翹嘴鱖F2家系選育及微衛(wèi)星親子鑒定

楊 凱 成為為 高銀愛 王青云 羅 峰 夏儒龍 朱思華程穎紅 鄧國喬

(武漢市水產(chǎn)科學(xué)研究所, 武漢 430207)

研究簡報

翹嘴鱖F2家系選育及微衛(wèi)星親子鑒定

楊 凱 成為為 高銀愛 王青云 羅 峰 夏儒龍 朱思華程穎紅 鄧國喬

(武漢市水產(chǎn)科學(xué)研究所, 武漢 430207)

翹嘴鱖(Siniperca chuatsi)俗稱“桂花”、“季花”, 隸屬于鱸形目(Perciformes), 鱖屬(Siniperca), 是鱖屬魚類中體型最大、生長最快的一種[1]。其肉質(zhì)堅實(shí)細(xì)嫩、味道鮮美、營養(yǎng)豐富、無肌間刺, 是一種經(jīng)濟(jì)價值很高的名貴魚類, 在我國淡水養(yǎng)殖業(yè)中占有重要的經(jīng)濟(jì)地位[2]。目前,養(yǎng)殖的翹嘴鱖親魚大多從野生資源中捕獲而來, 缺乏定向選育, 加之一些繁育單位不注重親魚的保種和留種工作, 甚至為了生產(chǎn)上的方便, 選擇個體小, 性成熟早的個體作為親本, 致使翹嘴鱖種質(zhì)質(zhì)量急劇下降。因此, 良種選育已經(jīng)成為我國鱖養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)健康和可持續(xù)發(fā)展亟待解決的重要課題之一。

家系選育是獲得優(yōu)良品種的重要手段之一, 其可以增加物種某一種群體內(nèi)具有育種價值的基因頻率, 降低育種不需要的基因頻率, 使個體更適用于特定的生產(chǎn)目的和要求[3]。在家系選育過程中, 準(zhǔn)確地掌握系譜信息,可以有效地指導(dǎo)親本選留, 從而縮短育種周期, 提高育種效率。然而, 環(huán)境因素對遺傳參數(shù)有較大的影響, 因此,為了降低環(huán)境因素對遺傳參數(shù)的準(zhǔn)確評估, 需要利用遺傳標(biāo)記對混養(yǎng)的不同家系進(jìn)行親子鑒定[4]。傳統(tǒng)的外部物理標(biāo)記如顏色、電子標(biāo)記等有明顯的不足之處[5], 相比之下, 微衛(wèi)星分子標(biāo)記具有共顯性遺傳、數(shù)量多、分布廣泛均勻、多態(tài)性豐富及檢測方便等優(yōu)點(diǎn), 是進(jìn)行系譜追蹤有力的工具[6]。諸多研究證明, 微衛(wèi)星分子標(biāo)記可以有效地確認(rèn)混養(yǎng)群體的家系信息[7], 是進(jìn)行選擇育種研究非常有效的標(biāo)記手段。

本研究以武漢市水產(chǎn)科學(xué)研究所家系選育的 F2翹嘴鱖個體為研究對象, 采用微衛(wèi)星標(biāo)記技術(shù)對翹嘴鱖混養(yǎng)家系進(jìn)行親子鑒定, 意在為翹嘴鱖后續(xù)家系選擇育種工作的順利開展提供生長速度快且抗病力強(qiáng)的候選親本和分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

2010年 5月, 分別從廣東省佛山市南海區(qū)石啃魚苗場和武漢市佳恒水產(chǎn)有限公司引進(jìn)種苗 5000尾, 各選留500尾生長速度快、體型好、健壯個體作為廣東和湖北地區(qū)選育基礎(chǔ)群體。2011年5月, 從上述 2個基礎(chǔ)群體中選取生長性狀優(yōu)良的雌雄個體建立翹嘴鱖 F1家系, 并從中挑選了5個具有生長優(yōu)勢家系。2013年5月, 以上述5個優(yōu)良家系為親本, 采用家系內(nèi)個體巢式交配原則構(gòu)建了 30個 F2家系, 其中廣東養(yǎng)殖群體家系 7個, 編號為GDF2-1、GDF2-2、GDF2-3、GDF2-4、GDF2-5、GDF2-6、GDF2-7; 湖北養(yǎng)殖群體家系 23個, 編號為 HBF2-1、HBF2-2、HBF2-3、…、HBF2-21、HBF2-22、HBF2-23。建系時, 采用人工單獨(dú)受精, 隔離孵化及養(yǎng)殖至5 cm時,從每個家系各挑選1000尾個體進(jìn)行同塘混養(yǎng)。養(yǎng)殖6個月后, 干塘起捕至網(wǎng)箱中, 挑選體重較大的個體(≥500 g)作為下一代育種材料并進(jìn)行親子鑒定研究。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

樣本收集及DNA提取 剪取翹嘴鱖24尾親本及F2子代鰭條組織浸泡在95%的乙醇中, 然后置于4℃下保存?zhèn)溆?。采用?jīng)典的酚氯法提取基因組DNA。

引物來源 15個微衛(wèi)星引物來源于已發(fā)表的文獻(xiàn)[8], 序列及其擴(kuò)增等信息見表1, 引物由上海生工生物工程技術(shù)公司合成。

PCR擴(kuò)增及分型 PCR反應(yīng)體系12.5 μL: 含模板DNA 30—50 ng, 10×buffer (含Mg2+)1.25 μL, dNTP 0.4 μL (2.5 mmol/L), 引物0.5 μL(2 μmol/L), Taq酶0.1 μL(5 U/L),添加 ddH2O至終體系。反應(yīng)條件為: 95℃預(yù)變性 5min; 94℃變性35s, 退火35s(溫度見表1), 72℃延伸40s, 35個循環(huán); 72℃后延伸10min。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在10%的非變性聚丙烯酰胺凝膠上230V電泳4h, EB顯色, 凝膠電泳成像。以分子標(biāo)記物pBR322/ Msp Marker (天根生化有限公司)確定等位基因的大小。

表1 微衛(wèi)星引物基本信息Tab. 1 The basic information of the primer

親子鑒定分析 使用CERVUS3.0軟件對每一個體的基因型進(jìn)行親權(quán)分析, 計算出各微衛(wèi)星位點(diǎn)的等位基因頻率、雜合度、多態(tài)信息含量、Hardy-Weinberg平衡及無效等位基因頻率, 根據(jù)LOD值對每一個體的父母作出鑒定。

生長性狀評估 根據(jù)親子鑒定結(jié)果, 使用 SPSS 19.0軟件(SPSS公司, 美國)對 F2進(jìn)行方差分析、顯著性檢測和LSD多重比較, 評估其生長性狀。

2 結(jié)果

2.1 F2混合群體家系鑒定

試驗(yàn)共選育F2代個體486尾, 利用15對微衛(wèi)星引物對翹嘴鱖486尾混養(yǎng)個體進(jìn)行PCR擴(kuò)增, 然后進(jìn)行基因分型并統(tǒng)計其基因型。根據(jù)統(tǒng)計的基因型數(shù)據(jù), 應(yīng)用CERVUS3.0軟件對混養(yǎng)群體進(jìn)行家系鑒定, 15個微衛(wèi)星座位在混養(yǎng)家系檢測值見表2。

為了保證鑒定結(jié)果準(zhǔn)確, 根據(jù)LOD值鑒定候選親本時, 只有所有的微衛(wèi)星座位全部匹配, 并符合親本交配體制才確認(rèn)為親子關(guān)系, 最終確認(rèn)了 470個混養(yǎng)后裔的父母(表 3), 其真實(shí)鑒定率為 96.7%, 低于軟件分析算出的鑒定率(98.8%)(圖1)。鑒定結(jié)果表明470尾翹嘴鱖個體分屬于30個家系, 其后裔數(shù)目介于3—28。

2.2 生長性狀評估

根據(jù)家系鑒定結(jié)果, 本研究分別計算了各家系的體質(zhì)量和標(biāo)準(zhǔn)差(表3)。對優(yōu)勢個體數(shù)達(dá)到 15尾以上的 F2各家系平均體質(zhì)量進(jìn)行顯著性差異分析及LSD多重比較,數(shù)量15以下家系未進(jìn)行統(tǒng)計分析。結(jié)果顯示, GDF2-5體質(zhì)量顯著最高, 為569.59 g, 數(shù)量為17尾; HBF2-23體質(zhì)量顯著最低, 為521.09 g, 數(shù)量也為17尾; 廣東養(yǎng)殖群體家系 GDF2-2、GDF2-4、GDF2-5和湖北養(yǎng)殖群體家系HBF2-1、HBF2-12、HBF2-15、HBF2-22的體質(zhì)量顯著高于其他家系(P＜0.05), 數(shù)量達(dá)到15尾以上, 宜選育為翹嘴鱖下一代家系選育的優(yōu)勢親本。

3 討論

3.1 F2混合群體家系鑒定

準(zhǔn)確的系譜關(guān)系對良種選育有著重要的作用, 因此必須選擇合適的標(biāo)記來掌握正確的系譜信息[9]。本研究使用 15個有效的微衛(wèi)星標(biāo)記對雙親已知的 30個家系 486尾個體的混養(yǎng)群體進(jìn)行家系鑒定。鑒定結(jié)果表明在 486尾個體中, 當(dāng)所有的微衛(wèi)星座位全部匹配, 并符合親本交配體制時, 有470尾翹嘴鱖個體確認(rèn)了父母, 其真實(shí)鑒定率達(dá)96.7%。陳騰等[10]認(rèn)為在采用微衛(wèi)星標(biāo)記進(jìn)行親子鑒定的生產(chǎn)實(shí)踐中, 當(dāng)個體識別率大于0.8時, 表明該研究所使用的微衛(wèi)星標(biāo)記具有較高的應(yīng)用價值。因此, 本研究中所使用的微衛(wèi)星標(biāo)記能有效地應(yīng)用于翹嘴鱖遺傳改良和生產(chǎn)實(shí)踐。

表2 15個微衛(wèi)星位點(diǎn)在翹嘴鱖混養(yǎng)家系檢測值Tab. 2 Detective values of the fiveteen microsatellite loci in mix-feed families of mandarin fish

表3 翹嘴鱖選育世代及體重指標(biāo) (平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)Tab. 3 Body parameters of selective generation of superior families in mandarin fish (mean ± SD)

3.2 翹嘴鱖家系鑒定影響因素

親本規(guī)模及其親緣關(guān)系和標(biāo)記數(shù)量及其多態(tài)性是影響家系準(zhǔn)確性一個重要原因[4]。以往的微衛(wèi)星親子鑒定研究結(jié)果表明, 使用5—8個微衛(wèi)星標(biāo)記就能達(dá)到90%以上的鑒定準(zhǔn)確率, 而在本研究中當(dāng)使用超過12個微衛(wèi)星標(biāo)記時, 才能達(dá)到相同的鑒定準(zhǔn)確率。這可能是因?yàn)楸狙芯繕?gòu)建的30個F2家系是由5個F1家系繁育而來, 而來源于同一 F1家系的后裔親緣關(guān)系較近, 從而增加了家系鑒定的難度。無效等位基因的存在是影響家系鑒定準(zhǔn)確性另一個重要原因[4], 通常是由于引物結(jié)合位點(diǎn)的替代、插入或缺失等突變造成引物無法結(jié)合而產(chǎn)生。然而, 無效等位基因的存在會造成群體雜合子缺失, 從而降低鑒定準(zhǔn)確率, 目前已在多個物種中證實(shí)了它的存在[11]。在進(jìn)行親子鑒定研究所用的 15個微衛(wèi)星標(biāo)記中, 有 6個微衛(wèi)星標(biāo)記偏離Hardy-Weinberg平衡和 3個微衛(wèi)星標(biāo)記無效等位基因頻率超過 5%, 這些標(biāo)記的使用可能會降低鑒定準(zhǔn)確率。另外, 基因分型錯誤也會降低家系鑒定率。O’Reilly等[6]研究發(fā)現(xiàn)平均每個基因座位會產(chǎn)生 2%—3%分型錯誤率,如果個體在多個位點(diǎn)都出現(xiàn)了錯誤的分型結(jié)果, 就會產(chǎn)生錯配的現(xiàn)象, 但如果僅在 1—2個位點(diǎn)出現(xiàn)分型錯誤, 可通過多基因座位的綜合分析也會得到準(zhǔn)確的結(jié)果[9]。本研究混養(yǎng)家系的鑒定率高達(dá)98.8%, 一方面本研究使用了較多的微衛(wèi)星標(biāo)記(15個); 另一方面是因?yàn)榛祓B(yǎng)群體是由近交繁育而成, 微衛(wèi)星位點(diǎn)在群體中的平均等位基因只有3.39個, 因而較少產(chǎn)生分型錯誤。

圖1 翹嘴鱖F2真實(shí)家系(實(shí)際)和軟件分析結(jié)果比較圖Fig. 1 The comparison of real and software analysis results of F2selective generation in mandarin fish

3.3 優(yōu)良家系鑒定

家系選育是根據(jù)某個性狀或某幾個性狀明顯優(yōu)于其親屬、生長性能顯著高于其親屬的混有不同類型的原始群體里選出一些優(yōu)良個體留種, 建立幾個或若干個家系并繁殖后代, 逐代與原始群體相比較, 選留那些符合原定選擇指標(biāo)的優(yōu)良家系, 進(jìn)而參加品系產(chǎn)量測定、繁育推廣后鑒定新品種[3]。近交和選擇是家系選育中建系的重要手段。一般來說, 顯性性狀對生長發(fā)育有較好的作用, 可通過累代近親繁殖將顯性基因純化, 但與此同時不良作用的隱形性狀也表現(xiàn)出來, 因此在近親繁殖的同時, 必須進(jìn)行選擇。選擇是選擇育種最有效的方法,在選擇過程中有積累顯性基因, 減少隱性基因的作用,從而構(gòu)建性狀穩(wěn)定的自交系。然后進(jìn)行自交系間雜交,有利于優(yōu)勢性狀顯性基因的聚合, 進(jìn)而能達(dá)到更好的育種效果。

本研究以生長性狀為育種目標(biāo), 采用家系選育的方法構(gòu)建了翹嘴鱖F2代家系30個, 以1.6%左右的擇優(yōu)率從30000尾混養(yǎng)群體中挑選了486尾體質(zhì)量大的個體作為下一代繁育親本。根據(jù)家系鑒定結(jié)果, 470尾個體被準(zhǔn)確地鑒定到30個F2代家系, 每個家系個體數(shù)在3—28個, 可見, 在個體質(zhì)量≥500 g的同一選育標(biāo)準(zhǔn)下, 各個家系選育出個的體數(shù)存在較大差異, 數(shù)量占有比例越大, 說明該家系群體越具備生長優(yōu)勢, 群體產(chǎn)量越高, 反之亦然。從家系繁育數(shù)量和統(tǒng)計學(xué)要求考慮, 對達(dá)到 15尾以上的F2家系進(jìn)行統(tǒng)計分析。結(jié)果表明, 各個家系間存在顯著的生長差異(P＜0.05), 具有進(jìn)一步選育的空間和意義(表3)。綜合各個家系個體數(shù)和體質(zhì)量指標(biāo), 試驗(yàn)選育的廣東養(yǎng)殖群體家系GDF2-2、GDF2-4、GDF2-5和湖北養(yǎng)殖群體家系HBF2-1、HBF2-12、HBF2-15、HBF2-22共7個優(yōu)勢家系作為翹嘴鱖下一代家系選育的優(yōu)勢親本。

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PARENTAGE ANALYSIS OF F2SELECTIVE GENERATION IN MANDARIN FISH USING MICROSATELLITES

YANG Kai, CHENG Wei-Wei, GAO Yin-Ai, WANG Qing-Yun, LUO Feng, XIA Ru-Long, ZHU Si-Hua, CHENG Ying-Hong and DENG Guo-Qiao
(Wuhan Fisheries Science Research Institute, Wuhan Academy of Agricultural Science &Technology, Wuhan 430207, China)

翹嘴鱖; 微衛(wèi)星; 親子鑒定; 家系

Mandarin fish; Microsatellite; Parentage identification; Family

Q347

A

1000-3207(2015)06-1231-05

10.7541/2015.160

2014-11-06;

2015-01-16

武漢市農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)研究院創(chuàng)新項目(翹嘴鱖優(yōu)勢家系遺傳距離的評估及選育CX201419; 鱖良種選育、遺傳性狀分析及品質(zhì)評價 Cxtd201504)項目資助

楊凱(1982—), 男, 山西五臺人; 碩士; 主要研究方向?yàn)檫z傳育種。E-mail: 593539389@qq.com

高銀愛, 高級工程師; E-mail: 304104752@qq.com