小麥R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子TaMYB3-4D的克隆及功能分析

王延謙,張 波,陳文杰,劉登才,劉寶龍,張懷剛*

(1 青海省作物分子育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,西寧 810001;2 中國科學(xué)院大學(xué),北京 100049;3 中國科學(xué)院高原生物適應(yīng)與進(jìn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,西寧 810001)

小麥R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子TaMYB3-4D的克隆及功能分析

王延謙1,2,3,張 波1,3,陳文杰1,3,劉登才1,3,劉寶龍1,3,張懷剛1,3*

(1 青海省作物分子育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,西寧 810001;2 中國科學(xué)院大學(xué),北京 100049;3 中國科學(xué)院高原生物適應(yīng)與進(jìn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,西寧 810001)

MYB轉(zhuǎn)錄因子是植物最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一,廣泛參與植物各種生理生化過程。該研究通過對(duì)小麥基因組測(cè)序數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源搜索,利用電子克隆技術(shù)從紫色籽粒小麥品種‘高原115’中分離得到了一個(gè)新的MYB基因TaMYB3-4D。結(jié)果表明,TaMYB3-4D僅含有一個(gè)內(nèi)含子,其編碼蛋白含有2個(gè)連續(xù)的MYB結(jié)構(gòu)域,為典型的R2R3-MYB蛋白。TaMYB3-4D系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系上與調(diào)控花青素合成的MYB基因親緣關(guān)系較近。TaMYB3-4D與bHLH基因ZmR瞬時(shí)表達(dá)能夠誘導(dǎo)白色胚芽鞘中花青素的合成。此外,TaMYB3-4D基因僅在‘高原115’含花青素的種皮和胚芽鞘中表達(dá),在根、莖、葉中均未表達(dá)。研究表明,TaMYB3-4D基因是一個(gè)具有調(diào)控花青素合成代謝功能的R2R3-MYB基因,很有可能參與小麥花青素的生物合成。

小麥;MYB轉(zhuǎn)錄因子;花青素

MYB轉(zhuǎn)錄因子是植物最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一。這些MYB轉(zhuǎn)錄因子均含有一個(gè)或多個(gè)較為保守的DNA結(jié)合域——MYB結(jié)構(gòu)域,每個(gè)MYB結(jié)構(gòu)域(50～53氨基酸殘基)含有3個(gè)規(guī)則分布的色氨酸殘基[1-3]。根據(jù)所含MYB結(jié)構(gòu)域的數(shù)目與位置,植物中的轉(zhuǎn)錄因子可分為4個(gè)亞類:4R-MYB(含4個(gè)相連的MYB結(jié)構(gòu)域);3R-MYB(R1R2R3-MYB);R2R3-MYB和MYB-related protein(含1個(gè)或2個(gè)間隔的MYB結(jié)構(gòu)域)[4-6]。最早的MYB基因(υ-myb)是1982年從鳥類的原癌病毒中發(fā)現(xiàn)的[7]。在植物中發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)MYB轉(zhuǎn)錄因子是ZmC1[8]。在擬南芥、玉米、水稻、矮牽牛、葡萄、蘋果等植物中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了大量的MYB轉(zhuǎn)錄因子,其中R2R3-MYB基因的比例較大[9-12]。擬南芥中已發(fā)現(xiàn)125個(gè)R2R3-MYB基因,占擬南芥基因組編碼基因的0.2%～0.6%[13]。R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子廣泛參與植物的生理生化過程,如調(diào)控初級(jí)或次生代謝途徑,控制細(xì)胞分化和細(xì)胞周期,抵御植物生長(zhǎng)發(fā)育中的各種生物或非生物脅迫[14]等。植物中分離到并進(jìn)行功能驗(yàn)證的R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子大多調(diào)控初級(jí)和次生代謝途徑,特別是調(diào)控類黃酮類次生代謝途徑。如擬南芥中AtMYB11調(diào)控所有組織中黃酮醇的生物合成,AtMYB90調(diào)控營養(yǎng)組織中花青素的生物合成,AtMYB123調(diào)控種皮的原花青素合成[15-17]。

花青素屬于重要的次生代謝產(chǎn)物—類黃酮化合物,是一種水溶性色素,賦予植物器官和組織五顏六色,具有吸引昆蟲幫其傳粉的作用。植物中的花青素還具有保護(hù)植物免受紫外線的傷害的功能。同時(shí)其對(duì)人類也具有重要的作用,如其抗氧化、抗病毒、抗癌、抗衰老、增強(qiáng)人體免疫力等功效[18-19]。在植物中發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)MYB轉(zhuǎn)錄因子ZmC1就是調(diào)控玉米籽粒的顏色[8]。普通小麥中與花青素合成代謝相關(guān)的性狀有紫色花藥、紅色葉耳、紫色胚芽鞘、紫色莖干、紅粒、紫粒和藍(lán)粒等。這些性狀的QTL都進(jìn)行了初步定位[20-21]。小麥的紅粒性狀已經(jīng)定位到小麥的3AL、3BL、3DL染色體組上,并且克隆到了MYB類轉(zhuǎn)錄因子TaMYB10-3A、TaMYB10-3B和TaMYB10-3D基因,利用自然群體證明了目標(biāo)基因是紅粒性狀的主效基因[22]。與紅粒性狀類似,控制小麥胚芽鞘紫色基因定位于7A、7B、7D的短臂上,距著絲粒15～20 cM,在4BL上還有一個(gè)加性位點(diǎn),推測(cè)也是由MYB類轉(zhuǎn)錄因子控制[20]。李振聲先生的藍(lán)粒小麥的主效基因定位到長(zhǎng)穗偃麥草的4E染色體上,并對(duì)結(jié)構(gòu)基因查爾酮合成酶(CHS)和類黃酮-3′5′-羥化酶(F3′5′H)在藍(lán)粒小麥花青素合成代謝中的作用進(jìn)行了分析,但這些基因都不是藍(lán)粒性狀的主效基因[23]。

本研究以富含花青素的紫色籽粒小麥品種——‘高原115’為研究材料,從中分離克隆出一個(gè)R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子TaMYB3-4D,并進(jìn)行功能分析,為小麥中花青素合成代謝的深入研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材 料

供試小麥品種‘高原115’是中國科學(xué)院西北高原生物研究所培育的普通小麥品種,2001年通過了青海省農(nóng)作物品種審定委員會(huì)審定。在其籽粒和胚芽鞘中都有明顯的花青素積累,表現(xiàn)為紫色。在溫室條件下培養(yǎng)3 d后剪取胚芽鞘,10 d后剪取根和葉片。大田種植情況下,開花后21 d分別剪取莖稈、葉片及未成熟的種子。所有樣品液氮凍存后保存于-80 ℃中用于提取DNA和RNA。瞬時(shí)表達(dá)所用小麥品種‘中國春’由青海省作物分子育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存,‘中國春’的胚芽鞘根據(jù)Himi等[24]的流程準(zhǔn)備。

1.2 植物基因組DNA、總RNA及cDNA準(zhǔn)備

參照Yan等[25]改良的CTAB法提取‘高原115’的基因組DNA。采用植物總RNA快速提取試劑盒RNAprep Pure Plant Kit(Tiangen)提取‘高原115’的根、莖、葉、未成熟種子以及胚芽鞘的總RNA。用微量紫外檢測(cè)儀NANODROP2000C(Thermo)測(cè)量DNA及RNA樣品濃度。用反轉(zhuǎn)錄試劑盒RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(Thermo)將1 μg植物總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。

1.3 TaMYB3-4D基因的克隆

玉米中ZmC1是植物中克隆到的第一個(gè)與花青素合成代謝相關(guān)的MYB類轉(zhuǎn)錄因子,用ZmC1基因核苷酸序列在普通小麥基因組數(shù)據(jù)庫(https://urgi.versailles.inra.fr/blast/blast.php)中進(jìn)行同源搜索,發(fā)現(xiàn)在4DL上存在一個(gè)高度同源的重疊群:IWGSC_chr4DL_V2_ab_k71_contigs_longerthan_200_14366997。通過對(duì)核苷酸序列的生物學(xué)信息分析,將目標(biāo)基因命名為TaMYB3-4D,設(shè)計(jì)了1對(duì)擴(kuò)增TaMYB3-4D基因編碼區(qū)的特異引物Tamyb3-4D-F和Tamyb3-4D-R(表1)。

TaMYB3-4D編碼區(qū)的擴(kuò)增使用高保真DNA聚合酶(Thermo-Fisher Scientific)在GeneAmp PCR System 9700(Applied Biosystems)PCR擴(kuò)增儀進(jìn)行。PCR程序?yàn)?98 ℃預(yù)變性2 min;98 ℃變性15 s,65 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。PCR反應(yīng)產(chǎn)物在1.0%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳分離檢測(cè),將目的帶切膠并用瓊脂糖凝膠回收試劑盒Tiangen TIANgel Midi Purification Kit(天根,Tiangen)回收目的基因。將回收的PCR產(chǎn)物連接至pGEM-T Easy(Promega Corporation)載體上,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,陽性克隆送至華大公司測(cè)序。

表1 引物名稱及序列

1.4 生物信息學(xué)分析

使用Vector NTI 10軟件(Invitrogen)進(jìn)行序列拼接及比對(duì)。利用Primer Primer 5.0軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。使用MEGA 4.0構(gòu)建MYB蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹[26]。利用Gene Structure Display Server(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/) 繪制基因結(jié)構(gòu)圖。

1.5 瞬時(shí)表達(dá)分析

利用Gateway克隆技術(shù)兩步法將TaMYB3-4D克隆到中間載體pDONR207中,使用引物分別為Tamyb3-4D attB1 forward和Tamyb3-4D attB2 reverse;attB1 adapter 和 attB2 adapter。然后使用LR反應(yīng)將TaMYB3-4D構(gòu)建到含有玉米u(yù)biquitin啟動(dòng)子的瞬時(shí)表達(dá)載體pBract214,獲得瞬時(shí)表達(dá)載體pBract214-TaMYB3-4D(Gateway Cloning Kit,Invitrogen)。具體操作步驟參照Gateway試劑盒說明書。pBract214-ZmR(玉米bHLH轉(zhuǎn)錄因子)和pBract214-ZmC1(玉米MYB轉(zhuǎn)錄因子)為青海省作物分子育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存,構(gòu)建方法與pBract214-TaMYB3-4D相同。瞬時(shí)表達(dá)質(zhì)粒通過基因槍轟擊轉(zhuǎn)入白色的中國春胚芽鞘中[27]。胚芽鞘在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16 h后,在實(shí)體顯微鏡下觀察并照相。

1.6 RT-PCR分析

以微管蛋白基因Tubulin為內(nèi)標(biāo)基因,引物為Tubulin-F和Tubulin-R(表1)。使用特異性引物Tamyb3-4D-F和Tamyb3-4D-R進(jìn)行RT-PCR,檢測(cè)TaMYB3-4D基因在‘高原115’不同組織(根、莖、葉、未成熟種子及胚芽鞘)中的表達(dá)情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 TaMYB3-4D基因全長(zhǎng)序列的克隆

利用基因全長(zhǎng)特異引物TaMYB3-4D-F和TaMYB3-4D-R(表1),在‘高原115’基因組DNA和種皮cDNA中擴(kuò)增得到了TaMYB3-4D基因組序列及CDS序列(圖1,A、B)。測(cè)序結(jié)果表明,其基因組序列為791 bp;CDS序列為675 bp,編碼224個(gè)氨基酸,與PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果是一致的。編碼一個(gè)典型的R2R3-MYB蛋白,在R2和R3結(jié)構(gòu)域中均含有保守的色氨酸殘基W,這表明TaMYB3-4D很有可能是R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子(圖1,C)。

2.2 生物信息學(xué)分析

在模式植物擬南芥中,R2R3-MYB基因的功能已研究得較為全面。在本研究中,為了推測(cè)TaMYB3-4D基因的潛在功能,構(gòu)建了擬南芥和小麥R2R3-MYB基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖2)。TaMYB3-4D與擬南芥的AtMYB123/TT2以及小麥第3同源群的TaMYB10-A1、TaMYB10-B1、TaMYB10-D1基因關(guān)系最近,而這4個(gè)基因均調(diào)控類黃酮的生物合成。其中AtMYB123/TT2與擬南芥種皮的原花青素合成有關(guān),TaMYB10-A1、TaMYB10-B1和TaMYB10-D1則與小麥紅色種皮相關(guān)[28]。該結(jié)果暗示TaMYB3-4D基因可能與小麥類黃酮生物合成途徑有關(guān)。與其它調(diào)控類黃酮生物合成的MYB轉(zhuǎn)錄因子的同源性分析顯示,TaMYB3-4D推導(dǎo)的氨基酸序列與玉米ZmC1及小麥TaMYB3-4B的一致性最高,分別為57.51%和77.55%;與葡萄VvMYBA1一致性為30.86%,與擬南芥AtMYB123/TT2為38.46%,而與小麥TaMYB10達(dá)到41.10%。ZmC1是在玉米中發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)與花青素合成有關(guān)的MYB轉(zhuǎn)錄因子,它的結(jié)構(gòu)與功能已研究得較為清楚[29]。氨基酸序列的比對(duì)發(fā)現(xiàn),TaMYB3-4D比ZmC1少了49個(gè)氨基酸殘基;在保守區(qū)的一致性很高,僅有14個(gè)氨基酸殘基的替換,同時(shí)在R3結(jié)構(gòu)域中均存在一個(gè)與bHLH蛋白相互作用的結(jié)構(gòu)原件;在C-末端有一個(gè)與ZmC1相似的轉(zhuǎn)錄激活區(qū)(圖1,C和圖3,A)。MYB基因結(jié)構(gòu)圖顯示,TaMYB3-4B和TaMYB3-4D僅有1個(gè)內(nèi)含子,而其它的MYB基因則有2個(gè)內(nèi)含子(圖3,B)。TaMYB3-4D一個(gè)內(nèi)含子的丟失可能伴隨著部分編碼區(qū)的刪除,導(dǎo)致其編碼氨基酸序列的變短。

圖1 TaMYB3-4D基因的PCR克隆、編碼區(qū)序列及推測(cè)的氨基酸序列A.‘高原115’基因組DNA;B.‘高原115’種皮cDNA;C.TaMYB3-4D基因編碼區(qū)及氨基酸序列:陰影部分為保守的MYB結(jié)構(gòu)域,黑體字為MYB結(jié)構(gòu)域保守的色氨酸(W)殘基,橫線部分表示與bHLH蛋白作用的D/ELx2R/Kx3Lx6Lx3R結(jié)構(gòu)元件,虛線部分為可能的轉(zhuǎn)錄激活區(qū)

圖2 擬南芥和小麥R2R3-MYB蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系A(chǔ)tMYB為擬南芥MYB基因,TaMYB為小麥MYB基因;圓點(diǎn)為本研究中TaMYB3-4D轉(zhuǎn)錄因子;方點(diǎn)為小麥第3同源群的MYB基因;箭頭為擬南芥R2R3-MYB分類中的第5亞群

2.3 TaMYB3-4D基因的功能驗(yàn)證

在前人的研究中,玉米MYB轉(zhuǎn)錄因子ZmC1和bHLH轉(zhuǎn)錄因子ZmR的共表達(dá)能夠誘導(dǎo)花青素的生物合成[27]。因此,在本試驗(yàn)中用ZmC1做對(duì)照,利用基因槍介導(dǎo)的瞬時(shí)表達(dá)技術(shù)來驗(yàn)證TaMYB3-4D的功能。從圖4中可以看出,當(dāng)TaMYB3-4D和ZmC1與ZmR共表達(dá)時(shí),在‘中國春’胚芽鞘中均能誘導(dǎo)花青素的合成,這說明TaMYB3-4D是一個(gè)調(diào)控花青素生物合成的MYB轉(zhuǎn)錄因子。但是單獨(dú)的TaMYB3-4D或者ZmC1在胚芽鞘中表達(dá)時(shí),并沒有觀察到花青素斑點(diǎn)的存在(圖4),這表明它們均需要與bHLH轉(zhuǎn)錄因子共同作用才能夠激活結(jié)構(gòu)基因的表達(dá),從而誘導(dǎo)花青素的生物合成。

2.4 TaMYB3-4D在不同組織中的表達(dá)分析

以微管蛋白基因Tubulin為內(nèi)標(biāo)基因,通過RT-PCR分析了TaMYB3-4D基因在‘高原115’不同組織中的表達(dá),結(jié)果只在未成熟的種子和胚芽鞘中檢測(cè)到了TaMYB3-4D基因的表達(dá),在其它組織(根、莖、葉)中并未檢測(cè)到(圖5)。而在田間和實(shí)驗(yàn)室的觀察發(fā)現(xiàn),‘高原115’的種皮及胚芽鞘均呈現(xiàn)紫色,這是否暗示著TaMYB3-4D基因可能與種皮及胚芽鞘中的花青素生物合成有關(guān)。

圖3 植物中調(diào)控類黃酮生物合成的部分MYB基因的結(jié)構(gòu)及氨基酸序列比對(duì)A為TaMYB3-4D與ZmC1和TaMYB3-4B氨基酸序列比對(duì),箭頭所示區(qū)域?yàn)镸YB結(jié)構(gòu)域,實(shí)線方框內(nèi)表示與bHLH蛋白相互作用的結(jié)構(gòu)元件,虛線方框內(nèi)表示轉(zhuǎn)錄激活區(qū);B為植物中調(diào)控類黃酮生物合成的部分MYB基因的結(jié)構(gòu),圓柱體代表外顯子,線條代表內(nèi)含子;NCBI登錄號(hào):VvMYBA1(AB111101)、AtMYB123(NC_003076)、ZmC1(AF320613)、TaMYB10-A1(AB599721)、TaMYB10-B1(AB599722)、TaMYB10-A1(AB191460)

圖4 小麥胚芽鞘中基因槍介導(dǎo)的瞬時(shí)表達(dá)分析A.胚芽鞘部分放大圖;B.瞬時(shí)表達(dá)后胚芽鞘全圖;TaMYB3-4D、ZmR、ZmC1分別表示使用pBract214-TaMYB7D、pBract214-ZmR和pBract-ZmC1質(zhì)粒轟擊胚芽鞘;CK表示使用空載體pBract214轟擊胚芽鞘

圖5 TaMYB3-4D基因在‘高原115’不同組織中的表達(dá)情況IS.未成熟種子;C.胚芽鞘;R.根;S.莖;L.葉

3 討 論

花青素能夠保護(hù)植物免受紫外線的傷害,同時(shí)對(duì)人類也具有重要的作用,如其抗氧化、抗病毒、抗癌、抗衰老以及增強(qiáng)人體免疫力等。而作為調(diào)控花青素代謝的重要轉(zhuǎn)錄因子,小麥中與花青素合成代謝相關(guān)的一些MYB轉(zhuǎn)錄因子尚不能確定。因此,克隆小麥MYB基因并驗(yàn)證其功能,有助于解析小麥中花青素合成代謝的分子調(diào)控機(jī)理。

TaMYB3-4D與調(diào)控種皮中的花青素或原花青素代謝的擬南芥AtMYB123/TT2以及小麥TaMYB10進(jìn)化關(guān)系最為接近,具有調(diào)控花青素合成代謝的保守結(jié)構(gòu)域。在玉米bHLH轉(zhuǎn)錄因子ZmR的參與下TaMYB3-4D基因能夠誘導(dǎo)胚芽鞘中花青素的合成,而單獨(dú)TaMYB3-4D基因不能誘導(dǎo)花青素合成。Himi等[28]在TaMYB10以及其它參與調(diào)控類黃酮代謝的MYB轉(zhuǎn)錄因子的C-端中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)保守的氨基酸模塊IRTKAL/IRC,推測(cè)該模塊在調(diào)控類黃酮的生物合成中起著重要的作用。在TaMYB3-4D推導(dǎo)的氨基酸序列中我們沒有發(fā)現(xiàn)該保守模塊,很可能這就是單獨(dú)TaMYB3-4D基因不能調(diào)控花青素合成代謝的原因。當(dāng)TaMYB3-4D

和玉米bHLH基因ZmR共表達(dá)時(shí),大量的胚芽鞘細(xì)胞中積累了花青素,很有可能TaMYB3-4D與bHLH蛋白形成異源二聚體時(shí)能夠彌補(bǔ)缺失的IRTKAL/IRC模塊而調(diào)控花青素的代謝。這些都說明TaMYB3-4D是一個(gè)具有調(diào)控花青素合成代謝的MYB類轉(zhuǎn)錄因子。

TaMYB3-4D在普通小麥品種‘高原115’積累花青素合成的部位都有較高的表達(dá)量,而在無明顯花青素合成代謝的部位或組織表達(dá)量較低。同時(shí)TaMYB3-4D具有調(diào)控花青素合成代謝的功能,因此該基因很有可能參與了調(diào)控‘高原115’中花青素合成代謝。在小麥中控制紅粒性狀的主效基因定位于3AL、3BL和3DL染色體,藍(lán)粒性狀定位于4E染色體,紫粒性狀定位于2AL和7BL染色體,紫桿性狀定位于7BS和7DS,紫色胚芽鞘定位于7AS、7BS和7DS染色體,紫色花藥性狀定位于7DS染色體上。這些已定位到的小麥中花青素合成代謝相關(guān)性狀的主效基因還沒有一個(gè)是在4D染色體上,因此TaMYB3-4D參與了小麥中花青素的合成代謝調(diào)控,但還不是小麥中花青素合成代謝相關(guān)性狀的主效基因[30]。藍(lán)粒小麥的主效基因定位于長(zhǎng)穗偃麥草的4E染色體上[23],4E與普通小麥的第4同源群在進(jìn)化關(guān)系上最為接近。4E染色體上有沒有與TaMYB3-4D基因同源的MYB轉(zhuǎn)錄因子以及該轉(zhuǎn)錄因子對(duì)藍(lán)粒性狀形成中的作用還需要進(jìn)一步的研究和驗(yàn)證。

本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)小麥基因組測(cè)序數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源搜索,利用電子克隆技術(shù)從紫色籽粒小麥品種‘高原115’中分離得到了1個(gè)新的MYB基因TaMYB3-4D。TaMYB3-4D僅含有1個(gè)內(nèi)含子,其編碼蛋白含有兩個(gè)連續(xù)的MYB結(jié)構(gòu)域,為典型的R2R3-MYB蛋白。TaMYB3-4D系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系上與調(diào)控花青素合成的MYB親緣關(guān)系較近。TaMYB3-4D與bHLH基因ZmR瞬時(shí)表達(dá)能夠誘導(dǎo)白色胚芽鞘中花青素的合成。此外,TaMYB3-4D基因僅在高含花青素的種皮和胚芽鞘中表達(dá),在根、莖、葉中均未表達(dá)。這些結(jié)果表明,TaMYB3-4D是一個(gè)具有調(diào)控花青素合成代謝的MYB基因,很有可能參與小麥花青素的生物合成。

[1] GABRIELSEN O S,SENTENAC A,FROMAGEOT.Specific DNA binding domain by c-Myb:evidence for a double helix-turn-helix-related motif[J].Science,1991,253(5 024):1 140-1 143.

[2] JIA L,CLEGG M T,JIANG T.Evolutionary dynamics of the DNA-binding domains in putative R2R3-MYB genes identified from rice subspecies indica and japonica genomes[J].PlantPhysiology,2004,134(2):575-585.

[3] OGATA K S,MORIKAWA H,NAKAMURA A,etal.Solution structure of a specific DNA complex of the Myb DNA-binding domain with cooperative recognition helices[J].Cell,1994,79(4):639-648.

[4] DUBOS C,GROTEWOLD E,etal.MYB transcription factors inArabidopsis[J].TrendsinPlantScience,2010,15(10):573-581.

[5] JIN H,MARTIN C.Multifunctionality and diversity within the plant MYB-gene family[J].PlantMolecularBiology,1999,41(5):577-585.

[6] ROSINSKI J A,ATCHLEY W R.Molecular evolution of the Myb family of transcription factors:evidence for polyphyletic origin[J].JournalofMolecularEvolution,1998,46(1):74-83.

[7] KLEMPNAUER K H,GONDA T J,BISHOP J M.Nucleotide sequence of the retroviral leukemia genev-myband its cellular progenitorc-myb:the architecture of a transduced oncogene[J].Cell,1982,31(2):453-463.

[8] PAZ-ARES J,GHOSAL D,WIENAND U,etal.The regulatory c1 locus ofZeamaysencodes a protein with homology to myb proto-oncogene products and with structural similarities to transcriptional activators[J].TheEMBOJournal,1987,6(12):3 553-3 558.

[9] CHEN Y,YANG X,HE K,etal.The MYB transcription factor superfamily ofArabidopsis:expression analysis and phylogenetic comparison with the rice MYB family[J].PlantMolecularBiology,2006,60(1):107-124.

[10] DU H,ZHANG L,LIU L,etal.Biochemical and molecular characterization of plant MYB transcription factor family[J].Biochemistry(Mosccow),2009,74(1):1-11.

[11] VELASCO R,ZHARKIKH A,TROGGIO M,etal.A high quality draft consensus sequence of the genome of a heterozygous grapevine variety[J].PLoSOne,2007,2(12):e1326.

[12] RABINOWICZ P D,BRAUN E L,WOLFE A D,etal.Maize R2R3-MYB genes:sequence analysis reveals amplification in the higher plants[J].Genetics,1999,153(1):427-444.

[13] STRACKE R,WERBER M,WEISSHAAR B.The R2R3-MYB gene family inArabidopsisthaliana[J].CurrentOpinioninPlantBiology,2001,4(5):447-456.

[14] FELLER A,MACHEMER K,BRAUN E L,etal.Evolutionary and comparative analysis of MYB and bHLH plant transcription factors[J].ThePlantJournal,2011,66(1):94-116.

[15] STRACKE R,ISHIHARA H,HUEP G,etal.Differential regulation of closely related R2R3-MYB transcription factors controls flavonol accumulation in different parts of theArabidopsisthalianaseedling[J].ThePlantJournal,2007,50(4):660-677.

[16] GONZALEZ A,ZHAO M,LEAVITT J M,etal.Regulation of the anthocyanin biosynthetic pathway by the TTG1/bHLH/Myb transcriptional complex inArabidopsisseedlings[J].ThePlantJournal,2008,53(5):814-827.

[17] LEPINIEC L,DEBEAUJON I,ROUTABOUL J M,etal.Genetics and biochemistry of seed flavonoids[J].AnnualReviewofPlantBiology,2006,57:405-430.

[18] YANG C S,LANDAU J M,HUANG M T,etal.Inhibition of carcinogenesis by dietary polyphenolic compounds[J].AnnualReviewofNutrition,2001,21(1):381-406.

[19] ROSS J A,KASUM C M.Dietary flavonoids:bioavailability,metabolic effects,and safety[J].AnnualReviewofNutrition,2002,22(1):19-34.

[20] KHLESTKINA E K,PESTSOVA E G,RODER M S,etal.Molecular mapping,phenotypic expression and geographical distribution of genes determining anthocyanin pigmentation of coleoptiles in wheat (TriticumaestivumL.)[J].TheoreticalandAppliedGenetics,2002,104(4):632-637.

[21] NELSON J C,VANDEYNZE A E,AUTRIQUE E,SORRELLS M E,etal.Molecular mapping of wheat-homoeologous group-3[J].Genome,1995,38(3):525-533.

[22] HIMI E,NODA K.Isolation and location of three homoeologous dihydroflavonol-4-reductase (DFR) genes of wheat and their tissue-dependent expression[J].JournalofExperimentalBotany,2004,55(396):365-375.

[23] YANG G H,LI B,GAO J W,etal.Cloning and expression of two chalcone synthase and a flavonoid 3′5′-hydroxylase 3′-end cDNAs from developing seeds of blue-grained wheat involved in anthocyanin biosynthetic pathway[J].ActaBotanicaSinica,2004,46(5):588-594.

[24] HIMI E,NISAR A,NODA K.Colour genes (R and Rc) for grain and coleoptile upregulate flavonoid biosynthesis genes in wheat[J].Genome,2005,48(4):747-754.

[25] YAN Z,WAN Y,LIU K,etal.Identification of a novel HMW glutenin subunit and comparison of its amino acid sequence with those of homologous subunits[J].ChineseScienceBulletin,2002,47(3):220-225.

[26] TAMURA K,DUDLEY J,NEI M,etal.MEGA4:Molecular evolutionary genetics analysis (MEGA) software version 4.0[J].MolecularBiologyandEvolution,2007,24(8):1 596-1 599.

[27] AHMED N,MAEKAWA M,UTSUGI S,etal.Transient expression of anthocyanin in developing wheat coleoptile by maize C1 and B-peru regulatory genes for anthocyanin synthesis[J].BreedingScience,2003,53(1):29-34.

[28] HIMI E,MAEKAWA M,MIURA H,etal.Development of PCR markers forTamyb10 related toR-1,red grain color gene in wheat[J].TheoreticalandAppliedGenetics,2011,122(8):1 561-1 576.

[29] GROTEWOLD E,SAINZ M B,etal.Identification of the residues in the Myb domain of maize C1 that specify the interaction with the bHLH cofactor R[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica,2000,97(25):13 579-13 584.

[30] 劉寶龍.小麥品種高原115紫色籽粒中花青素合成調(diào)控機(jī)理研究[D].北京:中國科學(xué)院大學(xué),2009.

(編輯:宋亞珍)

Cloning and Functional Verification of R2R3-MYBTranscription FactorTaMYB3-4Din Wheat

WANG Yanqian1,2,3,ZHANG Bo1,3,CHEN Wenjie1,3,LIU Dengcai1,3,LIU Baolong1,3,ZHANG Huaigang1,3*

(1 Qinghai Province Key Laboratory of Crop Molecular Breeding,Xining 810001,China;2 University of Chinese Academy of Sciences,Beijing 100049,China;3 Key Laboratory of Adaptation and Evolution of Plateau Biota (AEPB),Chinese Academy of Sciences,Xining 810001,China)

The MYB transcription factor is one of the largest gene families in plant,involving in various physiological and biochemical processes.In this study,one newMYBgeneTaMYB3-4Dwas isolated from the wheat cultivar ‘Gaoyuan 115’.TaMYB3-4Dwas close to the genes regulating anthocyanins biosynthesis in phylogenetic tree.TaMYB3-4Dpossessed only one intron,while the otherMYBgenes regulating anthocyanins biosynthesis had two introns.The deduced amino acid of TaMYB3-4D contained two consecutive MYB domains,the typical characteristic of the R2R3-MYB transcription factor.Transient expression experiments showed thatTaMYB3-4Dinduced the white coleoptile cells of wheat cultivar Chinese Spring (CS) to synthesize anthocyanins with the help ofbHLHtranscription factorZmRin light.Meanwhile,the RT-PCR analysis showed thatTaMYB3-4Dgene only expressed in purple seeds and red coleoptiles of ‘Gaoyuan 115’,but not in root,stems and leaves.All of these results suggested thatTaMYB3-4Dwas a R2R3-MYB transcription factor regulating anthocyanins biosynthesis in wheat.

Triticumaestivum;MYB transcription factor;anthocyanins biosynthesis

1000-4025(2015)04-0646-07

10.7606/j.issn.1000-4025.2015.04.0646

2014-12-27;修改稿收到日期:2015-01-30

中國科學(xué)院知識(shí)創(chuàng)新工程重要方向項(xiàng)目;國家自然科學(xué)基金(31260322);中國科學(xué)院西部之光項(xiàng)目

王延謙(1985-),男,在讀博士研究生,主要從事小麥遺傳育種研究。E-mail:wangyanqian2004@163.com

*通信作者:張懷剛,博士,研究員,博士生導(dǎo)師,主要從事小麥遺傳育種研究。E-mail:hgzhang@nwipb.cas.cn

Q785;Q789

A