洗滌3遍，吸凈PBS，加入TRIzol，以10 cm2／ml為標(biāo)準(zhǔn)。放置10 min使細(xì)胞充分裂解，然后經(jīng)氯仿處理，異丙醇沉淀，75%乙醇溶液洗滌，干燥，加入20 μl的DEPC水將沉淀溶解，利用紫外分光光度計測量RNA的濃度及OD260／OD280的比值，比值一般在1.8～2.0表示RNA的質(zhì)量好，可以用于下一步的實驗。取質(zhì)量好的RNA按照TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明配置逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。測量cDNA的濃度，計算3組的cDNA總量，將要進(jìn)行RT-PCR的3組cDNA總量保持一致。RT-PCR按25 μl反應(yīng)體系進(jìn)行。COX-2 mRNA上游引物：5’-TTCGGGAGCACAACAGAGTG-3’，下游引物：5’-TAACCGCTCAGGTGTTGCAC-3’；mPGES-1 mRNA上游引物：5’-TAGCCATATTGGAGATGCTGTGG-3’，下游引物：5’-TCAGAGCAAAAGTTAGCTGAACTGG-3’；上游引物：5’-GCCTCGTCTCATAGACAAGATGGT-3’，GAPDH下游引物：5’-GAAGGCAGCCCTGGTAACC-3’。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性15 min，95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸60 s，共35個循環(huán)，最后72℃延伸10 min，4℃保存。PCR產(chǎn)物于1.5%的瓊脂糖凝膠板穩(wěn)壓電泳（120 V／100 Ma，40 min），經(jīng)數(shù)碼凝膠圖像定量分析系統(tǒng)及凝膠密度掃描機(jī)成像處理系統(tǒng)成像、條帶密度掃描。

1.3.3 Western blot法檢測塞來昔布對成骨細(xì)胞增殖的影響 將處于對數(shù)生長期的人成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)移到3張6孔板中，依次將3張培養(yǎng)板分為3組：空白對照組、IL-1刺激組（陰性對照組）、塞來昔布＋I(xiàn)L-1刺激組（藥物干預(yù)組），加藥24 h后收集細(xì)胞，加入適量的細(xì)胞裂解液，冰上裂解30 min，4℃離心30 min，提取蛋白。以BCA法進(jìn)行蛋白定量，120℃蛋白變性5 min，每組的蛋白上樣量為20 μg，上樣后用120 V電泳45 min，然后用100 V轉(zhuǎn)膜1 h，含5%脫脂牛奶TBST液封閉2 h，孵育COX-2和mPGES-1單抗4℃過夜，TBST清洗3次，每次15 min。加入辣根酶標(biāo)記的鼠或兔二抗孵育1 h，TBST清洗干凈后，于曝光儀中涂上發(fā)光劑曝光，并保存圖像。

1.3.4 MTT法檢測塞來昔布對成骨細(xì)胞增殖的影響 取生長狀態(tài)良好的人成骨細(xì)胞于6孔板中，加入濃度為10 ng／ml的IL-1處理細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，調(diào)整細(xì)胞密度為5×104個／ml，接種到96孔板中，每孔加入細(xì)胞懸浮液100 μl，過夜培養(yǎng)。待細(xì)胞生長至80%～90%細(xì)胞密度時，在實驗組的每孔中加入不同濃度的COX-2抑制劑塞來昔布，分別干預(yù)24、48 h（以上每個組設(shè)置4個復(fù)孔），同時設(shè)置調(diào)零孔和不加藥物干預(yù)的空白對照孔。塞來昔布的濃度分別為（0、20、40、60、80、100 μmol／L），在培養(yǎng)板的每孔加入20 μl的MTT（5 mg／ml），37℃條件下避光孵育4 h后結(jié)束培養(yǎng)，小心的吸去上清液，每孔加入150 μl DMSO，在搖床上低速振蕩15 min，使孔內(nèi)的結(jié)晶充分溶解后，在酶聯(lián)免疫酶標(biāo)儀上測定570 nm波長處各孔光密度（optical density，OD）值，取4個復(fù)孔的平均值。按照以下公式計算細(xì)胞的抑制率：細(xì)胞增殖抑制率（%）＝（1-OD實驗組平均值／OD對照組平均值）×100%。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，實驗數(shù)據(jù)采用±s表示，單變量兩組之間的比較采用t檢驗，組間比較采用單因素方差分析。

2　結(jié)果

2.1 塞來昔布對成骨細(xì)胞中COX-2 mRNA、mPGES-1 mRNA表達(dá)的影響 所有陰性對照組、陽性對照組、藥物干預(yù)組的成骨細(xì)胞經(jīng)TRIzol裂解提取后進(jìn)行RNA檢測?？俁NA經(jīng)紫外分光光度計測量，各組OD260／OD280為1.8～2.0，RNA質(zhì)量較好，表明無DNA和蛋白質(zhì)污染，OD230／OD260為1.2～1.6，表明鹽離子清洗干凈，殘留較少。RT-PCR檢測3組細(xì)胞的COX-2、mPGES-1 mRNA的表達(dá)結(jié)果顯示：IL刺激人成骨細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)的COX-2、mPGES-1 mRNA的表達(dá)增加；塞來昔布作用于IL-1刺激組的人成骨細(xì)胞使COX-2、mPGES-1 mRNA的表達(dá)降低，見圖1。

2.2 塞來昔布對成骨細(xì)胞中COX-2、mPGES-1蛋白表達(dá)的影響 同空白對照組相比，陰性對照組成骨細(xì)胞中COX-2、mPGES-1蛋白表達(dá)增加；同陰性對照組相比，藥物干預(yù)組COX-2、mPGES-1蛋白表達(dá)降低（F1＝1.54、F2＝2.92，P＜0.05）。見圖2。

2.3 塞來昔布對成骨細(xì)胞增殖的影響 實驗結(jié)果顯示塞來昔布對炎性狀態(tài)下人成骨細(xì)胞的增殖具有抑制作用，48 h的細(xì)胞增殖抑制率高于24 h的細(xì)胞增殖抑制率；不同濃度的塞來昔布作用于成骨細(xì)胞表現(xiàn)為隨著塞來昔布濃度的增加，其抑制率呈上升趨勢，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（F＝22.86，P＜0.05），見表1、圖3。

表1　不同濃度的塞來昔布分別在24 h和48 h對成骨細(xì)胞生長的影響（±s）

表1　不同濃度的塞來昔布分別在24 h和48 h對成骨細(xì)胞生長的影響（±s）

與48 h比較：*P＜0.05

塞來昔布濃度（μmol／L）24 h OD570　　抑制率（%）48 h OD570　　抑制率（%）0　1.02±0.26　0　1.16±0.34　0 20　0.95±0.19　6.86±0.84*　1.02±0.26 11.65±2.00 40　0.83±0.13 18.80±1.67*　0.89±0.30 23.44±3.22 60　0.74±0.22 31.25±2.61*　0.71±0.06 38.96±3.75 80　0.62±0.31 39.70±3.50*　0.61±0.73 47.53±2.36 100　0.54±0.17 46.88±2.25*0.53±0.40 54.20±2.28

3　討論

絕大部分組織細(xì)胞COX-2在正常情況下的表達(dá)很低，在炎癥、創(chuàng)傷等多種刺激因子作用下可以誘導(dǎo)其高表達(dá)［5-6］，并且mPGES-1受COX-2誘導(dǎo)產(chǎn)生高表達(dá)。研究［7-8］表明COX-2和mPGES-1是花生四烯酸生成PGE2過程的重要催化酶，PGE2可以讓原始的間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化成成骨細(xì)胞，促進(jìn)成骨細(xì)胞的生長，并能調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞的分化和功能。研究［9-10］顯示異位骨化是一種病理性的骨形成，多由創(chuàng)傷、感染等刺激誘發(fā)多見，成骨細(xì)胞在炎癥狀態(tài)下的COX-2高表達(dá)，提示COX-2和mPGES-1可能對異位骨化的形成發(fā)揮重要作用。COX-2選擇性抑制劑能夠選擇性地抑制COX-2的活性和mPGES-1表達(dá)，從而減少其生成，PGE2的合成減少進(jìn)一步使成骨細(xì)胞的分化和生成降低。研究［11］顯示，塞來昔布能夠逆轉(zhuǎn)PGE2引起的糖蛋白降解及抑制糖蛋白合成的作用，保護(hù)機(jī)體糖蛋白。因此，從多方面多角度抑制PGE2的合成，從而抑制成骨細(xì)胞的分化和過度增殖，成為臨床治療患者異位骨化的重要途徑。本研究顯示同空白對照組相比，陰性對照組COX-2、mPGES-l mRNA和蛋白表達(dá)增加；同陰性對照組相

比，塞來昔布干預(yù)組COX-2、mPGES-1 mRNA和蛋白表達(dá)下調(diào)，表明IL-1刺激成骨細(xì)胞中的COX-2、mPGES-1表達(dá)增高，而塞來昔布能夠明顯抑制COX-2、mPGES-1在炎性狀態(tài)下的成骨細(xì)胞的表達(dá)，從而能夠抑制PGE2的合成，達(dá)到抑制人成骨細(xì)胞的生成和分化作用。同時本實驗用MTT法觀察不同濃度不同時間點的塞來昔布是否能影響IL-1刺激的高表達(dá)COX-2、mPGES-1的人成骨細(xì)胞的生長，實驗結(jié)果顯示塞來昔布對高表達(dá)COX-2、mPGES-1的人成骨細(xì)胞的生長具有抑制作用，隨著時間的延長，成骨細(xì)胞的增殖率越來越低，48 h的細(xì)胞增殖抑制率高于24 h的細(xì)胞增殖抑制率；而不同濃度的塞來昔布作用于成骨細(xì)胞表現(xiàn)為隨著塞來昔布濃度的增加，其增殖抑制率呈上升趨勢。

綜上所述，塞來昔布能夠抑制人成骨細(xì)胞的生長，可能與其通過抑制COX-2、mPGE-1 mRNA和蛋白表達(dá)從而抑制成骨細(xì)胞的分化和增殖有關(guān)，為臨床異位骨化的治療與研究提供依據(jù)。

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Study on the impact of celecoxib on proliferation of human osteoblasts

Gao Jie，Gui Binjie，Hu Kongzu，et al
（Dept of Orthopaedics，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230022）

AbstractObjective To study the impact of celecoxib on proliferation of human osteoblasts.Methods The human osteoblasts were cultured and divided into three groups，including the negative control，positive control（stimulated by IL-1）and intervention group（celecoxib＋I(xiàn)L-1）.The detection of mRNA and protein level of COX-2 and mPGES-1 were measured by real tmie PCR（RT-PCR）and Western blot.MTT assay was performed to determine the impact of celecoxib on proliferation of human osteoblasts which were treated with IL-1.Results RT-PCR and Western blot showed that the detection of mRNA and protein level of COX-2 and mPGES-1 of the positive control （stimulated by IL-1）were significantly higher than that of the negative control and intervention group（celecoxib＋I(xiàn)L-1）.Celecoxib had cytotoxic effect on the growth of osteoblasts，manifests dose dependence as well as increasing cell inhibition over time.Conclusion Celecoxib could inhibit proliferation of osteoblasts，and could inhibit the occurrence of heterotopic ossification by regulating the level of mPGES-1 and COX-2 mRNA and protein.

Key wordsCOX-2；celecoxib；osteoblasts；heterotopic ossification

作者簡介：高 杰，男，碩士研究生；桂斌捷，男，教授，副主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者；E-mai：guibinjie12＠163.com

基金項目：安徽省自然科學(xué)基金（編號：1408085MH182）

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號1000-1492（2015）05-0608-04

中圖分類號R 681.8