Toll樣受體2介導(dǎo)的JNK信號(hào)分子在小鼠支氣管哮喘發(fā)病中的作用機(jī)制

沈佩婷，方 磊，吳惠梅，沈啟英，何 芳，劉榮玉

Toll樣受體2介導(dǎo)的JNK信號(hào)分子在小鼠支氣管哮喘發(fā)病中的作用機(jī)制

沈佩婷，方 磊，吳惠梅，沈啟英，何 芳，劉榮玉

摘要目的 探討Toll樣受體2（TLR2）介導(dǎo)的c-Jun氨基末端激酶（JNK）信號(hào)分子參與小鼠支氣管哮喘發(fā)病的作用機(jī)制。方法 健康SPF級(jí)C57（TLR2野生型）鼠和TLR2基因缺失（TLR2-／-）鼠各14只，按隨機(jī)數(shù)字表法分為4組：C57對(duì)照組、C57哮喘組、TLR2-／-對(duì)照組、TLR2-／-哮喘組，每組7只，哮喘組以卵清蛋白（OVA）腹腔注射聯(lián)合霧化吸入致敏和激發(fā)建立哮喘模型，對(duì)照組以生理鹽水代替OVA致敏和激發(fā)。利用免疫組織化學(xué)染色技術(shù)（ABC法）檢測(cè)TLR2蛋白在C57對(duì)照組、C57哮喘組肺內(nèi)的表達(dá)差異，JNK及磷酸化JNK（P-JNK）蛋白表達(dá)在各組肺內(nèi)的表達(dá)差異。結(jié)果 HE染色提示較其余3組，C57哮喘組有較明顯的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及呼吸道平滑肌增生。以平均吸光度（mA）衡量各組織蛋白相對(duì)表達(dá)量，免疫組化結(jié)果提示TLR2蛋白在C57哮喘組表達(dá)顯著高于C57對(duì)照組（P＜0.01），JNK蛋白在各組的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P-JNK蛋白在C57哮喘組肺組織的表達(dá)量顯著高于C57對(duì)照組、TLR2-／-哮喘組、TLR2-／-對(duì)照組（F＝43.261，P＜0.01）。結(jié)論 TLR2介導(dǎo)的JNK信號(hào)分子通路可能參與了支氣管哮喘的發(fā)病過(guò)程。

關(guān)鍵詞哮喘；TLR2；JNK；P-JNK；免疫組化

2015-02-02接收

作者單位：安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院干部呼吸科，安徽省老年病研究所，合肥 230022

支氣管哮喘（簡(jiǎn)稱(chēng)哮喘）是多基因參與的具有遺傳易感性的慢性呼吸道變應(yīng)性疾病，其發(fā)病涉及多種炎癥細(xì)胞、炎性介質(zhì)和復(fù)雜的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)。Toll樣受體家族（Toll like receptors，TLRs）是參與非特異性免疫（天然免疫）的一類(lèi)重要蛋白質(zhì)分子，同時(shí)具有激活和調(diào)節(jié)特異性免疫系統(tǒng)的作用。TLR2在調(diào)控哮喘的發(fā)病機(jī)制中扮演的角色備受爭(zhēng)議［1-2］。TLRs的激活依賴(lài)于連接蛋白髓樣分化蛋白88的結(jié)合，將信號(hào)傳至胞內(nèi)Toll／IL-1受體同源結(jié)構(gòu)域，從而激活下游的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，如核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB誘導(dǎo)激酶，促絲裂原活化蛋白激酶，通過(guò)c-Jun氨基末端激酶（c-Jun amino-terminal kinase，JNK）激活活化蛋白-1轉(zhuǎn)錄因子家族，即可啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)炎性因子的合成及釋放［3-4］。但TLR2激活JNK信號(hào)分子通路參與哮喘的發(fā)病過(guò)程少見(jiàn)報(bào)道。基于以上研究背景，該研究建立TLR2-／-小鼠哮喘模型，擬從形態(tài)學(xué)角度探討TLR2介導(dǎo)的JNK信號(hào)分子通路在哮喘發(fā)病中的可能機(jī)制。

1　材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 非特定病原體雌性小鼠，6～8周齡，SPF級(jí)C57小鼠（上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司）及TLR2-／-小鼠（中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)生命科學(xué)院田志剛教授饋贈(zèng)）各14只，（25±2）g。飼養(yǎng)于中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，飼養(yǎng)環(huán)境符合SPF實(shí)驗(yàn)動(dòng)物級(jí)環(huán)境設(shè)施標(biāo)準(zhǔn)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)器材和試劑 超聲霧化器402AI（江蘇魚(yú)躍醫(yī)療設(shè)備股份有限公司）；卵清蛋白（ovalbumin，OVA）、硫酸鋁鉀（上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司）；兔抗鼠TLR2多克隆抗體（美國(guó)Abcam公司）；兔抗鼠JNK、P-JNK多克隆抗體（美國(guó)CST公司）；SP9000免疫組化染色試劑盒、濃縮型DAB試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組及模型復(fù)制 按照隨機(jī)數(shù)字表法將C57及TLR2-／-小鼠各14只分成4組：C57對(duì)照組、C57哮喘組、TLR2-／-對(duì)照組、TLR2-／-哮喘組。哮喘組小鼠于第0天腹腔注射10 μg OVA和含1 mg硫酸鋁鉀的生理鹽水溶液0.5 ml致敏。第14天開(kāi)始激發(fā)，給予1%OVA生理鹽水50 ml霧化吸入，1次／d，30 min／次，連續(xù)7 d。對(duì)照組參照哮喘組方法，只是致敏和激發(fā)時(shí)均以生理鹽水代替OVA。各組均于末次激發(fā)后24 h處死，切下一半右肺組織經(jīng)4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋切片，用

于HE染色及免疫組化檢測(cè)。

1.2.2 HE染色檢測(cè)肺組織病理變化 光鏡（× 10）下觀察HE染色的支氣管肺組織周?chē)装Y細(xì)胞浸潤(rùn)、平滑肌增生情況。

1.2.3 免疫組織化學(xué)檢測(cè)蛋白表達(dá) 切片常規(guī)脫蠟至水，采用高火微波修復(fù)抗原，檸檬酸緩沖液pH ＝6.0。3%過(guò)氧化氫抑制內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性及0.3%Triton-X 100增加肺組織通透性，以5%山羊血清（A液）封閉減少非特異性表達(dá)。滴加一抗，37℃孵育1 h后4℃過(guò)夜（視抗體表達(dá)程度可適當(dāng)予以延長(zhǎng)），PBS洗滌后，生物素標(biāo)記的二抗（B液）處理30 min，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的C液37℃孵育30 min，ABC液均為SP9000檢測(cè)試劑盒內(nèi)容物，DAB顯色，鏡下控制染色時(shí)間，含有粗細(xì)不一的棕黃色顆粒即為陽(yáng)性細(xì)胞。蘇木精輕度復(fù)染，脫水，透明，中性樹(shù)膠封片。每張切片隨機(jī)選擇4個(gè)結(jié)構(gòu)較完整的支氣管（×20），應(yīng)用JD 801D圖像分析軟件測(cè)定陽(yáng)性部位的平均吸光度（mean absorbance，mA），代表各蛋白表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS 16.0軟件分析，計(jì)量資料均符合正態(tài)分布，以±s表示，兩樣本均數(shù)比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組樣本均數(shù)采用單因素方差分析法，兩兩比較采用Bonferroni檢驗(yàn)。

2　結(jié)果

2.1 小鼠行為學(xué)改變 哮喘組在激發(fā)時(shí)均出現(xiàn)不同程度的煩躁不安、呼吸急促、毛發(fā)豎直、大小便失禁等癥狀，嚴(yán)重者呼吸減慢，行動(dòng)遲緩，而對(duì)照組無(wú)明顯上述表現(xiàn)。

2.2 肺組織形態(tài)學(xué)改變 光鏡示C57哮喘組支氣管、血管周?chē)罅垦装Y細(xì)胞浸潤(rùn)，嗜酸性粒細(xì)胞增多，呼吸道上皮黏液腺增生，支氣管壁明顯增厚、管腔狹窄，肺泡壁結(jié)構(gòu)紊亂，而C57對(duì)照組及TLR2-／-對(duì)照組支氣管周?chē)鷦t有少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，無(wú)明顯平滑肌增生、支氣管壁增厚，肺泡結(jié)構(gòu)完整。TLR2-／-哮喘組炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及平滑肌增生等較C57哮喘組有所減弱。見(jiàn)圖1。

2.3 肺組織TLR2、JNK、P-JNK蛋白表達(dá)TLR2、JNK、P-JNK蛋白主要表達(dá)定位在胞質(zhì)和胞核，支氣管上皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞及浸潤(rùn)的炎癥細(xì)胞均可見(jiàn)表達(dá)。TLR2蛋白在C57哮喘組肺組織的表達(dá)量顯著高于C57對(duì)照組（P＜0.01），見(jiàn)圖2、表1。JNK蛋白在各組中的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)圖3、

表1。P-JNK蛋白在C57哮喘組肺組織的表達(dá)量顯著高于C57對(duì)照組、TLR2-／-哮喘組、TLR2-／-對(duì)照組（F＝43.261，P＜0.01），見(jiàn)圖3、表1。

表1　TLR2、JNK、P-JNK在各組小鼠肺組織mA比較（n＝7，±s）

表1　TLR2、JNK、P-JNK在各組小鼠肺組織mA比較（n＝7，±s）

與C57對(duì)照組比較：**P＜0.01；與其他3組比較：＃＃P＜0.01

組別　TLR2蛋白含量　JNK蛋白含量　P-JNK 蛋白含量C57對(duì)照0.199±0.014　0.385±0.018　0.286±0.024 C57哮喘　0.448±0.096**0.358±0.050　0.534±0.099＃＃TLR2-／-對(duì)照　　-　0.344±0.076　0.205±0.040 TLR2-／-哮喘　-　0.383±0.076　0.322±0.037

3　討論

TLRs在參與哮喘氣道炎癥的不同細(xì)胞上均有表達(dá)，如上皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞、肥大細(xì)胞［5］和氣道平滑?。?］。Ferreira et al［1］收集24例致命性哮喘患者的臨床標(biāo)本，發(fā)現(xiàn)TLR2蛋白在氣道上皮的表達(dá)較對(duì)照組升高。Th2細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子的增多在哮喘的發(fā)病中起著重要的作用，Re-

decke et al［7］發(fā)現(xiàn)TLR2的配體Pam3Cys通過(guò)持續(xù)性誘導(dǎo)Th2反應(yīng)，下調(diào)Th1因子，從而使免疫反應(yīng)向Th2優(yōu)勢(shì)的方向發(fā)展，促進(jìn)實(shí)驗(yàn)性哮喘的發(fā)生，而另一項(xiàng)研究［2］顯示TLR2的配體Pam3Cys通過(guò)降低氣道高反應(yīng)性，減弱肺內(nèi)Th2型炎癥反應(yīng)及特異性IgE的分泌等抑制哮喘的發(fā)生。

有研究［8-9］顯示，TLR2基因變異是哮喘易感性的主要決定因素。研究［10］表明，TLR2-／-時(shí)哮喘組小鼠氣道炎癥浸潤(rùn)程度顯著降低，且一種新型的晚期炎癥介質(zhì)即高遷移率族蛋白1信號(hào)分子在BALF及肺組織中的表達(dá)亦減少。本研究在前期工作基礎(chǔ)上，通過(guò)OVA致敏及激發(fā)小鼠成功建立哮喘模型，進(jìn)一步提出TLR2介導(dǎo)了JNK信號(hào)通路參與哮喘的發(fā)病機(jī)制。免疫組織化學(xué)直觀地顯示出TLR2蛋白在C57哮喘組的表達(dá)顯著高于C57對(duì)照組，與上述TLR2可能促進(jìn)小鼠支氣管哮喘發(fā)生的結(jié)論相符。

JNK是促絲裂原活化蛋白激酶超家族成員之一，通過(guò)三級(jí)酶促級(jí)聯(lián)反應(yīng)，完成JNK磷酸化，從而在炎癥反應(yīng)的諸多方面發(fā)揮免疫調(diào)控作用［11］。Nath et al［12］通過(guò)哮喘造模發(fā)現(xiàn)JNK信號(hào)通路在氣道炎癥、氣道重塑及伴隨的氣道高反應(yīng)性中發(fā)揮重要作用。Oltmanns et al［13］研究證實(shí)在氣道慢性炎癥和重構(gòu)過(guò)程中，JNK是一個(gè)重要的信號(hào)分子，可促進(jìn)氣道平滑肌細(xì)胞分泌炎性因子如活性調(diào)節(jié)蛋白、白介素-8等。有研究［14］表明P-JNK與哮喘氣道重塑密切相關(guān)，表現(xiàn)為蛋白表達(dá)量升高，而JNK作為P-JNK的前體其表達(dá)量無(wú)顯著差異。本研究免疫組織化學(xué)檢測(cè)JNK蛋白在各組之間的表達(dá)無(wú)明顯差異，P-JNK在哮喘組中表達(dá)升高與以上結(jié)論相符。

肺泡巨噬細(xì)胞主要通過(guò)吞噬病原體和協(xié)調(diào)炎癥反應(yīng)來(lái)調(diào)控天然免疫應(yīng)答，參與哮喘的發(fā)病，F(xiàn)ang et al［15］通過(guò)金黃色葡萄球菌刺激RAW264.7肺泡巨噬細(xì)胞系，發(fā)現(xiàn)TLR2基因沉默可以顯著地降低PJNK在巨噬細(xì)胞的表達(dá)，推測(cè)TLR2可能活化并介導(dǎo)了JNK信號(hào)通路。Watanabe et al［16］也有過(guò)類(lèi)似的發(fā)現(xiàn)。本研究中免疫組織化學(xué)檢測(cè)顯示活化的P-JNK在C57哮喘組顯著升高，TLR2-／-時(shí)其表達(dá)量則明顯降低。因此，推測(cè)TLR2蛋白在誘發(fā)哮喘過(guò)程中占主導(dǎo)地位，同時(shí)進(jìn)一步激活并介導(dǎo)JNK信號(hào)分子參與小鼠支氣管哮喘的發(fā)生，但其確切的調(diào)控機(jī)制仍需深入探討。

參考文獻(xiàn)

［1］ Ferreira D S，Annoni R，Silva L F，et al.Toll-like receptors 2，3 and 4 and thymic stromal lymphopoietin expression in fatal asthma ［J］.Clin Exp Allergy，2012，42（10）：1459-71.

［2］ Haapakoski R，Karisola P，F(xiàn)yhrquist N，et al.Toll-like receptor activation during cutaneous allergen sensitization blocks development of asthma through IFN-gamma-dependent mechanisms［J］.J Invest Dermatol，2013，133（4）：964-72.

［3］ Aderem A，Ulevitch R J.Toll-like receptors in the induction of the innate immune response［J］.Nature，2000，406（6797）：782-7.

［4］ Kawai T，Akira S.TLR signaling［J］.Cell Death Differ，2006，13 （5）：816-25.

［5］ Takeda K，Kaisho T，Akira S.Toll-like receptors［J］.Annu Rev

Immunol，2003，21：335-76.

［6］ Sukkar M B，Xie S，Khorasani N M，et al.Toll-like receptor 2，3，and 4 expression and function in human airway smooth muscle［J］.J Allergy Clin Immunol，2006，118（3）：641-8.

［7］ Redecke V，Hcker H，Datta S K，et al.Cutting edge：Activation of Toll-like receptor 2 induces a Th2 immune response and promotes experimental asthma［J］.J Immunol，2004，172（5）：2739 -43.

［8］ Smit L A，Bouzigon E，Bousquet J，et al.Mold allergen sensitization in adult asthma according to integrin beta3 polymorphisms and Toll-like receptor 2／＋596 genotype［J］.J Allergy Clin Immunol，2011，128（1）：185-191.e7.

［9］ Eder W，Klimecki W，Yu L，et al.Toll-like receptor 2 as a major gene for asthma in children of European farmers［J］.J Allergy Clin Immunol，2004，113（3）：482-8.

［10］何 芳，沈啟英，方 磊，等.Toll樣受體2介導(dǎo)的高遷移率族蛋白1信號(hào)分子在小鼠支氣管哮喘中的作用機(jī)制［J］.中華醫(yī)學(xué)雜志，2014，94（16）：1219-22.

［11］Hommes D W，Peppelenbosch M P，van Deventer S J，et al.Mitogen activated protein（MAP）kinase signal transduction pathways and novel anti-inflammatory targets［J］.Signal Transduct，2003， 52（1）：144-51.

［12］Nath P，Eynott P，Leung S Y，et al.Potential role of c-Jun NH2-terminal kinase in allergic airway inflammation and remodelling：effects of SP600125［J］.Eur J Pharmacol，2005，506（3）：273-83.

［13］Oltmanns U，Issa R，Sukkar M B，et al.Role of c-jun N-terminal kinase in the induced release of GM-CSF，RANTES and IL-8 from human airway smooth muscle cells［J］.Br J Pharmacol，2003，139 （6）：1228-34.

［14］林 立，管小俊，李昌崇，等.c-Jun氨基末端激酶磷酸化在支氣管哮喘大鼠氣道重塑中的作用及糖皮質(zhì)激素的影響［J］.中華結(jié)核和呼吸雜志，2010，33（3）：188-92.

［15］Fang L，Wu H M，Ding P S，et al.TLR2 mediates phagocytosis and autophagy through JNK signaling pathway in Staphylococcus aureus-stimulated RAW264.7 cells［J］.Cell Signal，2014，26（4）：806-14.

［16］Watanabe I，Ichiki M，Shiratsuchi A，et al.TLR2-mediated survival of Staphylococcus aureus in macrophages：a novel bacterial strategy against host innate immunity［J］.J Immunol，2007，178 （8）：4917-25.

Mechanism of c-Jun N-terminal kinase mediated by Toll like receptor 2 in murine asthma

Shen Peiting，F(xiàn)ang Lei，Wu Huimei，et al
（Dept of Geriatric Pulmonary，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Geriatric Institute of Anhui Province，Hefei 230022）

AbstractObjective To explore the mechanism of c-Jun N-terminal kinase mediated by Toll like receptor 2 in murine asthma.Methods 14 healthy SPF grade C57 wild-type mice and 14 TLR2 knockout（TLR2-／-）mice were randomly divided into four groups：C57 control group，C57 asthma group，TLR2-／-control group，TLR2-／-asthma group（n＝7）.We utilized intraperitoneal injection combined with inhalation of ovalbumin（OVA）to sensitize and challenge the mice，thus establishing the experimental models of asthma.Meanwhile，the control group received normal saline instead of OVA.The protein expression of TLR2 was detected by immunohistochemistry（ABC method）in C57 control group and C57 asthma group，as well as JNK and phosphorylation c-Jun（P-JNK）between each group.Results In C57 asthma group，HE-staining showed more obvious inflammatory cell infiltration around bronchi and airway smooth muscle hyperplasia than the other three groups.The relative protein expressions were measured by mean absorbance（mA）.Immunohistochemistry indicated that mean absorbance values of TLR2 was significantly higher in C57 asthma group than those of C57 control group（P＜0.01）.There was no obvious difference of JNK protein expression between each group.The immunoexpression of P-JNK in C57 asthma group was notablely higher than those of C57 control group，TLR2-／-asthma group，TLR2-／-control group（F＝43.261，P＜0.01）.Conclusion TLR2-mediated JNK signaling molecules may be involved in the process of murine asthma.

Key wordsasthma；Toll like receptor 2；c-Jun N-terminal kinase；phosphorylation c-Jun N-terminal kinase；immunohistochemistry

作者簡(jiǎn)介：沈佩婷，女，碩士研究生；劉榮玉，女，教授，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：rongyuliu＠gmail.com

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：81270082、81170030、81300027）；高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專(zhuān)項(xiàng)科研基金（編號(hào)：20113420110006）；安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室計(jì)劃項(xiàng)目（編號(hào)：1206c0805028）；安徽省科技攻關(guān)項(xiàng)目（編號(hào)：12010402135）

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號(hào)1000-1492（2015）05-0573-04

中圖分類(lèi)號(hào)R 562.2＋5；Q 241；Q 74