淫羊藿苷預(yù)防給藥對(duì)快速老化小鼠SAMP8學(xué)習(xí)記憶能力及腦組織線粒體氧化應(yīng)激的影響

張曉菲，路　暢，賀曉麗，畢明剛(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所藥理毒理中心，北京　100193)

?

淫羊藿苷預(yù)防給藥對(duì)快速老化小鼠SAMP8學(xué)習(xí)記憶能力及腦組織線粒體氧化應(yīng)激的影響

張曉菲，路暢，賀曉麗，畢明剛
(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所藥理毒理中心，北京100193)

中國(guó)圖書(shū)分類(lèi)號(hào): R-332; R284.1; R322.81; R338. 64; R339. 38; R977. 12

摘要:目的考察淫羊藿苷(icariin，ICA)預(yù)防給藥對(duì)快速老化小鼠SAMP8學(xué)習(xí)記憶能力及腦組織線粒體氧化應(yīng)激的影響。方法選擇即將出現(xiàn)學(xué)習(xí)記憶障礙的6月齡快速老化小鼠SAMP8為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，隨機(jī)分為模型組、ICA組(75，150 mg·kg－1)、陽(yáng)性藥己烯雌酚組和雌激素受體抑制劑ICI182780聯(lián)合ICA高劑量(150 mg·kg－1)組，以同月齡抗快速老化小鼠SAMR1為正常對(duì)照。預(yù)先灌胃給藥8周，用Morris水迷宮和跳臺(tái)行為學(xué)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)ICA預(yù)防給藥對(duì)SAMP8小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響。提取腦線粒體，通過(guò)測(cè)定腦組織線粒體內(nèi)活性氧(ROS)水平、脂質(zhì)過(guò)氧化物(MDA)含量、還原性谷胱甘肽GSH含量和過(guò)氧化氫酶(CAT)的活力，研究ICA預(yù)防給藥對(duì)SAMP8小鼠腦組織線粒體氧化應(yīng)激的影響。結(jié)果ICA預(yù)防給藥可以明顯改善SAMP8小鼠的定位航行能力以及空間探索能力，提高其在跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)中的被動(dòng)回避條件反射能力，減少SAMP8小鼠腦組織線粒體ROS水平和MDA含量，增加GSH含量，但對(duì)CAT活性作用不明顯。ICA和ICI182780聯(lián)合給藥后，與ICA單獨(dú)給藥組相比，ICA對(duì)SAMP8小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的改善作用明顯降低，對(duì)腦組織線粒體氧化應(yīng)激的改善作用變化不大。結(jié)論ICA預(yù)防給藥可明顯改善快速老化小鼠SAMP8學(xué)習(xí)記憶能力及腦組織線粒體氧化應(yīng)激的水平，其改善學(xué)習(xí)記憶能力的作用機(jī)制可能與其植物雌激素樣作用有關(guān)，其對(duì)腦組織線粒體發(fā)揮抗氧化應(yīng)激的作用可能與雌激素受體無(wú)關(guān)。

關(guān)鍵詞:淫羊藿苷;快速老化小鼠;學(xué)習(xí)記憶;線粒體;氧化應(yīng)

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間:2015－6－5 11:22網(wǎng)絡(luò)出版地址: http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20150605.1122.008.html

賀曉麗(1982－)，女，博士，副研究員，研究方向:神經(jīng)藥理學(xué)和抗腫瘤藥理學(xué)，共同通訊作者，E-mail: xlhe@ implad.ac.cn;

畢明剛(1970－)，男，博士，研究員，博士生導(dǎo)師，研究方向:神經(jīng)藥理學(xué)和抗腫瘤藥理學(xué)，通訊作者，E-mail: mgbi @ implad.ac.cn激;雌激素樣作用;雌激素受體抑制劑

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是以漸進(jìn)性認(rèn)知功能障礙為主要臨床表現(xiàn)的神經(jīng)退行性疾病，其發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，迄今為止尚不明確。流行病學(xué)研究表明，絕經(jīng)女性AD的發(fā)病率明顯高于同齡男性1. 5～3. 0倍［1］。線粒體是真核生物細(xì)胞的重要細(xì)胞器，是細(xì)胞的產(chǎn)能中心、代謝中心和凋亡中心。近年來(lái)，AD病人線粒體功能的異常逐漸被人們所重視。AD中的氧化應(yīng)激損傷、能量代謝缺陷以及鈣離子穩(wěn)態(tài)失衡等都與線粒體密切相關(guān)。

淫羊藿苷(icaritin，ICA)為小檗科淫羊?qū)僦参镆蜣降闹饕钚猿煞?，具有雌激素樣作用?］。本課題組前期研究表明，ICA可明顯改善增齡SAMP8小鼠和去卵巢SAMP8小鼠定位航行和空間搜索學(xué)習(xí)記憶障礙，明顯提高去卵巢SAMP8小鼠大腦皮層的抗氧化能力;并且ICA改善SAMP8學(xué)習(xí)記憶功能與升高血清E2水平有關(guān)［3－5］。在此基礎(chǔ)上，本文選擇即將出現(xiàn)學(xué)習(xí)記憶障礙的6月齡SAMP8小鼠為模型鼠，以同月齡SAMR1為正常對(duì)照，預(yù)先給予已確證具有雌激素樣生物活性的淫羊藿苷，以雌激素受體拮抗劑為工具藥，進(jìn)一步探討淫羊藿苷預(yù)防給藥對(duì)快速老化小鼠SAMP8學(xué)習(xí)記憶能力及腦線粒體氧化應(yīng)激的影響。

1　材料

1.1動(dòng)物SAMP8小鼠及其正常對(duì)照SAMR1小鼠由中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所陳清軒教授惠贈(zèng)，在本所SPF級(jí)動(dòng)物房飼養(yǎng)繁殖。本實(shí)驗(yàn)選擇6月齡♀小鼠用于實(shí)驗(yàn)。

1.2藥品與試劑ICA(純度＞98%)購(gòu)于南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司，雌激素受體抑制劑ICI182780購(gòu)于英國(guó)Tocris公司，己烯雌酚(diethylstibestrol，DES)購(gòu)于大連美侖生物技術(shù)有限公司，考馬斯亮藍(lán)蛋白定量試劑盒為北京普利萊基因技術(shù)有限公司產(chǎn)品，活性氧(ROS)檢測(cè)試劑盒購(gòu)于碧云天生物技術(shù)有限公司，丙二醛(MDA)、微量還原型谷胱甘肽(GSH)、過(guò)氧化氫酶(CAT)測(cè)試盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.3儀器Morris水迷宮和小鼠跳臺(tái)儀STT-2均由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所研制，高速冷凍臺(tái)式離心機(jī)(Sorvall ST-16R)由德國(guó)Thermo公司生產(chǎn)，酶標(biāo)儀由美國(guó)BIOTEK公司生產(chǎn)，EPS-1201型便攜式電子天平由長(zhǎng)沙湘平科技發(fā)展有限公司生產(chǎn)。

2　方法

2.1動(dòng)物分組及給藥將6月齡♀SAMP8小鼠按體重隨機(jī)分為5組，分別為模型組、ICA組(75，150 mg·kg－1)、陽(yáng)性藥己烯雌酚DES組(0. 2 mg· kg－1)和雌激素受體抑制劑聯(lián)合ICA高劑量(150 mg·kg－1)組，每組8只。以同月齡♀SAMR1小鼠為正常對(duì)照。雌激素受體抑制聯(lián)合ICA高劑量組腹腔注射雌激素受體抑制劑ICI182780(1 mg· kg－1)1 h后灌胃給予ICA(150 mg·kg－1)，SAMP8模型組和SAMR1組對(duì)照組給同體積生理鹽水。灌胃給藥，每天給藥1次，連續(xù)給藥8周，分別在給藥前和給藥8周后進(jìn)行行為學(xué)實(shí)驗(yàn)。

2.2 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)［6］Morris水迷宮主要由一金屬圓柱形水池(池高60 cm，直徑120 cm)和自動(dòng)顯示、監(jiān)測(cè)、記錄裝置及安全島(直徑10 cm的平臺(tái))組成。預(yù)先在水迷宮內(nèi)注入清水，使水高出平臺(tái)1 cm，水溫控制在(23±2)℃，在水池邊緣上等距離設(shè)置4個(gè)標(biāo)記點(diǎn)，將水池均分為4個(gè)象限，將平臺(tái)置于第一象限。定位航行實(shí)驗(yàn)(place navigation test)中，每只動(dòng)物每天訓(xùn)練1次，持續(xù)進(jìn)行5 d。訓(xùn)練時(shí)將動(dòng)物面朝池壁輕輕放入水中，同時(shí)啟動(dòng)記錄裝置，電腦自動(dòng)記錄小鼠找到平臺(tái)的潛伏期。如果小鼠在入水后2 min內(nèi)沒(méi)有找到平臺(tái)，需要實(shí)驗(yàn)者將其引領(lǐng)于平臺(tái)上放置20 s，引導(dǎo)其學(xué)習(xí)。

空間搜索實(shí)驗(yàn)(spatial probe test)在定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)束后進(jìn)行，撤去第一象限的平臺(tái)，從相同的入水點(diǎn)將小鼠面向池壁放入水中，測(cè)定其在120 s內(nèi)穿越平臺(tái)的次數(shù)、平臺(tái)所在象限停留時(shí)間和第1次穿越平臺(tái)的時(shí)間。

2.3跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)［6］小鼠跳臺(tái)測(cè)試箱由5個(gè)小隔間組成，一次可同時(shí)測(cè)試5只動(dòng)物，隔間內(nèi)有1個(gè)橡膠平臺(tái)，底部銅柵可通電。d 1訓(xùn)練時(shí)，將小鼠在隔間內(nèi)適應(yīng)2 min，通電3 min，小鼠被電擊時(shí)跳上平臺(tái)，24 h后，將小鼠頭朝角落放置平臺(tái)上，秒表記錄小鼠第1次跳到電柵上受到電擊的時(shí)間記為潛伏期，觀察小鼠在5 min內(nèi)跳下平臺(tái)的次數(shù)記為錯(cuò)誤次數(shù)。

2.4腦線粒體的分離參照本實(shí)驗(yàn)室建立的方法［7］，采用差速離心的方法制備腦線粒體。水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，斷頭處死小鼠，迅速在冰盤(pán)上取出腦組織，去除小腦和腦干。置于預(yù)冷的小燒杯中，用冰冷的分離緩沖液沖洗3次，剝?nèi)パ埽コ傺?，用小剪刀將腦組織剪成碎塊。將腦組織轉(zhuǎn)入玻璃勻漿器中，每克腦組織按照1∶10比例加入分離緩沖液(250 mmol·L－1蔗糖，10 mmol·L－1Tris-HCl，1 mmol·L－1EDTA，0. 2% BSA，pH 7. 4)，冰浴中手動(dòng)勻漿10次。所得勻漿液以700×g離心10 min，取上清液以10 000×g離心10 min，所得沉淀即為線粒體。以分離緩沖液將所得沉淀洗滌一次(離心10 000×g，10 min)。將線粒體沉淀懸于分離緩沖液中，調(diào)整蛋白濃度為20～25 g·L－1。整個(gè)線粒體制備過(guò)程均在4℃進(jìn)行。腦線粒體蛋白濃度測(cè)定采用Bradford法。

2.5腦組織線粒體內(nèi)氧化應(yīng)激水平的測(cè)定通過(guò)測(cè)定腦組織線粒體內(nèi)活性氧(ROS)水平、脂質(zhì)過(guò)氧化物(MDA)含量、還原性谷胱甘肽(GSH)含量和過(guò)氧化氫酶(CAT)的活力來(lái)反映SAMP8小鼠腦線粒體氧化應(yīng)激的變化。將分離得到的線粒體，－80℃冷藏待用。測(cè)定時(shí)，各指標(biāo)均按試劑盒說(shuō)明書(shū)方法操作。

3　結(jié)果

3.1 ICA預(yù)防給藥對(duì)SAMP8小鼠空間辨別學(xué)習(xí)記憶能力的影響Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)是一種在行為神經(jīng)科學(xué)中測(cè)定小動(dòng)物空間定向和學(xué)習(xí)記憶的經(jīng)典研究方法，可反映動(dòng)物的空間辨別學(xué)習(xí)記憶能力。給藥前對(duì)各組動(dòng)物進(jìn)行的Morris水迷宮的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)過(guò)5 d的訓(xùn)練，各組小鼠的潛伏期均表現(xiàn)出縮短的趨勢(shì)，然而各組小鼠的潛伏期、目標(biāo)象限的停留時(shí)間、目標(biāo)象限的穿越次數(shù)和第1次到達(dá)平臺(tái)的時(shí)間均沒(méi)有變化(P＞0. 05)，說(shuō)明6月齡SAMP8小鼠未出現(xiàn)明顯的學(xué)習(xí)記憶障礙。結(jié)果見(jiàn)Tab 1和Fig 1。

給藥8周后，Morris水迷宮結(jié)果顯示，定位航行實(shí)驗(yàn)中，隨著訓(xùn)練次數(shù)和實(shí)驗(yàn)天數(shù)的增加，各實(shí)驗(yàn)組小鼠潛伏期均表現(xiàn)為縮短趨勢(shì)。d 1，各組動(dòng)物差異無(wú)顯著性;自實(shí)驗(yàn)d 2開(kāi)始，與SAMR1組小鼠相比，SAMP8組小鼠逃避潛伏期明顯延長(zhǎng)(P＜0. 05，P＜0. 01)，各給藥組小鼠與SAMP8組小鼠相比潛伏期明顯縮短(P＜0. 05，P＜0. 01)。實(shí)驗(yàn)d 5，雌激素受體抑制劑聯(lián)合ICA高劑量組(ICI-ICA)小鼠與ICA高劑量組(ICA-H)小鼠相比，潛伏期明顯延長(zhǎng)(P＜0. 05)。見(jiàn)Tab 2。

Tab 1　Place navigation test in SAMP8 mice before icariin administration(±s，n =8)

Tab 1　Place navigation test in SAMP8 mice before icariin administration(±s，n =8)

Group Escape latency/s day 1　day 2　day 3　day 4　day 5 SAMR1　89.46±10.82　50.32±24.84　42.62±17.63　34.2±17.76　28.59±14.28 SAMP8　83.16±16.45　59.91±17.38　50.45±11.74　36.88±18.19　26.45±15.55 DES　77.48±14.36　57.75±17.50　47.23±14.64　26.75±11.37　21.15±12.64 ICA-L　78.28±13.09　51.32±16.88　43.34±13.74　29.62±16.15　25.37±15.10 ICA-H　75.36±13.92　46.12±17.39　38.35±17.09　25.53±18.41　24.54±14.10 ICI-ICA　80.15±19.83　50.53±22.03　39.64±20.8538.02±14.78　26.29±10.54

Fig 1　Spatial probe test in SAMP8 mice before icariin administration(±s，n =8)A: Time in target quadrant; B: Crossing times; C: The first time through platform.

Tab 2　Effect of preventive administration of icariin on place navigation test in SAMP8 mice after 8 weeks(±s，n =8)

Tab 2　Effect of preventive administration of icariin on place navigation test in SAMP8 mice after 8 weeks(±s，n =8)

Group Escape latency/s day 1　day 2　day 3　day 4　day 5 SAMR1　57.33±10.28　36.70±17.61　25.78±10.58　24.02±9.11　26.13±8.32 SAMP8　62.13±11.76　57.30±15.83#　48.66±17.18##　46.16±10.16##　44.92±8.91##DES　61.75±12.24　32.96±9.87*　22.04±12.21＊＊　28.59±9.75＊＊　17.30±5.67＊＊ICA-L　60.84±13.67　39.87±13.22*　31.41±9.98*　28.41±7.76*　30.38±8.07*ICA-H　61.41±14.15　41.60±19.17*　37.91±8.70　32.82±7.15*　16.57±6.38＊＊ICI-ICA　56.71±11.24　45.78±10.54　32.75±11.89　33.67±10.60*　33.11±11.10＊★#P＜0.05，##P＜0.01 vs SAMR1 group;*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs SAMP8 group，★P＜0. 05 vs ICA-H group.

Fig 2　Effect of preventive administration of icariin on spatial probe test in SAMP8 mice after 8 weeks(±s，n =8)A: Time in target quadrant; B: Crossing times; C: The first time through platform.#P＜0.05 vs SAMR1 group，*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs SAMP8 group;★P＜0.05，★★P＜0.01 compared with ICA-H group.

在空間探索實(shí)驗(yàn)中，與SAMR1組小鼠相比，SAMP8組小鼠的空間搜索能力下降，表現(xiàn)為在目標(biāo)象限的停留時(shí)間縮短，穿越平臺(tái)的次數(shù)明顯減少(P ＜0. 05)，第1次穿越平臺(tái)的時(shí)間明顯延長(zhǎng)(P＜0. 05)。ICA低、高劑量組給藥8周后，可不同程度的提高SAMP8小鼠在Morris水迷宮中的空間探索能力(P＜0. 05，P＜0. 01)。雌激素受體抑制劑聯(lián)合ICA高劑量組(ICI-ICA)小鼠與ICA高劑量組(ICAH)小鼠相比，穿越平臺(tái)的次數(shù)減少(P＜0. 05)，第1次穿越平臺(tái)的時(shí)間明顯增加(P＜0. 01)，說(shuō)明ICA改善SAMP8小鼠空間辨別學(xué)習(xí)記憶能力可能與其植物雌激素樣作用有關(guān)。見(jiàn)Fig 2。3.2 ICA預(yù)防給藥對(duì)SAMP8小鼠被動(dòng)回避條件反射能力的影響跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)是利用鼠類(lèi)好探索習(xí)性而設(shè)計(jì)，屬于被動(dòng)回避性條件反射。與SAMR1組小鼠相比，SAMP8組小鼠跳下平臺(tái)的次數(shù)明顯增多(P＜0. 05)。與SAMP8組小鼠相比，灌胃給予DES 和ICA后，均可明顯減少SAMP8小鼠受到電擊的錯(cuò)誤次數(shù)(P＜0. 05，P＜0. 01)，明顯延長(zhǎng)第1次跳下平臺(tái)的時(shí)間(P＜0. 05)。雌激素受體抑制劑聯(lián)合ICA高劑量組(ICI-ICA)小鼠與ICA高劑量組(ICAH)小鼠相比，受到電擊的錯(cuò)誤次數(shù)增加，第1次跳下平臺(tái)的時(shí)間明顯縮短(P＜0. 01)，同樣說(shuō)明ICA改善SAMP8小鼠被動(dòng)回避條件反射能力可能與其植物雌激素樣作用有關(guān)。見(jiàn)Fig 3。

Fig 3　Effect of preventive administration of icariin on step-down passive test in SAMP8 mice after 8 weeks(±s，n =8)#P＜0.05 vs SAMR1 group;*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs SAMP8 group;★★P＜0.01 vs ICA-H group.

3.3 ICA預(yù)防給藥對(duì)SAMP8小鼠腦組織線粒體氧化應(yīng)激水平的影響通過(guò)測(cè)定腦組織線粒體內(nèi)活性氧(ROS)水平、脂質(zhì)過(guò)氧化物(MDA)含量、還原性谷胱甘肽GSH含量和過(guò)氧化氫酶(CAT)的活力來(lái)反映SAMP8小鼠腦線粒體氧化應(yīng)激的變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與SAMP8組小鼠相比，各給藥組小鼠腦線粒體內(nèi)活性氧水平和MDA含量明顯降低(P＜ 0. 05，P＜0. 01)，尤其ICA高劑量組能非常明顯的降低SAMP8小鼠腦組織線粒體活性氧水平(P＜0. 01)。與SAMP8組小鼠相比，各給藥組小鼠腦線粒體內(nèi)GSH含量均升高，其中DES組可以明顯提高SAMP8鼠腦線粒體內(nèi)GSH含量(P＜0. 05)，ICA低、高劑量對(duì)腦組織線粒體GSH含量的影響不大。各實(shí)驗(yàn)組小鼠腦組織線粒體CAT活性差異均無(wú)顯著性(P＞0. 05)。見(jiàn)Tab 3。

Tab 3　Preventive administration of icariin decreased ROS，MDA levels but increased GSH content in brain mitochondria of SAMP8 mice after 8 weeks(±s，n =5)

Tab 3　Preventive administration of icariin decreased ROS，MDA levels but increased GSH content in brain mitochondria of SAMP8 mice after 8 weeks(±s，n =5)

#P＜0. 05 vs SAMR1 group;*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs SAMP8 group.

ROS/MDA/GSH/CAT/Group　fluorescence intensityμmol·g－1Proμmol·g－1ProkU·g－1Pro SAMR1　2417±219.2 　4.75±1.18 　4.13±1.45 　21.08±0.29 SAMP8　2872±197.3 　6.49±0.35#　1.95±0.62#　20.51±0.43 DES　2271±492.4*　4.30±1.32*　3.97±1.64*　21.05±0.58 ICA-L　2297±539.5*　4.76±1.15*　2.60±0.45 　21.20±0.43 ICA-H　1821±228.0＊＊　4.59±1.83*　2.62±0.44 　21.13±0.54 ICI-ICA　2202±338.5*　4.81±1.03*2.50±0.63 　20.71±0.56

4　討論

隨著老齡化社會(huì)的來(lái)臨，AD的防治與治療已成為當(dāng)今社會(huì)研究的熱點(diǎn)。目前AD治療的一線藥物多是通過(guò)增強(qiáng)膽堿能系統(tǒng)功能而改善患者的認(rèn)知和記憶障礙膽堿酯酶抑制劑［8］，如多奈哌齊、石杉?jí)A甲等［9］。淫羊藿苷為淫羊藿的主要活性成分，最近有研究報(bào)道ICA體內(nèi)代謝產(chǎn)物淫羊藿素(icaritin，ICT)體外試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)對(duì)β淀粉樣蛋白誘導(dǎo)的大鼠原代神經(jīng)元細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用［10］;體內(nèi)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，ICA可通過(guò)其抗氧化活性和減少海馬中Aβ1－40的含量的作用，改善鋁中毒誘導(dǎo)的大鼠學(xué)習(xí)記憶障礙［11］。淫羊藿黃酮和ICA還可以明顯縮短APP轉(zhuǎn)基因小鼠在Morris水迷宮的潛伏期和游泳距離提高其在物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)中的分辨指數(shù)等［12］，提示ICA可能成為潛在的治療老年癡呆的候選藥物?？焖倮匣Ｐ托∈骃AMP8是目前公認(rèn)的有效的研究老年癡呆的動(dòng)物模型，其行為學(xué)表現(xiàn)和病理學(xué)特征與人類(lèi)AD的臨床癥狀及其復(fù)雜的神經(jīng)系統(tǒng)病理學(xué)改變十分相似，在渡過(guò)生長(zhǎng)期后(4－6月)，伴快速老化自然發(fā)生，出現(xiàn)早期增齡性學(xué)習(xí)記憶缺陷，腦內(nèi)具有多種與AD類(lèi)似的病理變化及生化代謝異常［13］。結(jié)合本課題組前期研究基礎(chǔ)，本文選用未出現(xiàn)明顯老齡化的6月齡SAMP8小鼠，預(yù)防給予已確證具有雌激素樣生物活性的淫羊藿苷，以雌激素受體拮抗劑為工具藥，探究ICA對(duì)AD的預(yù)防作用及其作用機(jī)制。

學(xué)習(xí)記憶是腦的高級(jí)功能，是在中樞神經(jīng)系統(tǒng)控制下的極其復(fù)雜的過(guò)程，特別是近期記憶能力的下降是腦衰老的一個(gè)重要表現(xiàn)。因此，有關(guān)抗AD的藥物對(duì)學(xué)習(xí)記憶影響的研究多始于行為學(xué)實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)采用了目前使用較常用的Morris水迷宮以及跳臺(tái)方法對(duì)SAMP8小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力進(jìn)行了觀察研究。Morris水迷宮是一種在行為神經(jīng)科學(xué)中測(cè)定小動(dòng)物空間定向和學(xué)習(xí)、記憶的研究方法。經(jīng)典的Morris水迷宮測(cè)試程序主要包括定位航行試驗(yàn)和空間探索實(shí)驗(yàn)兩個(gè)部分［14］。跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)是利用鼠類(lèi)好探索習(xí)性而設(shè)計(jì)，屬于被動(dòng)回避性條件反射。研究結(jié)果表明，與SAMR1相較，SAMP8組小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力減退，定位航行試驗(yàn)中潛伏期延長(zhǎng);空間探索試驗(yàn)中，穿越平臺(tái)次數(shù)減少、在平臺(tái)象限停留時(shí)間縮短，且被動(dòng)反應(yīng)能力下降。ICA預(yù)防給藥8周可以明顯改善SAMP8的空間學(xué)習(xí)記憶能力，提高被動(dòng)反應(yīng)能力。然而腹腔注射雌激素受體抑制劑ICI182780后再給予ICA，發(fā)現(xiàn)ICA對(duì)SAMP8小鼠學(xué)習(xí)記憶能力和被動(dòng)反應(yīng)能力的改善作用明顯降低，說(shuō)明雌激素受體抑制劑ICI182780可以抑制ICA的作用，進(jìn)一步證明ICA對(duì)學(xué)習(xí)記憶的影響與其雌激素樣作用相關(guān)。

氧化應(yīng)激在AD的發(fā)生和發(fā)展中具有重要作用，過(guò)度的氧化應(yīng)激不僅可以直接損傷細(xì)胞膜、RNA和蛋白質(zhì)，同時(shí)還可促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。線粒體被認(rèn)為是細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生ROS的重要部位，氧在線粒體內(nèi)被消耗利用，通過(guò)氧化磷酸化產(chǎn)生的活性氧是體內(nèi)氧自由基的主要來(lái)源［15］。在生理?xiàng)l件下，由于體內(nèi)同時(shí)存在強(qiáng)大的自由基清除系統(tǒng)(如: SOD、GSH-Px、CAT、NADP/NADPH、GSH)，使ROS處于產(chǎn)生和清除的動(dòng)態(tài)平衡。衰老或AD病人體內(nèi)這種平衡被打破，ROS大量聚集，線粒體的功能結(jié)構(gòu)域暴露于高濃度的ROS下，造成線粒體損傷，細(xì)胞功能損傷以及凋亡［16］。雌激素通過(guò)調(diào)節(jié)生成活性氧的呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ和呼吸鏈復(fù)合物Ⅲ［17］，增加各種抗氧化劑酶，包括過(guò)氧化物酶-V、谷氧還蛋白和Mn-SOD的表達(dá)等［18］，降低活性氧的生成，改善氧化應(yīng)激?；诰€粒體在氧化應(yīng)激中的重要地位，我們推測(cè)腦組織線粒體氧化應(yīng)激指標(biāo)比檢測(cè)腦組織勻漿氧化應(yīng)激指標(biāo)更能準(zhǔn)確反映氧化應(yīng)激程度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SAMP8小鼠腦組織出現(xiàn)比較明顯的線粒體氧化應(yīng)激損傷，ICA預(yù)防給藥后SAMP8小鼠腦組織線粒體內(nèi)活性氧ROS和丙二醛MDA含量降低，還原型谷胱甘肽GSH含量升高，而過(guò)氧化氫酶CAT活性變化不大，證明ICA具有一定的線粒體保護(hù)作用，可改善SAMP8小鼠腦組織線粒體氧化應(yīng)激。給予雌激素受體抑制劑后ICA對(duì)腦線粒體氧化應(yīng)激的改善作用變化不大，說(shuō)明ICA發(fā)揮抗氧化應(yīng)激的作用可能與雌激素受體無(wú)關(guān)，其具體作用靶點(diǎn)與機(jī)制需要進(jìn)一步探究。

總之，ICA預(yù)防給藥可明顯改善快速老化小鼠SAMP8學(xué)習(xí)記憶能力及腦組織線粒體氧化應(yīng)激的水平。ICA預(yù)防給藥發(fā)揮改善學(xué)習(xí)記憶的機(jī)制可能與其植物雌激素樣作用有關(guān)，在改善學(xué)習(xí)記憶功能和治療老年癡呆方面有較好的應(yīng)用前景，其對(duì)腦組織線粒體發(fā)揮抗氧化應(yīng)激的作用機(jī)制可能與雌激素受體無(wú)關(guān)，需要進(jìn)一步深入研究。

參考文獻(xiàn):

［1］楊期東，周琳.中國(guó)阿爾茨海默病的流行病學(xué)特征［J］.中國(guó)臨床康復(fù)，2004，8(31): 6982－3.

［1］Yang Q D，Zhou L.Epidemiological characteristics of Alzheimer disease in China［J］.Chin J Clin Rehab，2004，8(31):6982－3.

［2］趙丕文，王大偉，王玲巧，等.用小鼠子宮增重法篩選淫羊藿等10種中藥雌激素樣作用的實(shí)驗(yàn)研究［J］.北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，29(10): 686－9.

［2］Zhang P W，Wang D W，Wang L Q，et al.Screening of ten kinds of Chinese herbal drugs including Herba Epinedii with estrogenic effects by uterus growth test in mice［J］.J Beijing Univ Tradit Chin Med，2006，29(10): 686－9.

［3］周偉勤，鄧景岳，畢明剛，等.淫羊藿苷改善快速老化小鼠SAMP8學(xué)習(xí)記憶功能及與血清雌激素水平相關(guān)性研究［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2009，15(9): 38－41.

［3］Zhou W Q，Deng J Y，Bi M G，et al.Correlation between effect of icariin on learning and memory and level of estradiol in serum in senescence accelerated mouse prone 8［J］.Chin J Exp Tradit Med Form，2009，15(9): 38－41.

［4］劉東華，吳滿(mǎn)剛，畢明剛，等.淫羊藿苷對(duì)去卵巢快速老化(SAMP8)小鼠學(xué)習(xí)記憶及皮層氧化應(yīng)激的影響［J］.軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院學(xué)報(bào)，2010，31(6): 580－3.

［4］Liu D H，Wu M G，Bi M G，et al.Effect of icariin on learning and memory，cortex oxidative stress in ovarietomized senescenceaccelerated prone/8 female mice［J］.J Chin PLA Postgrad Med Sch，2010，31(6): 580－3.

［5］He X L，Zhou W Q，Bi M G，et al.Neuroprotective effects of icariin on memory impairment and neurochemical deficits in senescence-accelerated mouse prone 8(SAMP8)mice［J］.Brain Res，2010，1334: 73－83.

［6］高琳娜，唐千淇，賀曉麗，等.淫羊藿苷對(duì)快速老化小鼠SAMP10學(xué)習(xí)記憶能力以及膽堿能系統(tǒng)活性的影響［J］.中國(guó)中藥雜志，2012，37(14): 2117－21.

［6］Gao L N，Tang Q Q，He X L，et al.Effect of icariin on learning and memory abilities and activity of cholinergic system of senescence-accelerated mice SAMP10［J］.Chin J Chin Mater Med，2012，37(14): 2117－21.

［7］賀曉麗，畢明剛，杜冠華.慢性腦缺血大鼠腦組織線粒體蛋白質(zhì)組與能量代謝相關(guān)性研究［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2012，28(9): 1200－5.

［7］He X L，Bi M G，Du G H.Brain mitochondria proteome and energy metabolism in rats after chronic cerebral hypoperfusion［J］.Chin Pharmacol Bull，2012，28(9): 1200－5.

［8］Hartmann J，Kiewert C，Duysen E G，et al.Choline availability and acetylcholine synthesis in the hippocampus of acetylcholinesterase-deficient mice［J］.Neurochem Int，2008，52(6): 972－8.

［9］Liang Y Q，Tang X C.Comparative effects of huperzine A，donepezil and rivastigmine on cortical acetylcholine level and acetylcholinesterase activity in rats［J］.Neurosci Lett，2004，361(1－3): 56－9.

［10］Wang Z，Zhang X，Wang H，et al.Neuroprotective effects of icaritin against beta amyloid-induced neurotoxicity in primary cultured rat neuronal cells via estrogen-dependent pathway［J］.Neuroscience，2007，145(3): 911－22.

［11］Luo Y，Nie J，Gong Q H，et al.Protective effects of icariin against learning and memory deficits induced by aluminium in rats ［J］.Clin Exp Pharmacol Physiol，2007，34(8): 792－5.

［12］楚晉，李林，葉翠飛，等.淫羊藿黃酮對(duì)APP轉(zhuǎn)基因癡呆小鼠學(xué)習(xí)記憶及β-amyloid生成的影響［J］.中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，38(4): 439－48.

［12］Chu J，Li L，Ye C F，et al.Effects of epimedium flavonoids on learning-memory ability and development of β-amyloid of APP transgenic mice［J］.J Univ Sci Tech Chin，2008，38(4): 439－48.

［13］Miyamoto M.Characteristics of age-related behavioral changes in senescence-accelerated mouse SAMP8 and SAMP10［J］.Exp Gerontol，1997，32(1－2):139－48.

［14］D'Hooge R，De Deyn P P.Applications of the Morris water maze in the study of learning and memory［J］.Brain Res Brain Res Rev，2001，36(1): 60－90.

［15］Du G，Mouithys-Mickalad A，Slues F E.Generation of superoxide anion by mitochondria and impairment of their functions during anoxia and reoxygenation in vitro［J］.Free Radic Biol Med，1998，25(9):1066－74.

［16］Naoi M，Maruyama W，Shamoto-Nagai M，et al.Oxidative stress in mitochondria: decision to survival and death of neurons in neurodegenerative disorders［J］.Mol Neurobiol，2005，31(1－3): 81－93.

［17］Bor'ras C，Gámbini J，Gomez-Cabrera M C，et al.17 beta-estradiol up-regulated，antoxidant enzyme expression via the ERK1 and ERK2［MAPK］/NFkappaB cascade［J］.Aging Cell，2005，4(3): 113－8.

［18］Nilsen J，Irwin R W，Gallaher T K，et al.Estradiol in vivo regulation of brain mitochondrial proteome［J］.J Neurosci，2007，27(51): 14069－77.

Effect of preventive administration of icariin on learning and memory abilities and brain mitochondrial oxidative stress in SAMP8

ZHANG Xiao-fei，LU Chang，HE Xiao-li，BI Ming-gang
(Research Center for Pharmacology and Toxicology，Institute of Medicinal Plant Development，Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College，Beijing 100193，China)

Abstract:Aim To investigate the effect of preventive administration of icariin on learning and memory abilities and brain mitochondrial oxidative stress in senescence-accelerated mouse prone8(SAMP8).Methods

The 6-month-old SAMP8 mice were randomly divided into the SAMP8 model group，ICA groups(75，150 mg·kg－1)，the positive Diethylstilbestrol(DES)group and estrogen receptor inhibitor ICI182780 combined with ICA(150 mg·kg－1)group，with 8 mice in each group.8 same month old SAMR1 mice were selected as the normal control group.After oral administration for 8 weeks，Morris water maze test and stepdown passive test were used to investigate the effects of preventive administration of ICA on learning and memory abilities in SAMP8 mice.Cerebral cortex mitochondria were isolated to determine the effect of preventive administration of ICA on the oxidative stress by detecting reactive oxygen species(ROS)level，lipid peroxides(MDA)content，glutathione GSH content and catalase(CAT)activity.Results Preventive treatment of ICA could significantly improve the abilities of place navigation and space exploration of SAMP8 mice，enhance their reflex ability in step-down passive test.ICA could also reduce the level of ROS and MDA content，increase GSH content in brain mitochondria of SAMP8 mice.CAT activity was not obviously changed.Compared with ICA high dose group，the learning and memory abilities of mice in ICA and estrogen receptor inhibitor ICI182780 co-administrated group were significantly decreased.However，brain mitochondria oxidative stress was not changed obviously.Conclusion Preventive administration of icariin can significantly improve learning and memory abilities and brain mitochondrial oxidative stress in SAMP8 mice.The mechanism of ICA improving learning and memory abilities may be related to its estrogen-like effect; while the action on brain mitochondrial oxidative stress may be independent of estrogen receptor.

Key words:icariin; senescence-accelerated mouse; learning and memory abilities; mitochondria; oxidative stress; estrogen-like effect; estrogen receptor inhibitor

作者簡(jiǎn)介:張曉菲(1989－)，女，碩士生，研究方向:神經(jīng)藥理學(xué)，E-mail: xiaofei198913@163.com;

基金項(xiàng)目:國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No 81202192，No 81473586);國(guó)家科技部“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專(zhuān)項(xiàng)(No 2012ZX09301002-001-026)

收稿日期:2015－03－02，修回日期:2015－04－30

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號(hào):1001－1978(2015)07－0925－06

doi:10.3969/j.issn.1001－1978.2015.07.008