水稻超短根突變體ssr1的遺傳分析和基因定位

吳 晶,項(xiàng)顯波,陸開形,朱世華,丁沃娜*

(1 寧波大學(xué) 海洋學(xué)院,浙江寧波 315211;2 寧波大學(xué) 科學(xué)技術(shù)學(xué)院,浙江寧波 315211)

水稻超短根突變體ssr1的遺傳分析和基因定位

吳 晶1,項(xiàng)顯波1,陸開形2,朱世華2,丁沃娜2*

(1 寧波大學(xué) 海洋學(xué)院,浙江寧波 315211;2 寧波大學(xué) 科學(xué)技術(shù)學(xué)院,浙江寧波 315211)

該研究從甲基磺酸乙酯(EMS)誘變的秈稻‘Kasalath’突變體庫中篩選到1個(gè)根系超短的突變體,命名為ssr1(supershortroot1),8 d苗齡突變體的主根和不定根長度分別只有野生型的8.89%和2.29%,其不定根發(fā)生正常,但側(cè)根的發(fā)生和伸長都受到嚴(yán)重抑制,且根毛也非常短。此外,ssr1植株整體矮小,株高不到野生型的一半。遺傳分析結(jié)果表明,該突變性狀由1對隱性核基因控制。利用圖位克隆技術(shù)將SSR1基因定位在第9染色體的STS(sequence tagged site)分子標(biāo)記9g7047K和9g7290K之間,物理距離約為243 kb,在定位區(qū)間共發(fā)現(xiàn)39個(gè)預(yù)測基因,經(jīng)分析其中沒有已克隆的根系發(fā)育基因。對SSR1的定位為進(jìn)一步克隆該基因和闡明水稻根構(gòu)型的分子機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。

水稻;超短根;遺傳分析;基因定位

根是植物長期適應(yīng)陸地條件而形成的一個(gè)重要器官,由主根、側(cè)根、不定根和根毛組成,主根、側(cè)根和不定根又分為根基、根體和根尖三大區(qū)域。根尖是每條根生長最旺盛的部分,由成熟區(qū)、伸長區(qū)、分生區(qū)和根冠四部分組成,根構(gòu)型是指同一根系中所有的根在生長介質(zhì)中的空間造型和分布[1]。種子植物的根系一般分為直根系和須根系,大部分雙子葉植物的根系為直根系,大部分單子葉植物的根系為須根系。根的功能主要有錨定植株,吸收和運(yùn)輸水分、無機(jī)鹽和有機(jī)物,合成及分泌一些次生代謝產(chǎn)物[2]。

水稻是中國最重要的經(jīng)濟(jì)糧食作物,其種植面積約占經(jīng)濟(jì)糧食總種植面積的40%,總產(chǎn)量約占經(jīng)濟(jì)糧食總產(chǎn)量的一半。隨著對水稻根系研究的深入,根系對整個(gè)植株尤其對地上部的調(diào)節(jié)作用越來越受到關(guān)注,這些調(diào)節(jié)作用可能是由根系合成的一些次生代謝產(chǎn)物來完成。研究表明,根系對植株的調(diào)節(jié)作用非常復(fù)雜,主要包括:(1)調(diào)控氣孔開關(guān);(2)調(diào)節(jié)葉片光合作用;(3)控制葉片衰老進(jìn)程等[3-5]。水稻根系形態(tài)對產(chǎn)量的影響已得到廣泛的認(rèn)同[6-7],對水稻根系構(gòu)型的研究為作物改良和提高水稻產(chǎn)量提供了新思路。

近年來,國內(nèi)外通過T-DNA插入、EMS誘變等方法篩選到了一系列與水稻根系發(fā)育相關(guān)的突變體,部分基因已被克隆,這些基因絕大多數(shù)屬于核單基因隱性遺傳,極少數(shù)屬于核單基因半顯性或核單基因顯性遺傳。它們在水稻12條染色體上都有分布,第1～4染色體上分布較多,每條染色體上有7～9個(gè);第5～8、11、12染色體次之,有3～6個(gè);第9、10染色體上則分布較少,只有1～2個(gè),其中定位在第9染色體上的基因只有編碼葡糖胺-6-磷酸乙酰轉(zhuǎn)移酶的OsGNA1[8]。已克隆的這些基因功能各不相同,它們參與了不同的信號通路,表明根系發(fā)育的調(diào)控機(jī)制很復(fù)雜,目前人們對其認(rèn)知還很有限。更多水稻根系構(gòu)型突變體的發(fā)掘和基因功能的研究將有利于根系生長發(fā)育調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建,為水稻根系育種提供寶貴的遺傳材料和基因資源。

超短根突變體ssr1是從EMS誘變的秈稻‘Kasalath’突變體庫中篩選而來,該突變體苗期的地上部明顯矮化,主根、不定根和根毛的伸長受到嚴(yán)重抑制,側(cè)根數(shù)量也極少,只有2～3條。本研究對ssr1進(jìn)行了初步的表型鑒定、遺傳分析和基因定位,為進(jìn)一步克隆該基因和研究其功能奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 水稻材料及培養(yǎng)條件

水稻超短根突變體ssr1是由秈稻‘Kasalath’經(jīng)EMS誘變后篩選得到。培養(yǎng)條件:光照12 h,濕度70%,白天30 ℃,夜晚22 ℃。水稻培養(yǎng)液的配方參照Yoshida等[9],培養(yǎng)8 d后觀察表型,用Nikon D70s相機(jī)進(jìn)行整個(gè)植株及根部的拍攝,主根的根莖結(jié)合部用體視鏡(Leica MZ95,Germany)進(jìn)行觀察。樣本統(tǒng)計(jì)數(shù)為20株。

1.2 遺傳分析和定位群體的構(gòu)建

將突變體ssr1與野生型‘Kasalath’雜交獲得F1,觀察F1表型并判斷顯隱性。F1自交獲得F2,培養(yǎng)8 d后觀察并統(tǒng)計(jì)F2植株長短根的分離比,并進(jìn)行卡方檢測。突變體ssr1與粳稻‘日本晴’雜交,F1自交獲得的F2群體里分離出來的超短根植株用于基因定位。

1.3 水稻突變基因的分子定位

采用簡易TPS法[10]從水稻葉片中提取親本、F1以及F2分離群體突變株的DNA。

在已公布的簡單重復(fù)序列(SSR)標(biāo)記網(wǎng)站(http://www.gramene.org/)選取了138對均勻覆蓋水稻12條染色體且具有‘Kasalath’與‘日本晴’多態(tài)性的SSR引物進(jìn)行粗定位。根據(jù)浙江大學(xué)提供的‘Kasalath’與‘日本晴’全基因組SNP分析結(jié)果,設(shè)計(jì)STS引物。

PCR擴(kuò)增體系:1 μL模板DNA、1 μL 10×PCR buffer、1.2 μL 25 mmol/L MgCl2、0.3 μL 2.5 mmol/L dNTP、0.3 μL 10 μmol/L上下游引物、0.1 μL 5 U/mLTaqDNA聚合酶、5.8 μL超純水。PCR反應(yīng)條件:94 ℃預(yù)變性4 min;94 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,34個(gè)循環(huán);72 ℃延伸5min。PCR產(chǎn)物用于6%非變性聚丙烯酰胺凝膠190 V電泳2.5 h,銀染后顯色分析并拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 突變體的表型鑒定

8 d苗齡ssr1突變體的主根和不定根都很短,長度分別只有野生型的8.89%和2.29%,其不定根發(fā)生能力正常,但側(cè)根的發(fā)生受到嚴(yán)重抑制,只在靠近根基部位有2～3根,且長度也是顯著變短。在體視鏡下觀察發(fā)現(xiàn)ssr1的側(cè)根比野生型粗,且根毛也非常短。此外,ssr1植株整體矮小,株高不到野生型的一半(圖1和表1)。

2.2 遺傳分析

2.3 SSR1基因定位

選用ssr1ב日本晴’的F2群體作為定位群體,取30株F2群體中分離的超短根表型植株分別提取DNA,然后各取等量DNA混成一個(gè)突變體庫。以兩親本、F1和突變體庫的DNA做模板,對125對均勻覆蓋水稻12條染色體的多態(tài)性SSR引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。發(fā)現(xiàn)SSR1與第9染色體上的RM105引物連鎖。

根據(jù)浙江大學(xué)提供的‘Kasalath’與‘日本晴’全基因組SNP分析結(jié)果,在RM105引物附件設(shè)計(jì)了5對STS引物(表2),以ssr1ב日本晴’的F2群體中挑選的264個(gè)超短根植株的單株DNA做模板,PCR擴(kuò)增RM105和新設(shè)計(jì)的STS引物,最終把SSR1基因定位在9g7047K和9g7290K引物之間,物理距離約為243 kb,該區(qū)間覆蓋了3個(gè)BAC克隆:OSJNBa0044K01、P0592C05和OJ138_H04(圖2)。根據(jù)網(wǎng)站(http://rice.plantbiology.msu.edu/cgi-bin/gbrowse/rice/)提供的水稻基因注釋信息,在定位的區(qū)域中共發(fā)現(xiàn)39個(gè)預(yù)測基因:16個(gè)功能基因、7個(gè)反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子、3個(gè)轉(zhuǎn)座子、3個(gè)假定蛋白和10個(gè)未知表達(dá)蛋白,經(jīng)分析這39個(gè)預(yù)測基因中沒有已克隆的根系發(fā)育基因(表3),因此SSR1是一個(gè)調(diào)控水稻根系發(fā)生的新基因。

表1 8 d苗齡的野生型和突變體ssr1的表型參數(shù)

注:a.最長3根不定根長度的平均值;b.主根上最長10根側(cè)根長度的平均值;**.表示突變體和野生型在0.01水平上差異顯著。

Note:a.Average of three longest adventitious roots on each plant;b.Average of ten longest lateral roots on each primary root;**.Significant difference between WT andssr1 at the 0.01 probability level.

圖1 8 d苗齡的野生型和突變體ssr1的表型鑒定A.野生型(左)和ssr1(右)的全株照;B、C.野生型(B)和ssr1(C)根莖結(jié)合部的體視鏡觀察

表2 具有多態(tài)性的SSR及STS標(biāo)記序列

表3 定位區(qū)間內(nèi)基因及其推測功能

圖2 SSR1基因定位

3 討 論

對水稻根系發(fā)育相關(guān)基因的功能研究是解析其根系構(gòu)型的重要途徑之一。Scarpella等[11]發(fā)現(xiàn)RAL1基因突變導(dǎo)致水稻主根缺失,不定根與側(cè)根數(shù)減少,且長度變短,分蘗數(shù)也顯著減少。Jia等[12]克隆的OsCyt-inv1基因突變造成超短根表型,側(cè)根變得粗壯且數(shù)目降低,地上部變短,育性下降。TDD1基因功能缺失后主根長度只有野生型的1/5,不定根長度變短且數(shù)量減少,葉片變窄,地上部矮化嚴(yán)重[13]。GLR3.1、OsGNA1和LRL6-1基因突變后突變體苗期的主根長度只有野生型的1/4左右,且地上部的生長受到不同程度的影響[8,14-15]。OsDGL1、OsGLU3、OsCKI1和OsARF12基因突變后的植株主根長度減短一半以上,且不定根與側(cè)根的生長受到影響,地上部也相應(yīng)變得矮小[16-19]。OsCAND1、OsWOX11和CLR5基因突變導(dǎo)致主根長度為野生型的2/3左右,不定根數(shù)也不同程度的減少,其中OsCAND1功能缺失的突變體存活不到2周[20-22]。OsMT2b、OsSPR1、OsTUA2、OsGatB和OsCOW功能缺失后突變體主根長度略微減短,不定根與側(cè)根的長度或數(shù)量及育性都受影響,植株也表現(xiàn)矮化[23-27]。OsJMJ714編碼的組蛋白去甲基化酶,OsAGAP編碼的ARF-GTP 酶激活蛋白過表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株均表現(xiàn)出主根長度略微減短,不定根、側(cè)根長度減短且數(shù)量減少,地上部矮化[28-29]。

本研究從EMS誘變的秈稻‘Kasalath’突變體庫中篩選到一個(gè)主根和不定根都超短的突變體ssr1,主根長度還不到野生型的1/10,側(cè)根數(shù)量少且變短變粗,此外,根毛也很短。遺傳分析結(jié)果表明該突變性狀由1對隱性核基因控制。比較發(fā)現(xiàn)ssr1表型與OsCyt-inv1功能缺失所形成的水稻超短根表型很相似,不同的是Oscyt-inv1突變體的側(cè)根數(shù)目比ssr1多一些,但是長度更短[12]。OsCyt-inv1也屬于單基因核隱性遺傳,定位在水稻第2染色體上,編碼了一個(gè)堿性/中性蔗糖轉(zhuǎn)化酶,細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)短根原因主要是由于細(xì)胞伸長受阻所造成的,糖分析結(jié)果顯示突變體中蔗糖不能降解成己糖,給突變體加入外源葡萄糖培養(yǎng)時(shí),突變體的超短根表型最終恢復(fù)正常[12]。

本實(shí)驗(yàn)經(jīng)圖位克隆技術(shù)最終將SSR1定位在第9染色體的分子標(biāo)記9g7047K和9g7290K之間,物理距離約為243 kb,目前在第9染色體上已克隆的根系基因只有OsGNA1[14],它位于第9染色體長臂的后段,而SSR1基因位于第9染色體長臂的前段,因此SSR1是一個(gè)新的根系發(fā)育相關(guān)基因。經(jīng)分析定位區(qū)間包含39個(gè)預(yù)測基因,對SSR1的定位為進(jìn)一步克隆該基因和闡明水稻根構(gòu)型分子機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。

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(編輯:宋亞珍)

Genetic Analysis and Gene Mapping of a SuperShort Root Mutantssr1 in Rice (OryzasativaL.)

WU Jing1,XIANG Xianbo1,LU Kaixing2,ZHU Shihua2,DING Wona2*

(1 School of Marine Science,Ningbo University,Ningbo,Zhejiang 315211,China;2 College of Science and Technology,Ningbo University,Ningbo,Zhejiang 315211,China)

In this study,a mutant with super short primary and adventitious roots,less lateral roots and short root hairs was isolated from an EMS (ethyl methane sulfonate)-generated rice mutant library in the Kasalath background,designated asssr1 (supershortroot1).At the 8 d old stage,the length of primary and adventitious roots ofssr1 was only 8.89% and 2.29% of the wild type (WT),respectively.The initiation of adventitious roots ofssr1 was similar as WT,while the initiation and elongation of lateral roots were severely impaired and root hairs were also much shorter than that of WT.Moreover,ssr1 showed dwarf phenotype with plant height less than half of WT.Genetic analysis indicated that the mutant phenotype was controlled by a single recessive nuclear gene.Map-based cloning analysis locatedSSR1 to a 243 kb region between STS(sequence tagged site)markers 9g7047K and 9g7290K on chromosome 9.The region contains 39 putative genes with none reported to be related to root development of rice.This result will be helpful for the cloning ofSSR1 and further characterization of molecular genetic mechanisms underlying root architecture in rice.

rice (OryzasativaL.);super short root;genetic analysis;gene mapping

1000-4025(2015)04-0701-06

10.7606/j.issn.1000-4025.2015.04.0701

2014-11-27;修改稿收到日期:2015-01-28

國家自然科學(xué)基金(31371595);寧波市自然科學(xué)基金(2014A610198);寧波大學(xué)胡嵐優(yōu)秀博士基金

吳 晶(1988-),男,在讀碩士研究生,主要從事水稻根系基因功能研究。E-mail:wujing999@163.com

*通信作者:丁沃娜,博士,副教授,主要從事水稻分子生物學(xué)研究。E-mail:dwn@zju.edu.cn

Q343.1+7

A