異甘草素誘導人黑色素瘤A375細胞凋亡研究

閻新燕，司玲玲，高彩霞，于麗娜，王艷明，鄭秋生，

（1．石河子大學藥學院，新疆特種植物藥資源教育部重點實驗室，新疆石河子 832002，2．濱州醫(yī)學院，山東煙臺 264005）

異甘草素誘導人黑色素瘤A375細胞凋亡研究

閻新燕1，司玲玲1，高彩霞2，于麗娜2，王艷明1，鄭秋生1，2

（1．石河子大學藥學院，新疆特種植物藥資源教育部重點實驗室，新疆石河子 832002，2．濱州醫(yī)學院，山東煙臺 264005）

中國圖書分類號：R284.1；R329.25；R739.502.2

摘要：目的 研究異甘草素誘導人黑色素瘤（A375）細胞凋亡及其初步機制。方法 采用硫氰酸鹽B（SRB）法測定異甘草素對A375細胞生長的抑制效應，AO／EB和Hoechst 33258熒光染色法觀察細胞凋亡形態(tài)，流式細胞技術(shù)檢測A375細胞凋亡率；熒光染料二乙酸-2’，7’-二氯熒光素（DCFH-DA）測定A375細胞內(nèi)活性氧的變化。5，5′，6，6′-四氯-1，1′，3，3′-四乙基苯并咪唑羰花青碘化物（JC-1）測定線粒體膜電勢的變化，利用試劑盒檢測異甘草素處理后的A375細胞內(nèi)ATP和培養(yǎng)液中的乳酸、葡萄糖含量。結(jié)果異甘草素能抑制A375細胞的增殖，并呈濃度依賴性；在熒光顯微鏡下發(fā)現(xiàn)，異甘草素處理后的A375細胞出現(xiàn)明顯的凋亡形態(tài)；細胞凋亡率隨異甘草素濃度的增加而升高；異甘草素處理后的細胞內(nèi)活性氧有明顯上升趨勢，細胞線粒體膜電位明顯下降；異甘草素作用后胞內(nèi)ATP含量下降（P＜0.05 或P＜0.01），培養(yǎng)液中的乳酸含量下降，葡萄糖含量上升（P＜0.05或P＜0.01）。結(jié)論 異甘草素能夠抑制A375細胞的惡性增殖，最終誘導細胞凋亡。推測異甘草素通過活性氧升高，引起線粒體膜電勢下降，從而影響A375細胞的糖酵解途徑而導致細胞凋亡。

關(guān)鍵詞：異甘草素；人黑色素瘤細胞；細胞凋亡；凋亡形態(tài)；活性氧；線粒體膜電位；糖酵解

網(wǎng)絡出版時間：2015－9－14 14：53 網(wǎng)絡出版地址：http：／／www．cnki．net／kcms／detail／34．1086．R．20150914．1453．040．html

人類黑色素瘤尤其是惡性黑色素瘤，是一種明顯抗化療的高轉(zhuǎn)移性腫瘤［1］。經(jīng)過數(shù)十年的治療與研究，盡管黑色素瘤病人的存活率得到很大提高，但黑色素瘤的發(fā)病危險系數(shù)與總體死亡率依舊逐年上升，每年增長率為3%～5%，尤其在成人原發(fā)性腫瘤中增加更快。因此，尋找高效低毒的中藥來改變腫瘤的生物學行為已成為腫瘤治療的重要策略。

異甘草素（isoliquiritigenin，ISL）（結(jié)構(gòu)式見Fig 1）是一種異黃酮類化合物，是甘草中重要的活性成分之一，為黃色針狀結(jié)晶，難溶于水，具有多種藥理活性，諸如抗腫瘤、抗病毒、抗自由基、松弛血管、抑制脂質(zhì)過氧化等［2］。其中抗腫瘤作用是近年來的研究熱點［3］。本實驗選用A375細胞來源于轉(zhuǎn)移性人皮膚黑色素瘤，生長特性為貼壁生長，主要目的在于研究異甘草素誘導人黑色素瘤（A375）細胞凋亡及抑制其增殖的機制，為進一步闡明異甘草素對黑色素瘤治療機制研究提供更多實驗依據(jù)。

Fig 1 Chemical structure of isoliquiritigenin

1　材料與方法

1．1實驗細胞 人黑色素瘤細胞A375，購自中國科學院細胞庫。

1．2主要藥物及試劑 異甘草素（純度98%），江西本草天工科技有限公司；胰蛋白酶，美國Sigma公司，批號509D043；胎牛血清，杭州四季青生物工程材料有限公司，批號140710；DMEM細胞培養(yǎng)基，GIBCO公司，批號1458511；二甲基亞砜（DMSO），批號20140605，磺基羅丹明B，吖啶橙／溴化乙啶，Hoechst 33258均為美國Sigma公司產(chǎn)品；AnnexinV／FITC凋亡檢測試劑盒，南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，批號20140614，ATP，批號A095，乳酸批號A019-2，均為南京建成生物公司研究所產(chǎn)品，葡萄糖試劑盒，北京普利萊基因技術(shù)有限公司，批號E1010。

1．3主要儀器 CO2細胞培養(yǎng)箱（Thermo 3131），美國Thermo公司；超凈工作臺（ZHJH-1112B），上海智誠分析儀器有限公司；倒置熒光顯微鏡（MIC00266），德國ZEISS公司；倒置生物顯微鏡（BDS200-PH），重慶奧特光學儀器有限公司；多功能酶標儀（Thermo 3001），美國Thermo公司；離心機（TGL 16 M）；美國Thermo；電熱恒溫鼓風干燥箱，上海齊欣科學儀器有限公司；超低溫冰箱，美國Ther-mo公司；流式細胞儀，美國BD公司。

2　方法

2．1細胞培養(yǎng) 取生長狀態(tài)良好細胞A375，用含10%胎牛血清、青霉素（終濃度100 kU·L－1）及鏈霉素（終濃度100 mg·L－1）的DMEM培養(yǎng)液（pH＝7.5）在37℃、5%CO2飽合濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細胞進行各項實驗。

2．2異甘草素對細胞抑制率的測定 采用SRB法測定異甘草素對細胞生長抑制效應。取對數(shù)生長期的A375細胞，按每孔1×105個接種于96細胞培養(yǎng)板中，每孔100 μL，24 h后分別加0、10、20、40、60、80、100 μmol·L－1的異甘草素，于細胞培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)48 h。細胞培養(yǎng)結(jié)束后，取出培養(yǎng)板，在每孔液面上加入50%（質(zhì)量／體積）的三氯乙酸（TCA）50 μL固定細胞，TCA的終濃度為10%，然后在4℃冰箱中放置1 h。培養(yǎng)板各孔用去離子水洗滌5遍，以去除TCA。在空氣中干燥后，每孔加0.4%的SRB 100 μL，室溫下放置20 min，棄去各孔內(nèi)液體（回收）后用1%乙酸洗滌5遍，去除未結(jié)合的染料，空氣中干燥后用DMSO（二甲基亞砜）150 μL溶解，在平板振蕩器上振蕩5 min，Thermo 3001多功能酶標儀OD490 nm測量各孔的吸光值［4］。按下式計算藥物對細胞增殖的抑制率：

根據(jù)藥物濃度對應細胞增殖抑制率作線性回歸，根據(jù)直線方程計算藥物對細胞增殖的半數(shù)抑制濃度（IC50）。

2．3倒置顯微鏡觀察異甘草素作用后A375細胞的形態(tài) 取對數(shù)生長期A375細胞，在超凈工作臺上，用吸管吹打細胞瓶壁，制成細胞懸液，細胞計數(shù)并調(diào)整細胞懸液的濃度為2×105個接種在6孔板上，每孔加2 mL，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)24 h后，加藥異甘草素，其終濃度分別為0、60、80和100 μmol·L－1，藥物作用48 h后，分別在倒置顯微鏡下拍照觀察其形態(tài)的變化。

2．4AO／EB法觀察凋亡形態(tài) AO能透過胞膜完整的細胞，嵌入細胞核DNA，使之發(fā)出明亮的綠色熒光。EB僅能透過胞膜受損的細胞，嵌入核DNA，發(fā)橘紅色熒光。在熒光顯微鏡下可見4種細胞形態(tài)：活細胞、早期凋亡細胞、非凋亡的死亡細胞，晚期凋亡細胞。取對數(shù)期細胞消化制成細胞懸液，按每孔2×105個置于預先置入玻璃蓋玻片的6孔培養(yǎng)板中，每孔加細胞懸液2 mL，24 h后，加入異甘草素（0、60、80、100 μmol·L－1）孵育48 h后，吸盡培養(yǎng)液對細胞消化，將培養(yǎng)細胞用PBS離心洗滌2次。取60 μL AO（100 mg·L－1）和EB（100 mg·L－1）等體積混勻制成AO／EB熒光染液，與1.14 mL PBS混合，使AO／EB終濃度為5 mg·L－1在熒光顯微鏡下觀察細胞形態(tài)［5］。

2．5Hoechst 33258熒光法觀察細胞形態(tài) Ho-echst為膜通透性的熒光染料，正常細胞和中早期凋亡細胞均可被Hoechst著色，取對數(shù)期細胞消化制成細胞懸液，按每孔2×105個置于預先置入玻璃蓋玻片的6孔培養(yǎng)板中，每孔加細胞懸液2 mL，24 h后，加入異甘草素（0、60、80、100 μmol·L－1）孵育48 h后，吸盡培養(yǎng)液，PBS洗2遍，每孔加入1 mL固定液（甲醇∶冰醋酸＝3∶1），固定15 min，去除固定液，用PBS洗2遍，用將蓋玻片放于載玻片之上在熒光顯微鏡下觀察細胞內(nèi)凋亡情況［6］。

2．6流式細胞技術(shù)檢測細胞凋亡率 取對數(shù)期細胞消化制成細胞懸液，按2×105個置于細胞培養(yǎng)瓶

內(nèi)，每瓶加細胞懸液2 mL，24 h后，加入異甘草素（0、40、60、80、100 μmol·L－1）孵育48 h后收集經(jīng)不同濃度處理后的細胞，用冷PBS洗1遍后置0℃水浴中，加500 μL Binding Buffer懸浮細胞，再加入5 μL AnnexinV和5 μL PI，輕輕混勻細胞，10 min后進行流式細胞儀檢測［7］。

2．7異甘草素對A375細胞內(nèi)ROS水平的影響取對數(shù)生長期的A375細胞，按每孔1×105個接種于96細胞培養(yǎng)板中，每孔100 μL，24 h后分別加入0、40、60、80、100 μmol·L－1的異甘草素，于細胞培養(yǎng)箱分別培養(yǎng)2、4、6、12 h。終止培養(yǎng)，吸盡培養(yǎng)基，加入終濃度30 μmol·L－1DCFH-DA，50 μL，37℃孵育30 min后，PBS沖洗，在激發(fā)光波長485 nm，發(fā)射光波長535 nm測定細胞熒光強度。用DCF絕對熒光值／SRB絕對熒光值×100%作為細胞ROS相對含量［8］。

2．8線粒體膜電勢測定 取對數(shù)生長期的A375細胞，按每瓶1×106個接種于細胞培養(yǎng)瓶中，24 h后分別加入0、40、60、80、100 μmol·L－1的異甘草素，細胞接種24 h后，消化細胞，取1×106個細胞，離心（1 500×g×5 min），棄上清液，加2 mL PBS緩沖液潤洗1次，加100 μL的10 μmol·L－1JC-1熒光染料混勻、重懸細胞，將細胞于37℃水浴中水浴20 min，用PBS洗2次，洗去未結(jié)合的熒光染料，多功能酶標儀及流式細胞儀分別進行線粒體膜電勢檢測，用紅色／綠色熒光強度比值來衡量線粒體去極化程度［9］。

2．9異甘草素對A375細胞ATP生成的影響 取對數(shù)期細胞消化制成細胞懸液，按2×105個置于細胞培養(yǎng)瓶內(nèi)，每瓶加細胞懸液2 mL，24 h后，加入異甘草素0、40、60、80、100 μmol·L－1孵育24、48 h后，收集經(jīng)不同濃度處理后的細胞，利用南京建成生物公司研究所A095 ATP試劑盒測定。

2．10異甘草素對A375細胞乳酸含量影響 取對數(shù)期細胞消化制成細胞懸液，按2×105個置于細胞培養(yǎng)瓶內(nèi)，每瓶加細胞懸液2 mL，24 h后，加入異甘草素0、40、60、80、100 μmol·L－1孵育24、48 h后，根據(jù)前期研究方法，離心收集上清液，按照南京建成生物公司研究所A019-2乳酸測試盒說明書測定。

2．11異甘草素對A375細胞葡萄糖攝入的影響取對數(shù)期細胞消化制成細胞懸液，按2×105個置于細胞培養(yǎng)瓶內(nèi)，每瓶加細胞懸液2 mL，24 h后，加入異甘草素0、40、60、80、100 μmol·L－1孵育24、48 h后，根據(jù)前期研究方法，離心收集上清液，按照北京普利萊基因技術(shù)有限公司，E1010，葡萄糖氧化酶（GOD）測試盒說明書測定。

3　結(jié)果

3．1異甘草素抑制A375細胞增殖 在對數(shù)生長期的A375細胞中，分別加入不同濃度的異甘草素（0、10、20、40、60、80、100 μmol·L－1）繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，如Fig 2所示，細胞抑制率分別為（12.59± 3.22）%、（21.63±4.28）%、（41.21±2.96）%、（43.97±1.38）%、（49.61±0.53）%和（55.75± 0.29）%。IC50為（82.01±1.23）μmol·L－1，隨著異甘草素濃度增加，抑制率上升，且呈濃度依賴性。

Fig 2 Effect of isoliquiritigenin on A375 cell inhibition rate（n＝3）

3．2異甘草素誘導A375細胞出現(xiàn)凋亡形態(tài) 對照組細胞經(jīng)AO／EB染色，細胞核的DNA為均勻黃綠色熒光；經(jīng)異甘草素處理后，核染色質(zhì)出現(xiàn)固縮狀（60 μmol·L－1）；細胞核內(nèi)可見致密濃染的黃綠色熒光早期凋亡細胞（60 μmol·L－1）；隨異甘草素濃度升高，核染色質(zhì)出現(xiàn)圓珠狀的橘紅色熒光（80 μmol·L－1），細胞數(shù)量也逐漸減少，細胞出現(xiàn)晚期凋亡（100 μmol·L－1）。

由于AO／EB雙染不穩(wěn)定，熒光易淬滅，因此我們又采用熒光比較穩(wěn)定的Hoechst 33285染料對異

甘草素誘導的細胞凋亡進行形態(tài)學檢測，經(jīng)Hoechst染色后，在對照組中細胞大而飽滿，呈均勻藍色熒光；在異甘草素處理組中細胞核可見濃染致密的顆粒熒光，細胞縮小（60 μmol·L－1）；隨異甘草素濃度的增加，細胞出現(xiàn)典型的凋亡形態(tài)，高倍鏡下可觀察到細胞變小，胞核皺縮、碎裂，染色質(zhì)濃縮，聚集在核膜邊緣，形成染色質(zhì)邊集（80、100 μmol·L－1）。

Fig 3 （A）Changes of A375 treated with isoliquiritigenin 48h（×200）；（B）Apoptosis visualized by appropriate changes of nuclei stained with AO／EB （×200）；（C）Effect of isoliquiritigenin on morphological changes in B16F10 cells observed by Hochest（×200）

Fig 4 Evaluation of apoptosis in A375 cells by FACS analysis（n＝3）

3．3異甘草素誘導A375細胞凋亡率明顯升高AnnexinV／PI雙染法結(jié)果顯示，用不同濃度異甘草素（0、40、60、80、100 μmol·L－1）處理A375細胞48 h后，細胞總凋亡率分別為（21.02±3.15）%、（41.65±1.42）%、（45.35±5.68）%、（67.77± 4.25）%，與對照組（14.95±1.23）%相比，呈明顯濃度依賴性，上述結(jié)果與熒光顯微鏡和相差顯微鏡下觀察到的結(jié)果相一致，即不同濃度異甘草素作用于A375細胞48 h后，隨著濃度增高，細胞凋亡數(shù)目

增加。

Fig 5 （A）ROS production induced by different concentrations of ISL 12h（×200）．（B）ISL increases intracelluar ROS levels in A375 cells in differ-ent time and concentrations（n＝3）．P＜0.05，P＜0.01 vs control group cells

Fig 6 Isoliquiritigenin induced A375 cell mitochondrial membrane potential decreased（n＝3）

3．4異甘草素使A375細胞內(nèi)ROS水平升高 不同濃度異甘草素（0、40、60、80、100 μmol·L－1）作用于A375細胞2、4、6、12 h后，可以誘導細胞內(nèi)總活性氧（ROS）水平明顯升高（P＜0.05或P＜0.01），并呈濃度依賴關(guān)系，根據(jù)光學顯微鏡下拍照觀察，異甘草素作用于A375細胞12 h后，隨著濃度增加，熒光強度增強。

3．5異甘草素誘導A375細胞線粒體膜勢能下降經(jīng)異甘草素處理A375細胞24 h后，JC-1染色結(jié)果表明，不同濃度異甘草素處理組紅、綠色熒光的比值降低，線粒體膜電勢降低，并呈現(xiàn)出濃度依賴關(guān)系，通過流式細胞儀檢測結(jié)果顯示，隨著藥物濃度增高膜電位降低，部分以單體形式存在發(fā)綠色熒光，與酶標儀檢測結(jié)果相符。

3．6異甘草素抑制A375細胞ATP的生成 異甘草素處理A375細胞24、48 h，可降低細胞ATP含量且具有濃度依賴性，作用A375細胞24 h加藥組100

μmol·L－1及48 h加藥組60、80、100 μmol·L－1與對照組相比差異有顯著性。

Fig 7 Effects of isoliquiritigenin on A375 intracellular ATP contents（n＝3）

Fig 8 Content of lactic acid in medium of A375 detected by a lactic acid assay kit（n＝3）

Fig 9 Effects of isoliquiritigenin on cell culture fluid glucose contents（n＝3）

（致謝：本研究在石河子大學藥學院新疆特種植物藥資源教育部重點實驗室完成。感謝導師鄭秋生老師和在本課題研究中給予我關(guān)懷和支持的同學，他們開創(chuàng)性的研究拓展

3．7異甘草素抑制A375細胞乳酸生成 異甘草素處理A375細胞24、48 h后，可降低細胞培養(yǎng)液LD含量且具有濃度依賴性，作用A375細胞24及48 h后，加藥組80、100 μmol·L－1與對照組相比差異有顯著性。

3．8異甘草素抑制A375細胞葡萄糖攝入 異甘草素處理A375細胞24、48 h后，測定細胞培養(yǎng)液中的葡萄糖水平，實驗表明異甘草素作用A375細胞24 h后隨著異甘草素濃度的升高，培養(yǎng)液中葡萄糖濃度明顯上升且呈濃度依賴性，作用A375細胞48 h后，較24 h培養(yǎng)液中的濃度明顯升高，說明異甘草素可以降低細胞對葡萄糖的攝取。

4　討論

凋亡（apoptosis）是細胞死亡的一種特殊方式，是細胞內(nèi)外環(huán)境改變或死亡信號觸發(fā)涉及一系列基因的激活、表達及調(diào)控等作用的細胞主動死亡過程［10］。

糖酵解是葡萄糖在酶的催化下降解成丙酮酸或乳酸并生成ATP的過程，又稱EMP，發(fā)生在細胞質(zhì)中［11］。ATP和乳酸這兩者的改變決定著糖酵解途徑的改變，腫瘤細胞即使在常氧條件下仍依賴糖酵解產(chǎn)生ATP來進行增殖，因此抑制糖酵解主要是要降低細胞內(nèi)ATP水平。

在研究濃度范圍內(nèi)，異甘草素能明顯抑制A375細胞的增殖，且具有濃度依賴性，流式細胞檢測中，細胞的凋亡率可達到67.77%；結(jié)果顯示，異甘草素可以誘導胞質(zhì)ROS升高，通過感應使線粒體內(nèi)ROS增加，引起線粒體膜電勢下降，線粒體膜電位改變是細胞凋亡的重要指標之一，綜上所述，異甘草素作用于A375細胞主要形式是凋亡。

為了進一步研究異甘草素誘導人黑色素瘤細胞凋亡的機制，根據(jù)大量文獻表明，在缺氧條件下活性氧的產(chǎn)生能夠間接作用于丙酮酸脫氫酶激酶（PDK）［12］，實驗結(jié)果顯示，異甘草素作用于A375細胞，可減少細胞內(nèi)的ATP含量和培養(yǎng)液中乳酸含量，并且可以抑制細胞對葡萄糖的攝取，這表明異甘草素確實可以抑制A375細胞糖酵解途徑，推測其作用機制為抑制丙酮酸脫氫酶激酶的活性。

以上結(jié)果表明異甘草素能夠明顯抑制A375細胞的惡性增殖以及誘導細胞的凋亡，但異甘草素對其中糖酵解途徑的作用機制還有待于更深一步的研究。

了我的學術(shù)視野，創(chuàng)造了團結(jié)而上進的科研氛圍，使我的科研工作進展順利，謹此向我的導師鄭秋生博士和實驗室全體同學致以衷心的感謝?。?/p>

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Isoliquiritigenin induced apoptosis in human melanoma A375 cells

YAN Xin-yan1，SI Ling-ling1，GAO Cai-xia2，YU Li-na2，WANG Yan-ming1，ZHENG Qiu-sheng1，2
（1．Key Laboratory of Xinjiang Endemic Phytomedicine Resources，Ministry of Education，School of Pharmacy，Shihezi University，Shihezi Xinjiang 832002，China；2．Binzhou Medical University，Yantai Shandong 264005，China）

Abstract：Aim To evaluate the mechanism of apopto-sis induced by the isoliquiritigenin in A375 human ma-lignant melanoma cells．Methods Sulforhodamine B （SRB）method was used to determine the A375 cell viability；acridine orange／ethidium bromide（AO／EB）and Hoechst 33258 staining were used to observe the morphological changes of apoptotic cells；flow cytome-try was used to detect A375 cell apoptotic rate；DCFH-DA was applied to determine the changes of total intra-cellular ROS in A375 cells；JC-1 method was used to measure the changes of mitochondrial membrane poten-tial；the kits methods were used to determine the con-tent of ATP，lactic acid and glucose in A375 cell which was treated with different concentrations of isoliquiritigenin．Results Isoliquiritigenin could in-hibit A375 cell proliferation in a concentration-depend-ent manner；A375 cells showed obvious apoptosis charateristics after treatment by isoliquiritigenin，and the apoptosis rate increased with increasing concentra-tion of isoliquiritigenin．The level of total intracellular ROS in A375 cells increased obviously after dealing with different concentrations of isoliquiritigenin；in ad-dition，the mitochondrial membrane potential，the lev-els of intracellular ATP，lactic acid and the level of glu-cose uptake all declined．Conclusions These find-ings demonstrate that isoliquiritigenin can induce apop-tosis of A375 cells．The mechanism may be related to elevation of ROS level and reduction of aerobic glycoly-sis level．

Key words：isoliquiritigenin；human melanoma cells；cell apoptosis；apoptotic morphology ROS；apoptotic morphology；mitochondrial membrane potential；gly-colysis

作者簡介：閻新燕（1991－），女，碩士，研究方向：腫瘤藥理學，E-mail：410701504＠qq．com；鄭秋生（1968－），男，博士后，教授，研究方向：藥理學，通訊作者，E-mail：zqsyt＠sohu．com

基金項目：國家自然科學基金資助項目（No 31471338）；科技部科技型中小企業(yè)創(chuàng)業(yè)投資引導基金（No 13C26216516410）兵團重點領(lǐng)域創(chuàng)新團隊資助項目（2015BD005）

收稿日期：2015－06－04，修回日期：2015－08－12

文獻標志碼：A

文章編號：1001－1978（2015）10－1426－07

doi：10．3969／j．issn．1001－1978．2015．10．020