反向高效液相色譜法紫外測定纈沙坦含量的方法學(xué)研究

陳嵐 張震華 謝之微

（上海交通大學(xué)附屬瑞金醫(yī)院藥劑科，上海 盧灣200025）

纈沙坦（Valsartan），化學(xué)名為（S）－N－戊?；璑－｛［2′－（1H－5－四氮唑－基－1，1′－聯(lián)苯）－4－基］－甲基｝－纈氨酸。纈沙坦結(jié)構(gòu)中含1個手性碳原子，產(chǎn)品為S－構(gòu)型。結(jié)構(gòu)式見圖1。

圖1 纈沙坦結(jié)構(gòu)Fig 1 Effect of valsartan structure

纈沙坦是一種口服有效的特異性的血管緊張素Ⅱ（AT1）受體拮抗劑［1］，它選擇性地作用于AT1受體亞型，阻斷AngⅡ與AT1受體的結(jié)合（其特異性拮抗AT1受體的作用大于AT2受體約20000倍），從而抑制血管收縮和醛固酮的釋放，產(chǎn)生降壓作用［2］。不作用于血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（ACE）、腎素和其它受體，不抑制與血壓和鈉平衡有關(guān)的離子通道；該品對血管緊張素轉(zhuǎn)換酶沒有抑制作用，不影響體內(nèi)緩激肽水平，因而導(dǎo)致咳嗽的副作用少于血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑。

國家食品藥品監(jiān)督管理局標(biāo)準(zhǔn)（YBH01882012）以及英國藥典（BP2012）纈沙坦標(biāo)準(zhǔn)含量測定方法分別為酸堿滴定法及電位滴定法，見表1。采用酸堿滴定法進(jìn)行含量測定時，對滴定終點(diǎn)顏色判斷不明顯，定量誤差較大，重現(xiàn)性差；采用電位滴定法時，需要N2對滴定過程保護(hù)，操作費(fèi)時，方法復(fù)雜［3］。本文采用高效液相色譜法對含量進(jìn)行控制，結(jié)果該方法專屬性高，方法簡便，快速、準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好，消耗樣品量少。適合作為纈沙坦原料的質(zhì)量控制。本研究中纈沙坦由湖南千金湘江藥業(yè)股份有限公司研制生產(chǎn)。

表1 纈沙坦質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中含量項(xiàng)下的對比Table 1 Comparison on assay determination of Valsartan in quality standards

1 材料與方法

1．1 儀器與試藥 Agilent 1260高效液相色譜儀；UV－762紫外分光光度計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；BS110S電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）。纈沙坦對照品由中國藥品生物制品檢定所提供，批號為100651－201203，含量99．8%；纈沙坦原料6批（批號20121001～20121003，20121101～20121103）由湖南千金湘江藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)。甲醇、乙腈均為色譜純，磷酸氫二鈉為分析純；水為二次重蒸水。

1．2 方法

1．2．1 色譜條件 采用 Waters Symmetry C18柱（150mm×4．6mm，5μm），用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈－水－冰醋酸（500∶500∶1）為流動相；檢測波長為225nm；流速為1．0ml／min。理論板數(shù)按纈沙坦峰計(jì)算應(yīng)不低于4000，纈沙坦與相鄰雜質(zhì)峰的分離度應(yīng)符合要求。

1．2．2 溶液制備 取本品適量，精密稱定，加流動相溶解并定量稀釋制成每1ml約含纈沙坦0．05mg的樣品溶液；另取纈沙坦對照品適量，精密稱定，加流動相溶解并定量稀釋制成每1ml約含纈沙坦0．05mg的對照品溶液。

1．2．3 線性關(guān)系及標(biāo)準(zhǔn)曲線 精密稱定纈沙坦10mg，置50ml量瓶中，用流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過，分別精密量取2．5、2．5、4、5、6和7．5ml，置100、20、20、20、20和20ml量瓶中，制成5、25、40、50、60和75μg／ml 6個濃度范圍，用流動相稀釋至刻度，搖勻。精密量取各溶液10μl，分別注入色譜儀，記錄色譜圖，以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），濃度（μg／ml）為橫坐標(biāo)（X）進(jìn)行線性回歸，回歸方程為Y＝7．266x＋0．0627，r＝0．9999。纈沙坦在5～75μg／ml濃度范圍內(nèi)線性良好。

1．2．4 精密度試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液10μl，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖，分別于第二天、第三天重復(fù)上述操作。主峰峰面積的RSD＝1．1%（n＝18）。說明儀器精密度良好。

1．2．5 重復(fù)性試驗(yàn) 取“1．2．2”項(xiàng)下方法制備的同一份供試品溶液5份，分別再次重復(fù)測定5次，計(jì)算含量，RSD＝1．4%。說明方法的重復(fù)性良好。

1．2．6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取本品適量，精密稱定，用流動相溶解并稀釋至刻度制成每1ml中含0．05mg的溶液。取上述液作為供試品溶液，置室溫下放置，分別于第0、2、4、6、8、10、12h時，測定峰面積，RSD＝0．6%。說明樣品溶液穩(wěn)定性良好。

1．2．7 回收率試驗(yàn) 精密稱取纈沙坦20、25和30mg，分別置50ml容量瓶中，加流動相30ml，用流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液5ml，置50ml量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液；另取纈沙坦對照品適量（以干燥品計(jì)），精密稱定，加流動相溶解并稀釋制成每1ml中約含0．05mg的溶液。按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算供試品中纈沙坦的含量，計(jì)算平均回收率。結(jié)果纈沙坦高、中、低3個加入量的回收率（n＝3）分別為99．96%（RSD＝1．2%）、100．12%（RSD＝1．6%）、100．08%（RSD＝1．4%），平均值（n＝9）為100．06%。

1．2．8 定量項(xiàng) 取線性試驗(yàn)項(xiàng)下濃度為5μg／ml溶液，逐級稀釋對照品溶液，測定樣品峰的峰高，同時測定相同條件下的色譜基線噪聲，取基線噪聲的10倍值為定量限，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖，因此本品定量限為0．5ng（0．1%）。

2 結(jié)果

2．1 HPLC測定纈沙坦含量 取6個批次的樣品各2份，分別按照“1．2．2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按色譜條件測定，結(jié)果見表2、圖2。

表2 纈沙坦含量試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Determination results of assay（HPLC）

圖2 RT＝9．659纈沙坦；RT＝7．428丁?；i沙坦Fig．2 RT＝9．659Stan；RT＝7．428Ding Xianji Stan

2．2 酸堿滴定測定纈沙坦含量 同時取以上樣品，按照中國藥典（2010年版）纈沙坦含量測定方法進(jìn)行酸堿滴定，結(jié)果見表3。

表3 纈沙坦含量試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Determination results of assay（titration）

3 討論

3．1 有資料報道，測定纈沙坦含量的方法中，HPLC法檢測分析纈沙坦的波長為270nm［4］，而藥品纈沙坦試行標(biāo)準(zhǔn)HPLC的檢測波長為230nm。在本試驗(yàn)中，依據(jù)紫外分光光度法，在200～400nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行測定，結(jié)果在225、230、270nm處波長都有吸收，然而在225nm處吸收峰最大，因此將230nm設(shè)定成檢測波長。在流動相不改變的情況下，流速減小，吸收主峰出現(xiàn)時間推遲，增大流速，吸收主峰出現(xiàn)時間縮短；且主吸收峰及雜質(zhì)吸收峰的拖尾因子f、分離度R、理論塔板數(shù)n均滿足規(guī)定。改用其他類型的C18柱，如 Waters Novpak C18柱（150mm×3．9mm，5μm），Waters Symmetry C18柱（250mm×4．6mm，5μm），在不改變流動相的前提下，出峰時間單純只受柱長的影響，短柱出峰時間稍短，長柱出峰時間略長。且主吸收峰及雜質(zhì)吸收峰的拖尾因子f、分離度R、理論塔板數(shù)n均滿足規(guī)定。

3．2 液相色譜法將液體作為流動相。經(jīng)典液相色譜法通常使用普通規(guī)格的流動相以及固定相在常壓下進(jìn)行輸送待測樣品，此種色譜法的分離時間長且柱效不高［5］。采取高效液相色譜法可分析檢測對象廣，柱效高。該方法只要求待測樣品能被制成溶液即可，不需氣化，因而不受樣品揮發(fā)度的限制。尤其是對檢測揮發(fā)度小、對熱不穩(wěn)定、離子型化合物及摩爾質(zhì)量大的化合物有利，例如抗生素、核酸、甾體、蛋白質(zhì)等［6］。

3．3 高效液相色譜分辯率高于其它色譜法，速度快，十幾分鐘到幾十分鐘可完成［7］，重復(fù)性高，自動化操作，分析精確度高。酸堿滴定法是基于酸堿反應(yīng)的滴定分析方法，其操作誤差主要與滴定條件、指示劑、終點(diǎn)判斷以及操作水平等影響因素有關(guān)。

3．4 丁酰基纈沙坦是纈沙坦原料中主要控制雜質(zhì)之一，其與纈沙坦主要區(qū)別在于正丁?；?。在用滴定法進(jìn)行含量測定時，易使含量測定結(jié)果偏高。采用高效液相色譜進(jìn)行含量測定時，纈沙坦與丁?；i沙坦有效分離，含量測定結(jié)果準(zhǔn)確，方法專屬性高，簡便，快速，準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，高效液相色譜法專屬性好，準(zhǔn)確，靈敏，用于纈沙坦含量的測定結(jié)果可靠。

［1］ 劉雪松，劉 偉，門金玉，等．高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法測定人血漿中的纈沙坦［J］．中國新藥雜志，2011，20（14）：1321－1324．

［2］ 姜美華，徐友平，姚國乾，等．纈沙坦對心肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化生長因子和結(jié)締組織生長因子表達(dá)的影響［J］．西部醫(yī)學(xué)，2013，25（4）：493－497．

［3］ 韓俊，馬寶玉，李娟．纈沙坦分散片的制備及含量測定［J］．時珍國醫(yī)國藥，2007，18（1）：145－146．

［4］ 荊小燕，王勇軍，徐麗潔，等．高效液相色譜法測定纈沙坦氨氯地平片中的有關(guān)物質(zhì)［J］．中國新藥雜志，2013，22（019）：2323－2327．

［5］ 廖洪娟，張 濤．高效液相色譜法測定纈沙坦片的含量［J］．中國藥業(yè)，2010，19（9）：36－37．

［6］ 吳娟娟，李玉琴．高效液相色譜法測定纈沙坦氫氯噻嗪分散片中兩組分含量［J］．現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生，2012，27（23）：3532－3534．

［7］ 曲建文，周 艷，李樹波，等．高效液相色譜法檢測纈沙坦膠囊中對映異構(gòu)體［J］．中國藥業(yè)，2012，21（14）：55－57．