4-苯基丁酸改善休克后器官缺血缺氧損傷

彭小勇，李 濤，劉良明，朱 娛，藍 丹，吳 躍，楊光明

缺血缺氧是多種疾病均存在的一種病理狀態(tài)，是引起重要組織器官損傷最常見的因素。創(chuàng)傷失血性休克是導致機體有效循環(huán)血量不足、組織器官缺血缺氧的主要原因。防止休克后缺血缺氧所致器官損傷的關鍵是恢復有效血流灌注、改善組織氧供［1］。因此，尋找有效的改善組織缺血缺氧狀態(tài)和器官功能的抗休克措施具有重要意義。4-苯基丁酸(4-phenyl butyric acid，PBA)是一種具有多種功能的新藥，在臨床上主要用于治療兒童腎臟疾病和鐮狀細胞貧血等疾?。?－3］，近來它在缺血缺氧和再灌注損傷中的作用成為臨床醫(yī)生和研究者關注的焦點［3－4］。我們近期研究發(fā)現，PBA對創(chuàng)傷性休克大鼠有明顯的治療作用，能顯著改善休克動物的存活情況，那么它是否通過改善重要器官的血流灌注和線粒體功能對器官功能發(fā)揮作用?本實驗對此進行了研究。

材料與方法

1 實驗動物

SD大鼠128只(由第三軍醫(yī)大學第三附屬醫(yī)院實驗動物中心提供)，雌雄各半，體重180～220g。

2 實驗方法

2.1 實驗分組及模型制備 SD大鼠隨機分為4組:乳酸林格氏液(LR)組、PBA 5mg/kg組、PBA 20mg/kg組、PBA 50mg/kg組，每組分別在休克前、休克末、復蘇后1h和2h檢測各項指標，每組每個時相點8只大鼠。本實驗常規(guī)方法制備創(chuàng)傷失血性休克模型［5］:用3%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，右側股動脈插管供觀察血壓和放血，股靜脈插管用于給藥復蘇，折斷大鼠左側股骨，同時通過股動脈插管放血至血壓40mmHg，維持3h。休克模型成功后按實驗分組進行復蘇，LR組輸注2倍失血量的LR，PBA組按照分組劑量將PBA加入LR中輸注，休克對照組不予復蘇。

2.2 肝、腎血流量及肝、腎功能檢測 在各時相點，行剖腹手術，充分暴露大鼠的肝臟和腎臟，用激光多普勒血流儀(PF5001，Perimed，瑞典)的探針刺入肝、腎組織下0.5cm左右，測定肝、腎并記錄血流量。然后抽取2ml動脈血用生化分析儀(BXC800，Beckman，美國)檢測肝、腎功能指標，包括天冬氨酸氨基轉移酶(AST)、丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、血尿素氮(BUN)和血肌酐(CREA)。

2.3 肝、腎、腸線粒體功能測定 取大鼠肝、腎和小腸組織，在冰上提取線粒體，用溶氧儀(MT200，Strathkelvin，蘇格蘭)測定線粒體功能。在30℃恒溫條件下校準儀器，將提取的線粒體懸液加入反應介質中，觀察在有二磷酸腺苷(ADP)刺激下的耗氧量(3態(tài)呼吸)和無ADP刺激下的耗氧量(4態(tài)呼吸)，線粒體功能以其比值(呼吸控制率，RCR)來反映［6］。

3 統計學分析

結 果

1 PBA對創(chuàng)傷失血性休克大鼠肝、腎血流量的影響

休克后大鼠的肝、腎血流量均顯著下降(P＜0.01)。LR輸注使肝、腎血流量有輕度升高。20mg/kg的PBA輸注可明顯恢復肝血流量，顯著高于LR組(P＜0.01)，而PBA 5和50mg/kg組與LR組無明顯差異;各劑量PBA都可明顯升高腎臟血流量，均高于LR組(P＜0.01)，其中PBA 20mg/kg的恢復作用最為顯著(圖1)。

圖1 PBA對創(chuàng)傷失血性休克大鼠肝(A)、腎(B)血流量的影響

2 PBA對創(chuàng)傷失血性休克大鼠肝、腎功能的影響

休克明顯引起了肝、腎功能的損傷，反映肝、腎功能的各項指標，包括AST、ALT、BUN和CREA在休克后均顯著高于正常水平(P＜0.01)。PBA 20mg/kg輸注可降低休克大鼠血漿中ALT和CREA的水平，明顯低于LR組(P＜0.05～0.01)。但LR和PBA輸注對休克后升高的AST和BUN無明顯影響(表1)。

3 PBA對創(chuàng)傷失血性休克大鼠肝、腎和小腸線粒體功能的影響

休克后大鼠的肝、腎、腸線粒體功能均顯著下降。LR復蘇對各器官線粒體功能的改善作用不明顯。PBA 5和20mg/kg可明顯恢復肝線粒體功能，3個劑量的PBA都能明顯升高腎和腸的線粒體功能，其作用顯著高于 LR組(P＜0.01)。其中 PBA 20mg/kg的效果最為明顯，PBA 20mg/kg組大鼠肝、腎、腸線粒體呼吸功能分別恢復至正常水平的88.7%、98.7%和101.0%(表2)。

表1 PBA對創(chuàng)傷失血性休克大鼠肝、腎功能的影響

表2 PBA對創(chuàng)傷失血性休克大鼠肝、腎、腸線粒體功能的影響

討 論

PBA是一種具有多種功能的新型藥物，除了臨床上用于治療尿素循環(huán)障礙和貧血等疾病外，研究顯示PBA在多種疾病過程中能發(fā)揮改善器官功能的作用，包括阿爾茨海默病、帕金森病、糖尿病、動脈粥樣硬化、高血壓及多種缺血缺氧性疾?。?－4，7］。本實驗室前期研究發(fā)現，PBA對創(chuàng)傷失血性休克有很好的治療作用，但它是通過什么途徑發(fā)揮抗休克作用?本實驗對此進行了研究。結果顯示，休克引起了重要生命器官如肝和腎的血流量降低，同時反映肝、腎功能的四項重要指標均顯著升高;PBA(20mg/kg)輸注可恢復休克后降低的肝、腎血流量，并降低肝、腎功能的指標ALT和CREA，提示PBA對肝、腎等重要器官的血流灌注和功能都有較好的改善作用。線粒體是為細胞提供能量的重要細胞器，因此成為休克后缺血缺氧損傷的直接靶點，而線粒體功能紊亂直接影響細胞的功能和生存，最終導致組織器官損傷。本實驗結果表明，休克后大鼠肝、腎、腸的線粒體功能都顯著下降，PBA可明顯改善各器官的線粒體功能，其中20mg/kg的PBA的作用最為顯著，使治療后大鼠的線粒體功能接近正常水平。此外，本實驗結果顯示，PBA 50 mg/kg對血流量和線粒體功能等指標的改善作用低于PBA 20mg/kg，并且 PBA 50mg/kg輸注后肝功能指標ALT和AST并未降低、反而接近或高于休克組水平，提示高劑量的PBA可能增加發(fā)生不良反應的危險。當然，本實驗僅初步觀察到此現象，其可能原因需要更多的實驗來研究。

目前研究顯示，PBA主要通過2條途徑來發(fā)揮其生物學效應。一是作為化學分子伴侶，具有穩(wěn)定蛋白質結構和改善內質網功能的作用;二是具有組蛋白去乙酰化酶抑制劑(histone deacetylase inhibitors，HDACi)的功能［3］。內質網是細胞內維持鈣離子穩(wěn)態(tài)、參與蛋白質合成、加工和運輸的重要細胞器，在細胞代謝、功能發(fā)揮和細胞生存中具有重要作用。在多種病理狀態(tài)下，刺激因素可引起內質網穩(wěn)態(tài)失衡，誘發(fā)內質網應激(endoplasmic reticulum stress，ERS)。大量文獻已證實，內質網應激是多種疾病發(fā)生、發(fā)展的共同的關鍵因素，PBA作為分子伴侶可抑制內質網應激，減輕ERS引起的器官損傷［8］。內質網和線粒體之間存在復雜的結構和功能上的聯系，如內質網應激可誘導活性氧產生和釋放鈣入胞漿中，引起線粒體的膜電位降低和線粒體功能障礙，進一步增加了活性氧的產生，而活性氧可促進內質網釋放鈣，使線粒體內鈣積聚，形成惡性循環(huán)，加重細胞損傷。此外，PBA作為HDACi可參與染色質組蛋白乙?；恼{節(jié)、發(fā)揮對基因表達和細胞凋亡的調控作用，故以往主要關注它的抗腫瘤作用，但近來研究發(fā)現HDACi對多種非腫瘤疾病也有治療作用，如PBA通過其HDAC抑制功能發(fā)揮在亨丁頓病和脊髓性肌肉萎縮癥中的神經細胞保護作用［3，9］。

綜上所述，輸注PBA能夠明顯增加肝、腎等重要器官的血流量、促進線粒體功能恢復、改善重要器官功能，對休克后缺血缺氧損傷有明顯的治療作用。但缺血缺氧損傷可激活多條級聯反應，PBA是如何發(fā)揮改善器官和線粒體功能的作用，其具體機制還需進一步研究。

［1］劉良明.戰(zhàn)創(chuàng)傷休克早期救治研究進展［J］.創(chuàng)傷外科雜志，2013，15(2):100 －103.

［2］Lee B，Rhead W，Diaz GA，et al.Phase 2 comparison of a novel ammonia scavenging agent with sodium phenylbutyrate in patients with urea cycle disorders:safety，pharmacokinetics and ammonia control［J］.Mol Genet Metab，2010，100(3):221 －228.

［3］Mimori S，Ohtaka H，Koshikawa Y，et al.4 － Phenylbutyric acid protects against neuronal cell death by primarily acting as a chemical chaperone rather than histone deacetylase inhibitor［J］.Bioorg Med Chem Lett，2013，23(21):6015 －6018.

［4］Fessler EB，Chibane FL，Wang Z，et al.Potential roles of HDAC inhibitors in mitigating ischemia－induced brain damage and facilitating endogenous regeneration and recovery［J］.Curr Pharm Des，2013，19(28):5105 －5120.

［5］楊光明，李濤，徐競，等.V1a/V2受體在精氨酸血管加壓素恢復失血誘導大鼠血管低反應性中的作用［J］.創(chuàng)傷外科雜志，2008，10(1):47 －50.

［6］Li T，Lin X，Zhu Y，et al.Short－ term，mild hypothermia can increase the beneficial effect of permissive hypotension on uncontrolled hemorrhagic shock in rats［J］.Anesthesiology，2012，116(6):1288 －1298.

［7］Cuadrado － Tejedor M，Ricobaraza AL，Torrijo R，et al.Phenylbutyrate is a multifaceted drug that exerts neuroprotective effects and reverses the Alzheimer＇s disease － like phenotype of a commonly used mouse model［J］.Curr Pharm Des，2013，19(28):5076 －5084.

［8］Mandl J，Mészáros T，Bánhegyi G，et al.Minireview:endoplasmic reticulum stress:control in protein，lipid，and signal homeostasis［J］.Mol Endocrinol，2013，27(3):384 －393.

［9］Wiech NL，Fisher JF，Helquist P，et al.Inhibition of histone deacetylases:a pharmacological approach to the treatment of non － cancer disorders［J］.Curr Top Med Chem，2009，9(3):257－271.