蛇床子素對(duì)機(jī)械性腦損傷小鼠的抗炎抗凋亡作用研究

孔　亮，姚瓔珈，教亞男，李少恒，陶震宇，閆宇輝，楊靜嫻(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院藥理學(xué)教研室，遼寧大連　116600)

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蛇床子素對(duì)機(jī)械性腦損傷小鼠的抗炎抗凋亡作用研究

孔亮，姚瓔珈，教亞男，李少恒，陶震宇，閆宇輝，楊靜嫻
(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院藥理學(xué)教研室，遼寧大連116600)

中國(guó)圖書(shū)分類號(hào): R-332; R284.1; R322.81; R329. 25; R364. 5; R651. 150. 531

摘要:目的研究蛇床子素(osthole，Ost)對(duì)小鼠機(jī)械性腦損傷后細(xì)胞凋亡及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)的影響。方法建立針刺傷小鼠機(jī)械性腦損傷模型，隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、蛇床子素10、20、30 mg·kg－1治療組。主要檢測(cè)各組小鼠腦組織含水量; RT-PCR法檢測(cè)皮層損傷灶凋亡因子Bax，Bcl-2，活化半胱胺酸蛋白酶蛋白-3(Caspase-3)mRNA的表達(dá)變化;免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)損傷灶周圍中性粒細(xì)胞(MPO)及小膠質(zhì)細(xì)胞(Iba-1)浸潤(rùn)情況以及Caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)情況。結(jié)果蛇床子素20，30 mg·kg－1治療組能夠明顯降低腦組織含水量;提高Bax/Bcl-2比值，降低凋亡因子Caspase-3 mRNA表達(dá);蛇床子素30 mg·kg－1治療組能夠明顯減少大腦皮層損傷灶周圍中性粒細(xì)胞及小膠質(zhì)細(xì)胞的浸潤(rùn)，并且明顯減少凋亡細(xì)胞數(shù)量。結(jié)論蛇床子素對(duì)開(kāi)放性腦損傷的小鼠具有一定的治療作用，可能是通過(guò)減少炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，并且減少細(xì)胞凋亡發(fā)揮治療作用。

關(guān)鍵詞:蛇床子素;腦損傷;神經(jīng)功能;腦水腫;炎癥浸潤(rùn);細(xì)胞凋亡

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間:2015－6－5 11:22網(wǎng)絡(luò)出版地址: http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20150605.1122.022.html

楊靜嫻(1963－)，女，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向:神經(jīng)藥理學(xué)，通訊作者，Tel: 0411-87586009; E-mail: jingxianyang@ yahoo.com

機(jī)械性腦損傷是一種常見(jiàn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷性疾病，致死和致殘率非常高。近些年，機(jī)械性腦損傷患者正逐年增加，嚴(yán)重影響患者的工作能力及生活質(zhì)量，給患者及家屬造成嚴(yán)重的精神及經(jīng)濟(jì)壓力。機(jī)械性顱腦損傷的病理過(guò)程包括原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷，原發(fā)性損傷是與外界直接作用導(dǎo)致;繼發(fā)性損傷包括炎癥反應(yīng)、氧自由基的增多和神經(jīng)元壞死凋亡等［1－2］。

近些年，中藥在中樞神經(jīng)系統(tǒng)方面的作用越來(lái)越受到重視，有研究表明，氧化苦參堿能夠減少大鼠缺血性腦損傷后神經(jīng)細(xì)胞凋亡，修復(fù)神經(jīng)功能;山茱萸環(huán)烯醚萜苷能夠抑制大鼠創(chuàng)傷性腦損傷后炎癥因子的釋放，減輕了繼發(fā)性損傷［4］。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)蛇床子素(osthole，Ost)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中具有廣泛的藥理作用，具有抗炎、抗凋亡、抗氧化以及神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)作用［5－7］，但是Ost對(duì)創(chuàng)傷性腦損傷小鼠的抗炎抗凋亡作用，還未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)主要探討Ost對(duì)小鼠腦損傷后炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及細(xì)胞凋亡的影響。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1動(dòng)物昆明種小鼠，購(gòu)于大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào): SCXK(遼): 2008-0002。

1.1.2試劑蛇床子素(中國(guó)藥品檢驗(yàn)所，純度＞98%，批號(hào):110822-200407); DMSO(Sigma公司); RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit(Thermo); PCR Master Mix Kit(Thermo);冰凍切片包埋劑(美國(guó)櫻花);兔抗Caspase-3多克隆抗體、兔MPO多克隆抗體、兔抗Iba-1多克隆抗體(北京博奧森); Cy3標(biāo)記驢抗兔IgG二抗、FITC標(biāo)記羊抗兔IgG二抗(Jackson);抗熒光淬滅劑(碧云天);其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3儀器Ti-S型熒光顯微鏡(日本尼康公司); ST-5ND型腦立體定位儀(成都儀器廠); MG96G型PCR儀(杭州朗基);水平核酸電泳儀(Bio-Rad); 4100型凝膠成像系統(tǒng)(UVP); CM-1850型冰凍切片機(jī)(德國(guó)徠卡)。

1.2方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)分組將40只小鼠(體質(zhì)量30 g±5 g)隨機(jī)分為5組，每組8只，分別為(1)假手術(shù)組(Sham);(2)模型組(SWI);(3)10 mg·kg－1蛇床子素組;(4)20 mg·kg－1蛇床子素組;(5)30 mg· kg－1蛇床子素組。

1.2.2開(kāi)放性腦損傷模型的制備根據(jù)以往文獻(xiàn)報(bào)道的開(kāi)放性腦刺傷模型的制備方法［8］，利用10%烏拉坦對(duì)小鼠腹腔注射麻醉，麻醉起效后，將其固定于腦立體定位儀中，消毒、切開(kāi)頭皮、分離骨膜，確定損傷位點(diǎn):距顱骨中線左側(cè)2 mm、人字縫前2 mm處。利用牙鉆將小鼠顱骨鉆開(kāi)直徑約1. 5 mm的圓孔，但不傷及大腦皮層。利用直徑為1. 3 mm探針垂直插入腦組織中，為了減小誤差，控制腦立體定位儀進(jìn)針手柄，使其進(jìn)針?biāo)俣扰c深度一致，深度為2 mm，停留30 min，然后拔出探針，止血，縫合切口，消毒。將損傷后的小鼠置于鼠籠中，待其蘇醒。假手術(shù)組只鉆孔，不刺傷皮層。損傷1 h后根據(jù)文獻(xiàn)記載的方式采用腹腔注射給藥(藥物濃度為1 g· L－1)［6］，每天1次; Sham組給予等量含DMSO(＜0. 1%)的蒸餾水，最后1次注射后4 h后處死小鼠，取腦。包埋，置于－20℃冰凍切片機(jī)中做連續(xù)冠狀切片，片厚8 μm。

1.2.3針刺傷開(kāi)放性腦損傷模型評(píng)價(jià)方法利用神經(jīng)功能缺損評(píng)分(neurological severity scores，NSS)對(duì)造模方法進(jìn)行評(píng)價(jià)［9］，NSS評(píng)分包括了力量、運(yùn)動(dòng)、感知及平衡能力測(cè)評(píng)，NSS評(píng)分包含了評(píng)分大于6說(shuō)明腦損傷模型制作成功。

1.2.4腦組織含水量的檢測(cè)取損傷后3 d的小鼠，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的腦組織含水量的檢測(cè)方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)［10－11］，將各組小鼠麻醉后取腦，將取好的腦組織沿中線分為兩部分，取損傷側(cè)腦組織置于錫箔紙上測(cè)量其重量(濕重)，將其置于烘箱中100℃24 h后測(cè)量重量(干重)。

腦組織含水量/% =(濕重－干重)/濕重×100%

1.2.5逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測(cè)凋亡相關(guān)基因表達(dá)情況取蛇床子素治療7 d后各組小鼠腦組織，TRIzol法提取各組細(xì)胞總RNA，取各組總RNA 3μg，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)合成cDNA［12］。取2 μL cDNA為模板，按照RT-PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行體外擴(kuò)增，DNA引物由北京賽諾科為生物科技有限公司合成，序列為內(nèi)參β-actin上游引物: 5'-GGGAAATCGTGCGTGACAT-3';下游引物: 5'-TCAGGAGGAGCAATGATCTTG-3'，Bcl-2上游引物: 5'-CGCTGGGAGAACAGGGTA-3';下游引物: 5'-GGGCTGGGAGGAGAAGAT-3'，Bax上游引物: 5'-CTGACATGTTTTCTGACGGC-3';下游引物: 5'-TCAGCCCATCTTCTTCCAGA-3'; Caspase-3上游引物: 5'-AGATACCGGTGGAGGCTGACT-3';下游引物: 5'-TCTTTCGTGAGCATGGACACA-3'。瓊脂凝膠電泳，凝膠成像儀拍照，Image J圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析。結(jié)果用相對(duì)光密度表示，相對(duì)光密度=光密度目的基因/光密度β-actin。

1.2.6免疫組織化學(xué)染色方法利用免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)MPO、Iba-1、Caspase-3細(xì)胞表達(dá)情況。將8 μm厚腦冰凍冠狀切片置于室溫晾干，PBS 洗; 4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗×3次; 1% Triton X-100透化30 min，PBS洗×3次;5% BSA封閉30 min;兔抗MPO、Iba-1、Caspase-3多克隆抗體(1∶150)4℃孵育過(guò)夜，次日滴加Cy3標(biāo)記驢抗兔、FITC標(biāo)記羊抗兔二抗(1∶300)室溫孵育1 h，DAPI染核15 min，滴加少量抗熒光淬滅劑，蓋玻片封片，置于熒光顯微鏡下觀察各組MPO、Iba-1、Caspase-3細(xì)胞的表達(dá)變化。

1.2.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 13. 0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以±s表示，對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析和t檢驗(yàn)。

Tab 1　Comparison of neurologic severity score(NSS)in each group of mice

2　結(jié)果

2.1小鼠機(jī)械性腦損傷模型評(píng)價(jià)各組小鼠清醒后，分別于損傷后12 h進(jìn)行NSS評(píng)分檢測(cè)，假手術(shù)組各只小鼠NSS評(píng)分少許增加，說(shuō)明假手術(shù)對(duì)小鼠造成了輕微的神經(jīng)損傷，其余各組小鼠清醒后均出現(xiàn)了不能行走或者偏癱、感知反射等能力喪失的現(xiàn)象，其余各組與假手術(shù)組相比，NSS評(píng)分明顯增加，見(jiàn)表1(P ＜0. 01)，并且各組NSS評(píng)分均大于6，說(shuō)明機(jī)械性腦損傷模型制備成功，能夠用于以后的實(shí)驗(yàn)。

2.2腦組織含水量為了驗(yàn)證不同劑量的蛇床子素能否降低腦組織含水量，減輕水腫程度，我們于損傷后3 d進(jìn)行了腦組織含水量的測(cè)定。結(jié)果顯示，SWI組與Sham組相比，腦組織含水量明顯增加(P＜0. 01)，20 mg·kg－1與30 mg·kg－1蛇床子素組腦組織含水量與SWI組相比，均能夠降低腦組織含水量，減少水腫，且差異具有顯著性(P＜0.05，P＜0. 01); 20 mg·kg－1與30 mg·kg－1蛇床子素組差異并沒(méi)有顯著性(P＞0. 05)。而10 mg·kg－1蛇床子素組則無(wú)明顯作用(P＞0. 05)。Sham組、SWI組、10、20、30 mg ·kg－1Ost組腦組織含水量分別為:(67. 36± 1. 39)%、(85. 27±2. 92)%、(80. 18±1. 85)%、(75. 89±1. 30)%、(74. 86±2. 87)%，見(jiàn)Fig 1。

Fig 1　Effect on brain water content with Ost treatment##P＜0. 01 vs sham group;*P＜0.05，＊＊P＜0. 01 vs SWI group

2.3 Bax、Bcl-2、caspase-3 mRNA表達(dá)我們于損傷后7 d進(jìn)行了RT-PCR實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)蛇床子素對(duì)腦組織損傷后凋亡的影響，結(jié)果顯示，SWI組與Sham組相比，凋亡因子Bax/Bcl-2 mRNA比率，caspase-3 mRNA表達(dá)量明顯增加(P＜0. 01)，20與30 mg·kg－1蛇床子素組與SWI組相比，均能夠降低Bax/Bcl-2 mRNA比率，caspase-3 mRNA表達(dá)量且差異具有顯著性(P ＜0. 05，P＜0. 01);20與30 mg·kg－1蛇床子素組并沒(méi)有顯著性差異(P＞0. 05)。而10 mg·kg－1蛇床子素組則無(wú)明顯作用(P＞0. 05)。Sham組、SWI組、10、20、30 mg·kg－1Ost組Bax/Bcl-2 mRNA比率分別為:(0. 34±0. 10)%、(1. 64±0. 20)%、(1. 26± 0. 12)%、(0. 78±0. 19)%、(0. 62±0. 18)%; Sham組、SWI組、10、20、30 mg·kg－1Ost組caspase-3 mRNA表達(dá)量分別為:(0. 24±0. 04)%、(0. 53± 0. 06)%、(0. 41±0. 06)%、(0. 35±0. 05)%、(0. 31± 0. 03)%，見(jiàn)Fig 2。

2.4 caspase-3表達(dá)情況我們于損傷后7 d利用免疫組織化學(xué)染色法，測(cè)定caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量，研究蛇床子素對(duì)機(jī)械性腦損傷小鼠的抗凋亡作用。結(jié)果顯示，SWI組與Sham組相比，caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量明顯增加(P＜0. 01)，30 mg·kg－1蛇床子素組與SWI組相比，能夠明顯降低caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量(P＜0.05)。Sham，SWI，30 mg·kg－1Ost組腦組織含水量分別為:(19.67±4.16)cells/mm2，(115.33± 17.21)cells/mm2，(64.00±4.58)cells/mm2，見(jiàn)圖3。

Fig 2　Effect of osthole on apoptotic cytokines mRNA in injuryed mice brains1: Sham; 2: SWI; 3: Ost 10 mg·kg－1; 4: Ost 20 mg·kg－1; 5: Ost 30 mg·kg－1.##P＜0. 01 vs sham group;*P＜0. 05，＊＊P＜0. 01 vs SWI group

Fig 3　Effect on apoptotic cytokine caspase-3 with Ost treatment##P＜0. 01 vs sham group;＊＊P＜0.01 vs SWI group

2.5 MPO及Iba-1表達(dá)情況為了研究蛇床子素是否能夠減輕腦損傷后傷口周圍炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)現(xiàn)象，我們于損傷后3 d利用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)了損傷皮層中性粒細(xì)胞(MPO)，小膠質(zhì)細(xì)胞(Iba-1)陽(yáng)性細(xì)胞的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，未損傷組MPO，Iba-1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量非常少，而SWI組與Sham組相比，MPO明顯增加(P＜0. 01)，30 mg· kg－1蛇床子素組與SWI組相比，能夠明顯減輕中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)情況，差異具有顯著性(P＜0. 01)。Sham組、SWI組、30 mg·kg－1Ost組MPO細(xì)胞數(shù)量分別為:(18. 83±6. 37)cells·mm－2、(290. 67± 34. 89)cells·mm－2、(176. 00±39. 48)cells· mm－2。損傷后Iba-1數(shù)量也明顯增加(P＜0. 01)，經(jīng)30 mg·kg－1蛇床子素治療后其數(shù)量明顯降低(P ＜0. 01)。Sham組、SWI組、30 mg·kg－1Ost組Iba-1細(xì)胞數(shù)量分別為:(34. 67±10. 78)cells·mm－2、(247. 83±52. 29)cells·mm－2、(115. 33±47. 96)cells·mm－2，見(jiàn)圖4。

3　討論

蛇床子素是獨(dú)活和蛇床子等中藥的主要活性成分，屬于香豆素類化合物［13］。具有神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)作用的中藥單體蛇床子素能夠保護(hù)由Aβ?lián)p傷的大腦皮層神經(jīng)元;在實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎動(dòng)物模型中，蛇床子素能夠通過(guò)改善病處微環(huán)境，促進(jìn)外源性NSCs存活與分化，促進(jìn)髓鞘與軸突再生，并發(fā)揮神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)等作用［14－15］。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立小鼠開(kāi)放性腦刺傷模型，我們證實(shí)了這種模型制備方法能夠造成小鼠神經(jīng)功能的損傷，能夠用于實(shí)驗(yàn)。血腦屏障被破壞，腦內(nèi)含水量升高，繼而導(dǎo)致腦水腫［16］，本實(shí)驗(yàn)證明20、30 mg·kg－1蛇床子素能夠減輕損傷后腦組織含水量，有利于水腫的消除和血腦屏障的恢復(fù)。

細(xì)胞凋亡主要是線粒體損傷，導(dǎo)致線粒體功能改變或喪失，激活caspase凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致凋亡［17］。Bcl-2家族基因是細(xì)胞內(nèi)一種重要的抗凋亡因子，凋亡發(fā)生過(guò)程中，Bcl-2表達(dá)降低; Bax則是Bcl-2家族中一種促凋亡因子，Bcl-2和Bax基因可以形成二聚體，當(dāng)Bcl-2表達(dá)量多時(shí)抑制細(xì)胞凋亡，當(dāng)Bax表達(dá)多時(shí)促進(jìn)細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)20、30 mg·kg－1蛇床子素能夠降低損傷后腦組織內(nèi)Bax/Bcl-2的比率及caspase-3 mRNA的表達(dá)，并且30 mg ·kg－1蛇床子素能夠減少caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量，因此蛇床子素能夠抑制損傷后神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。

腦損傷導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)可能會(huì)引起并加重繼發(fā)性腦損傷，如中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)會(huì)導(dǎo)致腦水腫，形成惡性循環(huán)［18］。中性粒細(xì)胞及小膠質(zhì)細(xì)胞是腦損傷發(fā)生后比較常見(jiàn)的炎癥細(xì)胞，所以本實(shí)驗(yàn)利用免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)了腦內(nèi)MPO、Iba-1的表達(dá)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，腦損傷后腦內(nèi)MPO、Iba-1的表達(dá)量明顯增多，當(dāng)給予蛇床子素后腦內(nèi)MPO、Iba-1的表達(dá)量明顯減少，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象減輕。這充分說(shuō)明了蛇床子素對(duì)炎癥反應(yīng)的抑制作用，也進(jìn)一步證明了蛇床子素通過(guò)減輕炎癥因子和炎癥反應(yīng)而減輕腦損傷程度。

綜上所述，蛇床子素可以減輕小鼠機(jī)械性腦損傷，并且證實(shí)蛇床子素發(fā)揮的治療作用是通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡，抑制炎癥細(xì)胞，減輕炎癥反應(yīng)，發(fā)揮治療作用。為有效修復(fù)治療腦損傷等神經(jīng)系統(tǒng)難治性疾病開(kāi)辟新的思路與途徑，具有廣闊的臨床應(yīng)用前景和重大的社會(huì)經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

(以上實(shí)驗(yàn)內(nèi)容在遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院藥理實(shí)驗(yàn)室完成)。

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Anti-apoptosis and anti-inflammatory effect of osthole in mice following stab wound injury

KONG Liang，YAO Ying-jia，JIAO Ya-nan，LI Shao-heng，TAO Zhen-yu，YAN Yu-hui，YANG Jing-xian
(Dept of Pharmacology，School of Pharmacy，Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Dalian Liaoning 116600，China)

Abstract:Aim To investigate the effects of osthol on cell apoptosis and inflammatory cell infiltration after brain stab wound injury in mice.Methods The mice underwent the stab wound injury by a needle，thenwere randomly divided into sham operation group，model group，osthol 10，20，30 mg·kg－1treatment group.The main examinations included mice brain water content; the apoptotic cytokines Bax，Bcl-2，Caspase-3 mRNA expression were assessed by PTPCR; immunohistochemistry staining was used to detect neutrophils(MPO)and microglia(Iba-1)infiltration and Caspase-3 positive cell expression around injured lesions.Results Treatment with osthole 20，30 mg·kg-1group significantly reduced the water content in injured brain，improved the ratio of Bax/Bcl-2，and reduced the expression of apoptosis cytokine Caspase-3 mRNA.Osthole 30 mg·kg－1treatment group obviously reduced the infiltration of neutrophils and microglial cells and significantly reduced the number of apoptotic cells around the injured cerebral cortex.Conclusion Osthole has therapeutic effect on stab wound injury in mice，and the possible mechanism may be by reducing the infiltration of inflammatory cells and reducing apoptotic cells.

Key words:osthole; stab wound injury; neural function; brain edema; inflammatory infiltration; cell apoptosis

作者簡(jiǎn)介:孔亮(1990－)，男，碩士生，研究方向:中藥神經(jīng)藥理學(xué)，E-mail: 13998418026@163.com;

基金項(xiàng)目:國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(No 81173580)

收稿日期:2015－03－02，修回日期:2015－04－01

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號(hào):1001－1978(2015)07－0999－06

doi:10.3969/j.issn.1001－1978.2015.07.022