香蕉PPO基因的克隆及原核表達

陳 嬌， 袁德保， 譚 琳， 楊 昭， 李奕星， 王朝政， 李芬芳，仇厚援， 陳文學， 金志強

(1.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院 ?？趯嶒炚?海南省香蕉遺傳改良重點實驗室， 海南 ?？?570102； 2.海南大學食品學院， 海南 ?？?570228)

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香蕉PPO基因的克隆及原核表達

陳 嬌1， 袁德保1， 譚 琳1， 楊 昭2， 李奕星1， 王朝政1， 李芬芳1，仇厚援2， 陳文學2， 金志強1

(1.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院 海口實驗站/海南省香蕉遺傳改良重點實驗室， 海南 ?？?570102； 2.海南大學食品學院， 海南 ?？?570228)

為進一步在蛋白水平上研究香蕉PPO功能及獲得抗酶促褐變的香蕉新品種，通過PCR從巴西蕉中擴增出多酚氧化酶基因(PPO)全長序列，并進行進化樹分析與SDS-PAGE電泳檢測。結(jié)果顯示：多酚氧化酶基因全長1 767 bp，編碼588個氨基酸，GenBank 登錄號為KF900300.1。與其他物種PPO基因的氨基酸序列有很高的結(jié)構(gòu)相似性，并同時具有保守結(jié)構(gòu)域CuA和CuB，香蕉PPO蛋白與菠蘿親緣關系最近。另外，成功構(gòu)建原核表達載體 pQE80L-MaPPO1，并轉(zhuǎn)化E.coliM15，但未表達出目的蛋白，推測可能與MaPPO1中存在導肽有關。

香蕉； 多酚氧化酶； 克??； 原核表達

香蕉(Musaacuminate)作為一些經(jīng)濟不發(fā)達國家的重要糧食作物，是世界最重要的水果之一[1-2]，并具有潤腸、潤肺、清熱、解毒等功效。目前，我國香蕉主要是鮮銷，由于香蕉果肉非常容易褐變，從而改變香蕉的顏色并破壞了香蕉的風味物質(zhì)和營養(yǎng)成分，故難以大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)。前人研究表明，多酚氧化酶引起的酶促褐變是香蕉褐變的主要原因[3-4]。多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO)是一類廣泛存在于動植物、真菌及細菌中的含銅質(zhì)體金屬酶[5-6]，廣義上可分為3大類：酪氨酸酶、兒茶酚氧化酶和漆酶[7]。PPO在果蔬酶促褐變過程中起關鍵作用，最終不僅影響果蔬的外觀品質(zhì)，且將導致果蔬營養(yǎng)價值降低[5,8-9]。因此，研究PPO及其基因具有理論意義和應用價值[10]。

隨著分子生物學的發(fā)展，已相繼克隆出許多植物多酚氧化酶基因，這對認識PPO的分子結(jié)構(gòu),深入研究其蛋白結(jié)構(gòu)和功能意義重大。目前，已從馬鈴薯、番茄、葡萄、甘薯、蘋果、菠菜、紫竹、蝴蝶蘭、茶樹、草莓、蘑菇[11]等園藝植物中克隆出PPO基因。但國內(nèi)外對香蕉PPO基因的研究仍非常有限，對香蕉多酚氧化酶的研究則主要集中在酶學特性、活性抑制和分離純化等方面，有關香蕉PPO基因的克隆研究主要是關于香蕉PPO基因部分序列擴增及香蕉果皮褐變與PPO基因表達量的關系[12-14]，如Quansah等[15]從Grand Nain香蕉中擴增得到PPO基因部分序列，Gros Michel香蕉果皮褐變則與PPO基因的表達量有關[16]。但至今尚未見從蛋白表達水平研究香蕉PPO基因的報道。故筆者首先從巴西香蕉中克隆PPO基因的全長序列，并進行原核表達，為進一步在蛋白水平上研究香蕉PPO功能及獲得抗酶促褐變的香蕉新品種奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 植物與試劑

1.1.1 植物 香蕉為巴西品種(Musa AAAgroup，Brazil)，采摘于中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院?？趯嶒炚靖Ｉ綄嶒灮兀墒粘墒於燃s七八成，取其果皮、果肉和花，液氮速凍后-70℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 試劑 質(zhì)粒 pQE80L、E.coliDH5α由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院?？趯嶒炚颈４?。宿主菌E.coliM15為暨南大學姚占娟博士惠贈。Taq DNA聚合酶、pMD19-T、KpnI、Hind III 限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶、膠回收試劑盒、DNA marker購自TaKaRa公司，Blue Plus Protein Marker(DM101)購自北京全式金生物技術有限公司，亞甲基雙丙烯酰胺，丙烯酰胺購自BBI公司，其他常規(guī)試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 香蕉PPO基因全長cDNA 擴增

首先，參照Asif等[17]的方法提取香蕉果皮、果肉和花混合樣品總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA作為PCR擴增模板。根據(jù)電子克隆方法分析確定香蕉PPO存在于contig_1953(CAIC01022472.1)序列的23550～25322 bp中[18]，因此為獲得香蕉PPO編碼序列，特在此區(qū)域外設計引物(正向引物FP1：5′-tcgatcctgttctcggcttc-3′；反向引物RP1：5′-cgatggtgcggcttttattttcc-3′)，并委托上海生工生物工程技術服務有限公司合成。PCR 擴增反應體系為2×ES Master Mix 12.5 μL，F(xiàn)P1(10 μmol/L)1 μL，RP1(10 μmol/L)1 μL，cDNA 2 μL，RNase-Free Water 8.5 μL。擴增條件為94℃預變性4 min，94℃變性30 s，復性30 s(溫度視情況而定)，72℃延伸1 min，34個循環(huán)，然后72℃延伸10 min。PCR結(jié)束后用1.0% 瓊脂糖凝膠進行電泳檢測擴增產(chǎn)物，然后將目的條帶回收并連接在pMD 19-T載體(TaKaRa，日本)上，然后進行轉(zhuǎn)化并測序。根據(jù)測序結(jié)果分析得到1個香蕉PPO基因全長，命名為MaPPO1。

1.3PPO基因的序列分析

香蕉PPO基因與其他物種的同源性分析利用NCBI(http: //ncbi. nLm. ncib. gov/)中Blast在線分析工具。MaPPO1基因編碼蛋白質(zhì)的氨基酸基本性質(zhì)分析則利用ExPASy(http://www.expasy.ch/tools/pi_tool.html)在線分析工具完成。不同物種間的氨基酸同源性分析利用Clustal X 1.83和DNAMAN 5.0進行，并利用MEGA 5.0軟件進行系統(tǒng)進化樹構(gòu)建。

1.4 原核表達載體的構(gòu)建

pQE80L為4.8 kb左右具有多克隆位點的原核表達載體。分析 pQE80L多克隆位點及MaPPO1基因全長cDNA 序列，設計MaPPO1基因的上下游引物并引入KpnI和HindⅢ酶切位點(上游引物:5′-CGG ggtaccCCGatggtcagccttcctaaagctact-3′；下游引物：5′-CCCaagcttGGtcaatttgggaaatcgat-3′，下劃線為酶切位點)，然后以合成的香蕉cDNA為模板進行MaPPO1 基因全長PCR 擴增。電泳檢測PCR產(chǎn)物后回收，并連接pMD19-T 載體，轉(zhuǎn)化后由上海英駿生物技術有限公司測序確定得到正確的重組質(zhì)粒 pMD- MaPPO1。將測序正確的重組質(zhì)粒 pMD- MaPPO1 進行KpnI 和HindⅢ雙酶切，回收MaPPO1全長基因并插入到同樣經(jīng)雙酶切的原核表達載體pQE80L上，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞DH5α，提取質(zhì)粒并進行酶切和測序驗證，構(gòu)建原核表達載體 pQE80L-MaPPO1。

1.5 pQE80L-MaPPO1 融合蛋白的誘導表達

挑取鑒定正確的陽性克隆單菌落接種至同時含有氨芐(Amp，50 μg/mL)和卡那霉素(Kan，50 μg/mL)的LB液體培養(yǎng)基中，37℃震蕩培養(yǎng)過夜。再將過夜培養(yǎng)的菌液按1∶100的比例接種于相同的新鮮LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至OD600約為0.6 時，加IPTG至終濃度0.1 mmol/L、0.2 mmol/L、0.4 mmol/L、0.6 mmol/L、0.8 mmol/L和1.0 mmol/L時誘導6 h，或加入IPTG至終濃度為1 mmol/L誘導2 h、4 h、6 h、8 h、10 h，以便觀察不同IPTG濃度及不同誘導時間對蛋白表達的影響。離心并收集菌液，4℃，11 200 r/min離心1 min。棄上清液，將菌體用磷酸緩沖溶液洗滌后煮沸破碎，SDS-PAGE電泳檢測目的蛋白表達情況。以空的宿主菌和含表達載體的宿主菌為對照，培養(yǎng)和誘導條件相同。

2 結(jié)果與分析

2.1 香蕉PPO基因的全長 cDNA擴增及序列分析

根據(jù)電子克隆序列設計引物，并通過PCR擴增得到2 116 bp的cDNA序列(圖1)發(fā)現(xiàn)，其閱讀框位于350～2116 bp，經(jīng)NCBI數(shù)據(jù)庫中的Blast工具在線分析確認其已在GenBank中登錄，登錄號為KF900300.1。說明，成功從巴西蕉中獲得1個PPOcDNA全長序列，并命名為MaPPO1。MaPPO1編碼588個氨基酸，理論分子量為65 688.3 kDa，理論等電點為6.32。

注：1為DNA Marker DL4000，2為PCR擴增產(chǎn)物。

Note：1，DNA Marker DL4000；2，The PCR product.

圖1 香蕉PPO基因的PCR擴增圖譜

Fig.1 The PCR amplification plot of bananaPPOgene

利用NCBI網(wǎng)站Blast比對分析發(fā)現(xiàn)，香蕉PPO全長氨基酸序列與海棗PPO蛋白氨基酸序列(XP_008778193.1)的同源性為75%，而MaPPO1的氨基酸序列與其他物種PPO基因的氨基酸序列同源性的比較表明，其與其他物種的PPO蛋白具有很高的結(jié)構(gòu)相似性，屬于酪氨酸酶基因家族蛋白，同時具有保守結(jié)構(gòu)域CuA和CuB結(jié)合位點(圖2)，由此可以推斷，該基因是PPO基因家族的成員。系統(tǒng)進化樹分析包括MaPPO1在內(nèi)的17個PPO蛋白的進化關系(圖3)，香蕉PPO蛋白與鳳梨科植物(菠蘿AAO16863.1)及禾本科植物(玉米NM_001156080.1、水稻DQ532395.1、小麥HQ228152.1)最先聚為一類，親緣關系最近。

注：加邊框部分表示保守域，AcPPO1、LcPPO、CnPPO、GhPPO-4分別表示菠蘿、荔枝、山茶、陸地棉PPO蛋白。

Note：Conserved domains are boxed. AcPPO1, LcPPO, CnPPO, GhPPO-4 are shown pineapple, lychee, camellia, upland cotton PPO proteins.

圖2 香蕉MaPPO1的氨基酸序列與其他植物PPO的氨基酸序列比對

Fig.2 Amino acid sequence alignment of the banana MaPPO1 protein with other plant PPO proteins

圖3 香蕉PPO與其他物種的進化樹

Fig.3 The phylogenetic tree analysis of banana PPO with the other species

注：1為DL8000 DNAMarker，2為KpnI和HindⅢ雙酶切。

Note：1，DL 8000 DNA Marker；2，KpnI andHindⅢ digestion.

圖4 香蕉PPO基因的重組質(zhì)粒

Fig.4 Verifying bananaPPOrecombinant plasmid

2.2 pQE80L-MaPPO1 原核表達載體的鑒定

對構(gòu)建的pQE80L-MaPPO1質(zhì)粒進行KpnI和HindⅢ雙酶切，如圖4所示，電泳后呈現(xiàn)出2條清晰帶，分別為pQE80L(4 800 bp)和MaPPO1(1 767 bp)，并經(jīng)測序正確，表明原核表達載體構(gòu)建成功。

2.3 MaPPO1全蛋白的原核表達

對香蕉pQE80L-MaPPO1 M15進行不同IPTG濃度誘導蛋白表達(圖5)，IPTG濃度為0.1 mmol/L、0.2 mmol/L、0.4 mmol/L、0.6 mmol/L、0.8 mmol/L和1.0 mmol/L時pQE80L- MaPPO1的宿主菌與空載一樣均未表達出目的蛋白。同樣，重組宿主菌用1 mmol/L IPTG 37℃誘導表達2 h、4 h、6 h、8 h和10 h后，進行 SDS-PAGE電泳分析，pQE80L-MaPPO1宿主菌仍未表達出目的蛋白。

注：M為Protein Marker，空1為宿主菌M15的表達，空2為含pQE80L宿主菌M15的表達。

Note：M，Protein Marker；empty 1，expression of M15；empty 2，expression of M15 containing pQE80L.

圖5 不同條件誘導在M15中 pQE80L-MaPPO1重組蛋白的表達

Fig.5 Expression of pQE80L-MaPPO1 recombinant protein in M15 at IPTG concentration and different time

3 結(jié)論與討論

目前，已從許多植物中克隆得到PPO基因，如小麥、蠶豆、馬鈴薯和番茄中分別至少由3個、4個、6個和7個基因編碼PPO[19-21]。本試驗克隆得到1個巴西蕉PPO基因全長，編碼588個氨基酸，理論分子量為65688.3 kD，理論等電點為6.32。植物PPO基因序列通常有較高的同源性，均具有編碼銅結(jié)合部位的保守功能域[22]。本研究將MaPPO1的氨基酸序列與其他物種PPO基因的氨基酸序列同源性比較結(jié)果表明，其與其他物種的PPO蛋白具有很高的結(jié)構(gòu)相似性，屬于酪氨酸酶基因家族蛋白，同時具有保守結(jié)構(gòu)域CuA和CuB結(jié)合位點，一般植物多酚氧化酶基因序列的這2個銅保守區(qū)的同源性均較高，這是多酚氧化酶的主要功能區(qū)[23]。另外，通過構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，進一步明確香蕉PPO蛋白與鳳梨科植物(菠蘿AAO16863.1)及禾本科植物(玉米NM_001156080.1、水稻DQ532395.1、小麥HQ228152.1)等的最近親緣關系。

蛋白是基因表達的終產(chǎn)物，也是其發(fā)揮作用的最終途徑。為此，研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能越來越受到重視。另外，在基因工程方面，一個重組基因正確的轉(zhuǎn)錄翻譯成蛋白是檢測其成功創(chuàng)造并發(fā)揮作用的指標。原核表達系統(tǒng)和真核表達系統(tǒng)是蛋白表達系統(tǒng)主要的兩方面。通過原核表達可獲得大量的抗原蛋白，用于蛋白質(zhì)性質(zhì)與功能及其他多種生化功能的研究[24]。但外源基因能否在大腸桿菌中正確表達，受到很多因子的影響，如目的基因本身的特性、誘導溫度和時間等。本研究結(jié)果表明，不同濃度IPTG及不同時間均不能誘導pQE80L-MaPPO1的宿主菌表達出目的蛋白，推測MaPPO1可能存在導肽從而抑制其體外表達。吳貽良等[25]的研究發(fā)現(xiàn)，將茶葉PPO全長基因克隆到pET32c載體，不能在BL21(DE3)中表達，但切除導肽后的茶葉PPO克隆到pET32c載體，能夠在BL21(DE3)中表達。因此，香蕉成熟PPO蛋白的原核表達情況將是下一步的重點研究內(nèi)容。

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(責任編輯： 劉忠麗)

Cloning and Prokaryotic Expression ofPPOGene in Banana

CHEN Jiao1, YUAN Debao1, TAN Lin1, YANG Zhao2, LI Yixing1, WANG Chaozheng1,LI Fenfang1, CHOU Houyuan2, CHEN Wenxue2, JIN Zhiqiang1

(1.HaikouExperimentalStation,ChineseAcademyofTropicalAgriculturalSciences/HainanKeyLaboratoryofBananaGeneticImprovement,Haikou,Hainan570102; 2.InstituteofFood,HainanUniversity,Haikou,Hainan570228,China)

To further explore banana PPO function in protein level and obtain banana varieties resistant to enzymatic browning. The polyphenol oxidase (PPO, GenBank accession No. KF900300.1) gene was amplified from brazil banana by PCR, and the phylogeny analysis and SDS-PAGE electrophoresis were conducted. Results: ThePPODNA sequence was 1767 bp and encoded a protein of 588 amino acid residues. Sequence alignment showed that amino acid sequence of banana PPO protein had high identity to other species, and all contained conservative domains CuA and CuB. The phylogeny analysis showed that it had a most close phylogenetic relationship withAnanascomosus. In addition, the prokaryotic expression vector pQE80L-MaPPO1 was constructed and transformed toE.coliM15, but the purpose protein did not express, it was speculated that it may be associated with guide peptide of MaPPO1.

banana; polyphenol oxidase; clone; prokaryotic expression

2015-01-08； 2015-05-16修回

國家自然科學基金青年科學基金項目“高活性美拉德產(chǎn)物抑制香蕉酶促褐變的作用機理”(31101328)；中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院基本科研業(yè)務費青年拔尖人才項目“香蕉加工中防褐變成套加工技術研發(fā)及相關機理”(1630052014005)

陳 嬌(1983-)，女，助理研究員，博士，從事產(chǎn)品采后貯運及分子生物學研究工作。E-mail:chenjiao52@163.com

1001-3601(2015)07-0350-0014-05

S668.1

A