禽傳染性支氣管炎病毒M41株反向遺傳株的構(gòu)建

李 然 許記剛 吳 暄 姬高升 楊 鑫 王紅寧

(四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,動物疫病防控與食品安全四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,“985工程”西南資源環(huán)境與災(zāi)害防治科技創(chuàng)新平臺,四川成都 610064)

禽傳染性支氣管炎病毒M41株反向遺傳株的構(gòu)建

李 然 許記剛 吳 暄 姬高升 楊 鑫 王紅寧*

(四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,動物疫病防控與食品安全四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,“985工程”西南資源環(huán)境與災(zāi)害防治科技創(chuàng)新平臺,四川成都 610064)

禽傳染性支氣管炎病毒是目前危害禽養(yǎng)殖業(yè)的重大傳染病之一。由于病毒基因組大、操作困難，給研究其基因組結(jié)構(gòu)開發(fā)有效的疫苗帶來了困難。本研究在對IBV M41毒株全基因組序列測序的基礎(chǔ)上用DNAStar軟件的MapDraw程序分析酶切位點(diǎn)的分布情況，將全基因組分為14段分段擴(kuò)增。采用Primer6設(shè)計(jì)含No See’m酶切位點(diǎn)，在5’端引入T7啟動子核心序列的引物，分段克隆于PMD19-T載體，通過引入的“No See’m式”Bsa I和BsmB I酶切位點(diǎn)，將亞克隆體外拼接成基因組全長cDNA。再通過5’端引入的T7啟動子核心序列對基因組全長cDNA進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，使用電擊的方法將全長轉(zhuǎn)錄物轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后轉(zhuǎn)入SPF雞胚培養(yǎng)，鑒定成功獲得了IBV M41拯救株。為研究IBV強(qiáng)毒株的致病機(jī)理、毒力位點(diǎn)及IBV新型疫苗的研究提供了參考，奠定了基礎(chǔ)。

IBV M41株 反向遺傳

傳染性支氣管炎（IB）又稱為禽傳染性支氣管炎，是由冠狀病毒科的傳染性支氣管炎病毒（Infectious bronchitis Virus，IBV）引起的一種雞的常見的急性、高度傳染性疾病，是危害養(yǎng)禽業(yè)的重大傳染病之一。以呼吸道癥狀、產(chǎn)蛋雞產(chǎn)蛋下降、蛋品質(zhì)下降、腎臟病變及胃腸道病變?yōu)橹饕卣鳎⊿aif Y M等，2005；Cavanagh 等，2003）。目前，IBV廣泛分布，不同毒株在組織嗜性及致病性上存在較大差異，血清型復(fù)雜，目前全世界已經(jīng)發(fā)現(xiàn)幾十種IBV血清型，由于血清型眾多，不同血清毒株交叉保護(hù)弱，新的變異毒株不斷出現(xiàn)，導(dǎo)致禽傳染性支氣管炎不斷爆發(fā)（Zou N L等，2010；Kulkarni A B 等，2010）。每年造成的經(jīng)濟(jì)損失超過十億元，當(dāng)前尚無治療IB的特效藥，疫苗免疫成為IBV防控的主要手段（王紅寧，2000）。

對RNA病毒而言，反向遺傳學(xué)技術(shù)主要指全長cDNA感染性克隆技術(shù)，包括病毒基因組全長cDNA的克隆拼接技術(shù)和由全長cDNA轉(zhuǎn)錄獲得感染性轉(zhuǎn)錄體制備技術(shù)。該技術(shù)能在病毒DNA水平上對其進(jìn)行人工操作，解決了RNA病毒基因組難以操作的難題，從而為RNA 病毒的基因復(fù)制與表達(dá)調(diào)控機(jī)理研究，新疫苗的研制等提供了強(qiáng)有力的技術(shù)手段。自1978年Taniguchil首次對RNA病毒噬菌體Qβ進(jìn)行反向遺傳操作（Taniguchi and Weissmann，1978）以來，已有大量RNA病毒反向遺傳操作的報(bào)道。禽冠狀病毒傳染性支氣管炎病毒IBV的反向遺傳操作主要集中在Beaudette株反向遺傳研究。Casais R等（2001）痘苗病毒載體成功建立了IBV反向遺傳操作技術(shù)，發(fā)現(xiàn)S蛋白是IBV組織嗜性的決定子，也是主要免疫原性基因。Casais R等（2005）發(fā)現(xiàn)基因5是IBV復(fù)制非必需的基因。Hudgson T等（2006）在Casais前期的工作基礎(chǔ)上，對IBV的基因3（3ab）的功能進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)基因3也是復(fù)制非必需的基因。美國學(xué)者Youn S等（2005）和新加坡學(xué)者Fang S等（2007）分別也分別建立了IBV的反向遺傳體系。在國外學(xué)者對Beaudette株反向遺傳研究的基礎(chǔ)上目前我國也已經(jīng)成功構(gòu)建了H120的反向遺傳（Ying Shun Zhou，2013）。國內(nèi)外對IBV的研究均集中于弱毒株的反向遺傳操作，但是對強(qiáng)毒株的反向遺傳構(gòu)建，及毒力位點(diǎn)致病機(jī)理的研究有待完善，因此本研究在實(shí)驗(yàn)室前期工作的基礎(chǔ)上選擇IBV M41株作為研究對象，建立IBV強(qiáng)毒株的反向遺傳操作為后續(xù)進(jìn)一步研究病毒的分子致病機(jī)理，重組疫苗等奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 毒株

IBV M41株中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供，由四川大學(xué)動物疫病防控與食品安全四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 工具酶及主要試劑

限制性內(nèi)切酶BSaI、BsmBI（NEB）；KOD-plus高保真酶（TOYOBO）；PMD19-T、DH5α、T4 DNA Ligase（Takara）；引物由上海生工生物公司合成。

2 方法

2.1 IBV M41株全基因組的分段擴(kuò)增

在對IBV M41毒株全基因組測序的基礎(chǔ)上，用DNASTAR對其進(jìn)行酶切位點(diǎn)的分析后將全基因組分成14段。用Primer 6設(shè)計(jì)含有No See’m酶切位點(diǎn)的擴(kuò)增引物，在全基因組5'UTR端引入T7啟動子，在全基因組3'端引入Poly（A）尾。引物由上海生工生物工程公司合成。

Trizol法從含IBV M41株的雞胚尿囊液中提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，14個片段分別用高保真酶以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將各個目的片段純化后分別與PMD19-T載體連接、將獲得的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)中，在含有氨芐西林的IPTG/X-gal固態(tài)平板上37℃過夜培養(yǎng)，挑取陽性克?。?～5個）進(jìn)行測序正確無誤后保存菌種。

2.2 重組質(zhì)粒的提取、目的cDNA片段的酶切回收

將鑒定后保存的正確無誤的菌種接種于200ml具有氨芐抗性的LB培養(yǎng)基中37℃過夜培養(yǎng)11～14h，用堿裂解法提取質(zhì)粒、用聚乙二醇法純化。

分別對載有F1～F14的質(zhì)粒進(jìn)行酶切，將酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，目的片段切膠回收，用核酸蛋白儀測定濃度。

2.3 全長cDNA的克隆拼接和感染性轉(zhuǎn)錄體的獲得

（1）在T4連接酶體系中，將F1-F4；F4-F8；F9-11；F12-14分別以等摩爾比連接。瓊脂糖電泳回收純化得到四個長度分別為6.84K、6.87K、6.86K、6.95K的1/4目的片段。

（2）將四個四分之一片段按照等摩爾比用T4連接酶連接24h獲得全長、抽提濃縮。用mMESSAGE mMACHINE Ultra T7 Kit體外轉(zhuǎn)錄試劑盒體外轉(zhuǎn)錄獲得具有感染性的全長RNA。

2.4 反向遺傳株M41-R株的鑒定

2.4.1 拯救株致病性及EID50測定

SPF雞胚孵化至10日齡；將IBV依次作10倍稀釋，進(jìn)行雞胚尿囊腔接種，每個稀釋度接種0.2ml；作5個重復(fù)，同時設(shè)正常雞胚對照。置37℃培養(yǎng)，棄去24h內(nèi)死亡胚，再孵化7d后觀察。按Reed-Muench法計(jì)算EID50。

2.4.2 HA 測定

將M41-R雞胚尿囊液用A型魏氏梭菌濾液處理，并作梯度稀釋，用0.75% 的雞紅細(xì)胞滴定，測定M41-R的紅細(xì)胞凝集效價。M41親本株、不含IBV病毒的SPF尿囊液、PBS分別作為對照。

3 結(jié)果

（1）基因組分段擴(kuò)增瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果表明成功擴(kuò)增出了大小為1k～2.6k的目的片段。

（2）1/4片段連接結(jié)果如圖1，結(jié)果表明成功得到了大小為6.84K、6.87K、6.86K、6.95K的目的片段。傳拯救。冠狀病毒的基因組大，用大容量的載體來搭載其全長cDNA，操作難度大、穩(wěn)定性差。為了避免以上問題，本研究采用了分段克隆、體外連接全長cDNA、體外轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞轉(zhuǎn)染、雞胚增殖的技術(shù)路線。將全基因組分為較小片段分段克隆的策略進(jìn)行研究，分段數(shù)為14個，每個片段大小在2k左右。3kb以內(nèi)的外源片段長度是T載體克隆的最適長度，該設(shè)計(jì)就可以使用常規(guī)的pMD19-T載體就可成功克隆所有片段，且重組質(zhì)粒的穩(wěn)定性高。

圖1 1/4片段連接結(jié)果M為1kb DNA Marker；1-4泳道為1/4片段

本研究通過采用將全基因組分為較小片段進(jìn)行體外擴(kuò)增具有保真性高，能夠在常規(guī)克隆載體中穩(wěn)定復(fù)制的優(yōu)點(diǎn)，利用No See’m技術(shù)體外連接獲得全長，成功獲得了IBV M41株的全長cDNA，通過體外轉(zhuǎn)錄獲得具有感染性的全長RNA將體外轉(zhuǎn)錄物轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞，接種雞胚增殖，成功完成了IBV M41株的拯救，獲得反向遺傳拯救株M41-R。本研究建立了IBV M41這一經(jīng)典強(qiáng)毒株的反向遺傳，完善了IBV的反向遺傳研究，為研究強(qiáng)毒株致病機(jī)理，毒力基因的研究，以及強(qiáng)毒株減弱后疫苗的研發(fā)等提供一個參考。

（3）全長結(jié)果

圖2 全長連接結(jié)果

M為λ -Hind III digest DNA Marker；1：全長IBV M41 cDNA連接產(chǎn)物

（4）EID50測定結(jié)果

接種了反向遺傳拯救株IBVM41-R的SPF雞胚能夠表現(xiàn)出感染IBV的典型癥狀。按Reed-Muench法計(jì)算，M41-R株的EID50為EID50=107.50/0.2ml。與親本毒株一致。

（5）HA結(jié)果

經(jīng)A型魏氏梭菌濾液處理的IBV M41-R毒株尿囊液的雞紅細(xì)胞凝集價為211，與親本毒株IBV M41一致。

4 分析與討論

IBV的基因組不分節(jié)段，整個復(fù)制周期中無DNA中間體的階段。因此，IBV的反向遺傳研究，必須通過構(gòu)建基因組的全長cDNA、轉(zhuǎn)錄獲得感染性的全長基因組RNA以實(shí)現(xiàn)病毒的反向遺

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國家自然科學(xué)基金“禽冠狀病毒（IBV）H120、M41、SAIBk株反向遺傳操作和毒力相關(guān)基因研究”（30972201）、現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)資金（CARS-41-K09）、四川蛋雞產(chǎn)業(yè)鏈項(xiàng)目（2011NZ0073）

李然，碩士，從事微生物分子生物學(xué)研究。

王紅寧，女，教授，博士生導(dǎo)師，從事動物疾病防控、微生物基因工程研究。