人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞TGFβ-1基因沉默對肝癌細(xì)胞的影響

李天然, 趙紹宏, 周軍, 魏正茂, 霍天龍, 盧光明

(1. 南京軍區(qū)福州總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院 放射科, 福建 莆田, 351100;

2. 北京大學(xué)人民醫(yī)院 放射科, 北京, 100044;

3. 解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院 放射科, 北京, 100048;

4. 南京總醫(yī)院 放射科, 江蘇 南京, 210002)

人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞TGFβ-1基因沉默對肝癌細(xì)胞的影響

李天然1,3, 趙紹宏1, 周軍1, 魏正茂2, 霍天龍2, 盧光明4

(1. 南京軍區(qū)福州總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院 放射科, 福建 莆田, 351100;

2. 北京大學(xué)人民醫(yī)院 放射科, 北京, 100044;

3. 解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院 放射科, 北京, 100048;

4. 南京總醫(yī)院 放射科, 江蘇 南京, 210002)

摘要:目的探討人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(hMSC)TGFβ-1基因沉默對對肝癌細(xì)胞的影響。方法構(gòu)建TGFβ-1為靶向基因的mRNA和siRNA表達(dá)質(zhì)粒，病毒轉(zhuǎn)染。Transwell 法檢測MHCC97-H侵襲能力。細(xì)胞計(jì)數(shù)法 (CCK-8)檢測細(xì)胞增殖能力。PCR檢測腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)因子OPN表達(dá)，并分析與腫瘤侵襲的關(guān)系。結(jié)果hMSC基因沉默成功, TGFβ-1表達(dá)降低。共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組MHCC97-H細(xì)胞的增殖能力前后比較無顯著(P>0.05)。侵襲性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組具有明顯的促進(jìn)肝癌細(xì)胞侵襲的作用(P<0.05), 且hMSC組較TGFβ-1沉默hMSC組更能促進(jìn)肝癌細(xì)胞侵襲的作用(P<0.001)。共培養(yǎng)后腫瘤細(xì)胞的OPN表達(dá)下降。腫瘤細(xì)胞的OPN表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的侵襲性呈顯著正相關(guān)。結(jié)論TGFβ-1基因沉默對肝癌細(xì)胞的增殖能力無明顯影響，對肝癌細(xì)胞的侵襲能力具有明顯促進(jìn)作用，肝癌細(xì)胞OPN表達(dá)變化不是肝癌侵襲能力變化的關(guān)鍵因子。

關(guān)鍵詞:人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞; 基因沉默; 骨橋蛋白; 高轉(zhuǎn)移潛能肝癌細(xì)胞

Influence of TGFβ-1 gene silencing of human bone

腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移涉及多基因變化和相互作用，生長和轉(zhuǎn)移抑制基因可能在抑制腫瘤轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用。人腫瘤轉(zhuǎn)化生長因子基因(TGF)其作用包括調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移。TGF家族中TGFβ-1對腫瘤細(xì)胞的生長具有促進(jìn)和抑制雙重生物學(xué)效應(yīng)，在腫瘤發(fā)生早期, TGFβ-1通過抑制腫瘤細(xì)胞生長而抑制轉(zhuǎn)移的發(fā)生，隨著腫瘤的發(fā)展, TGFβ-1轉(zhuǎn)變成腫瘤生長刺激因子，促進(jìn)轉(zhuǎn)移[1-2]?；赥GFβ-1生物學(xué)特性，本研究設(shè)計(jì)利用基因修飾技術(shù)將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(hMSC)中的TGFβ-1基因沉默，使hMSC低表達(dá)TGFβ-1，觀察經(jīng)基因修飾的hMSC對高轉(zhuǎn)移潛能肝癌細(xì)胞的影響，為基于自體干細(xì)胞移植的生物治療提供探索性研究。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞株、儀器與試劑

人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(hMSC)由賽業(yè)(廣州)生物科技有限公司提供，人高轉(zhuǎn)移潛能肝癌細(xì)胞(MHCC97-H), 購自上海復(fù)旦大學(xué)肝癌研究所提供。倒置顯微鏡(OLYMPUS公司1X71), 二氧化碳孵箱(Nuaire公司NU4750E)。轉(zhuǎn)染試劑: Lipofectamine 2000，轉(zhuǎn)染細(xì)胞: 293FT, 培養(yǎng)液: H-DMEM+10% FBS，轉(zhuǎn)染混合液: Opti-MEMI。

1.2質(zhì)粒構(gòu)建

構(gòu)建以人TGFβ-1為靶向基因的mRNA和siRNA表達(dá)質(zhì)粒, pLenti X1 Puro-shTGFβ-1-eGFP, 以綠色熒光蛋白(GFP)為報(bào)告基因。

1.3病毒包裝

取細(xì)胞狀態(tài)良好，處于對數(shù)生長期的293FT細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)后，按照每個(gè)10 cm的培養(yǎng)皿5×106個(gè)細(xì)胞數(shù)接種于培養(yǎng)皿中, 37 ℃, 5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜; 24 h轉(zhuǎn)染前去除舊的培養(yǎng)液，加入5 mL新鮮的含10%血清DMEM培養(yǎng)液；制備DNA-Lipofectamine 2000復(fù)合物。將DNA-Lipofectamine 2000復(fù)合物逐滴添加到293FT細(xì)胞中，輕輕地前后搖晃培養(yǎng)皿以混勻復(fù)合物。放置37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)；轉(zhuǎn)染后24 h, 更換10 mL含10%血清DMEM培養(yǎng)液。放置37 ℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)；轉(zhuǎn)染后48 h收集培養(yǎng)上清進(jìn)行濃縮；加入10 mL新鮮的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染后72 h再次收集濃縮。

1.4結(jié)晶紫染色計(jì)算病毒滴度

去除培養(yǎng)液，用PBS洗滌細(xì)胞2次。加入中性甲醛，每孔0.5 mL, 固定30 min; 去除中性甲醛，用PBS洗滌細(xì)胞2次，加入結(jié)晶紫染色液(6孔板每孔0.5 mL), 并放置室溫孵育10 min; 去除染色液，用PBS洗滌細(xì)胞2次；計(jì)數(shù)被染成藍(lán)色的克隆數(shù)目，并計(jì)算病毒滴度。

1.5MHCC97-H與hMSC/shTGFβ-1轉(zhuǎn)導(dǎo)

細(xì)胞的共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)方法

研究分為實(shí)驗(yàn)組和對照組。 實(shí)驗(yàn)組設(shè)2組，MHCC97-H細(xì)胞與hMSC共培養(yǎng)組，和MHCC97-H細(xì)胞與shTGFβ-1基因沉默hMSC共培養(yǎng)組，空白對照組為MHCC97-H細(xì)胞與培養(yǎng)基共培養(yǎng)。

1.5.1Transwell法MHCC97-H侵襲能力檢測：取BD基質(zhì)膠，用完全培養(yǎng)基稀釋，按8.68 μg/cm2的濃度鋪至Transwell六孔板的上室, 37 ℃孵育2 h, 吸去BD基質(zhì)膠。復(fù)蘇肝癌細(xì)胞MHCC97-H培養(yǎng)，常規(guī)培養(yǎng)48 h, 換液，備用。hMSC或hMSC/shTGFβ-1培養(yǎng)培養(yǎng)至第3代，備用。實(shí)驗(yàn)組將培養(yǎng)hMSC或hMSC/shTGFβ-1按1×106濃度接種于Transwell共培養(yǎng)系統(tǒng)下室，再將Transwell的上室置于孔中，在上室內(nèi)接種MHCC97-H細(xì)胞，使上下室的培養(yǎng)液相互融通，建立起hMSC或hMSC/shTGFβ-1與MHCC97-H細(xì)胞的共培養(yǎng)體系。對照組MHCC97-H按1×106濃度接種于Transwell共培養(yǎng)系統(tǒng)的上室，Transwell下室加入單純DMEM培養(yǎng)基為對照。實(shí)驗(yàn)組與對照組實(shí)驗(yàn)細(xì)胞培養(yǎng)48 h，分別取出共培養(yǎng)上室，吸去上室的培養(yǎng)基，并用PBS洗2次；用預(yù)冷的多聚甲醛固定上室的細(xì)胞，室溫固定30 min, 吉姆薩染色30 min后，用純凈水漂洗干凈，計(jì)數(shù)上室遷移至Matrigel膜下的細(xì)胞數(shù)，顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野進(jìn)行拍攝(200倍)，計(jì)數(shù)每個(gè)視野的平均細(xì)胞數(shù)量，細(xì)胞計(jì)數(shù)作為MHCC97-H細(xì)胞侵襲能力檢測的指標(biāo)。

1.5.2細(xì)胞計(jì)數(shù)(Cell Counting Kit-8)法MHCC97-H增殖能力檢測：待下室細(xì)胞(hMSC或hMSC/shTGFβ-1)均貼壁后，96孔板上室每孔2×103的細(xì)胞量進(jìn)行接種MHCC97-H細(xì)胞，共培養(yǎng)48 h后，取出上室板，每孔加入8 μL的CCK-8溶液, 37 ℃孵育4 h, 孵育完畢后，進(jìn)行吸光度值(OD)450 nm讀數(shù)。

1.6實(shí)時(shí)定量基因擴(kuò)增熒光檢測系統(tǒng)qPCR

檢測

首先檢測經(jīng)TGFβ-1基因修飾的hMSC TGFβ-1的表達(dá)。然后，檢測經(jīng)基因修飾的hMSC與MHCC97-H細(xì)胞共培養(yǎng)前后轉(zhuǎn)移相關(guān)因子OPN的表達(dá)變化。

1.6.1引物設(shè)計(jì)序列：引物序列來自GenBank數(shù)據(jù)庫，由賽業(yè)(廣州)生物科技公司合成。

① 以人肌動(dòng)蛋白β-Actin作為內(nèi)參照物(internal control)

Forward primer: 5′-GCAGAAGGAGATCACAGCCCT-3′;

Reverse primer: 5′-GCTGATCCACATCTGCTGGAA-3′。

② 人腫瘤生長因子(TGFβ-1):

Forward primer: 5- AGTGGTTGAGCCGTGGAG-3

Reverse primer: 5-TGCAGTGTGTTATCCCTGCT-3;

③ 人骨橋蛋白(OPN):

Forward primer: 5′-TCACCAGTCTGATGAGTCTCAC-3′;

Reverse primer: 5′-CAGGTCTGCGAAACTTCTTAGAT-3′

1.6.2實(shí)驗(yàn)方法: MHCC97-H細(xì)胞的RNA提取，細(xì)胞裂解，加入200 μL氯仿，離心； 吸取400 μL上層水相，加入500 μL的異丙醇，離心，去廢液，加入1 mL無水乙醇洗滌RNA沉淀；離心，去廢液；加入20 μL DEPC水溶解RNA沉淀。合成cDNA：在去除了DNA污染的RNA樣品中加入oligo (dT)18 primer 1 μL, 70 ℃孵育5 min; 按照順序加入: 5× reaction buffer 4 μL; 10 mmol/L dNTP mix 2 μL; RiboLock RNase Inhibitor (20 U/μL) 1 μL; 37 ℃孵育溫浴5 min; 加入RevertAid M-MuLV Reverse Transcriptase (200 U/μL) 1 μL; 42 ℃孵育60 min, 70 ℃孵育10 min。特異性引物聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增相應(yīng)的cDNA。PCR條件: 預(yù)變性95 ℃, 5 min; 變性94 ℃, 30 s, 退火58 ℃, 30 s, 延伸72 ℃, 30 s, 共40個(gè)循環(huán), 最后72 ℃, 10 min。PCR產(chǎn)物電泳并經(jīng)凝膠電泳處理系統(tǒng)掃描半定量分析。

2結(jié)果

2.1TGFβ-1基因沉默hMSC實(shí)驗(yàn)結(jié)果

qPCR檢測TGFβ-1沉默基因hMSC前后TGFβ-1基因表達(dá)： 以hMSC組TGFβ-1表達(dá)為100%, TGFβ-1沉默基因hMSC表達(dá)為83.83%, 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001), 表明hMSC基因沉默成功。

2.2CCK-8法檢測hMSC及基因沉默hMSC

細(xì)胞對MHCC97-H細(xì)胞增殖能力的影響

以MHCC97-H細(xì)胞作為空白對照，TGFβ-1基因沉默hMSC組OD值(0.303±0.02), hMSC共培養(yǎng)組(0.36±0.04), 空白對照組(0.31±0.07), 組間比較無顯著差異(F=2.274,P=0.137), 兩實(shí)驗(yàn)組與對照組比較均無顯著差異(見圖1)。

圖1 經(jīng)基因修飾前后的hMSC與MHCC97-H細(xì)胞共培養(yǎng)前后增殖能力比較

結(jié)果顯示，hMSC與MHCC97-H細(xì)胞共培養(yǎng)后，與對照組比較無顯著差異(P>0.05), TGFβ-1沉默hMSC組與MHCC97-H細(xì)胞培養(yǎng)后，與對照組比較無顯著差異(P>0.05)。表明經(jīng)基因修飾前后的hMSC對MHCC97-H細(xì)胞增殖能力無影響。

2.3Transwell法hMSC及TGFβ-1沉默hMSC

細(xì)胞對MHCC97-H細(xì)胞侵襲能力的影響

采用細(xì)胞計(jì)數(shù)法進(jìn)行定量。TGFβ-1基因沉默hMSC組侵襲細(xì)胞數(shù)(52.00±12.52)個(gè)/視野，hMSC共培養(yǎng)組(70.33±19.11), 空白對照組(27.00±7.80), 組間比較有顯著差異(F=14.617,P=0.000), 兩組實(shí)驗(yàn)組與對照組比較均有顯著差異(P< 0.05)(見圖2)。

**P<0.001;*P<0.05圖2 經(jīng)基因修飾前后的hMSC與MHCC97-H細(xì)胞共培養(yǎng)前后侵襲能力比較

結(jié)果顯示, hMSC與MHCC97-H細(xì)胞共培養(yǎng)后，與對照組比較具有明顯的促進(jìn)肝癌細(xì)胞侵襲的作用(P<0.001), TGFβ-1沉默hMSC組與MHCC97-H細(xì)胞培養(yǎng)后，與對照組比較也具有促進(jìn)細(xì)胞侵襲的作用(P<0.05), 且hMSC較TGFβ-1沉默hMSC組更能促進(jìn)肝癌細(xì)胞侵襲的作用(P<0.05)。

2.4TGFβ-1沉默hMSC與MHCC97-H共培養(yǎng)前后, MHCC97-H細(xì)胞侵襲結(jié)果與轉(zhuǎn)移相關(guān)因子OPN表達(dá)間的相關(guān)性分析

PCR結(jié)果顯示，共培養(yǎng)后MHCC97-H細(xì)胞OPN表達(dá)均有所下降，以MHCC97-H細(xì)胞表達(dá)為100%, hMSC共培養(yǎng)組OPN表達(dá)為63.96%, shTGFβ-1沉默hMSC組為17.10%。shTGFβ-1沉默hMSC組MHCC97-H細(xì)胞OPN表達(dá)與侵襲細(xì)胞數(shù)量呈明顯的正相關(guān)性(r=0.865,P=0.026); hMSC組MHCC97-H細(xì)胞OPN表達(dá)與侵襲細(xì)胞數(shù)量呈明顯的正相關(guān)性(r=0.945,P=0.004)(見圖3)。

圖3MHCC97-H細(xì)胞OPN表達(dá)與侵襲細(xì)胞數(shù)量的相關(guān)散點(diǎn)圖

結(jié)果顯示, hMSC在基因修飾前后共培養(yǎng)后影響MHCC97-H細(xì)胞OPN的表達(dá)。OPN與MHCC97-H細(xì)胞的侵襲數(shù)量呈明顯的正相關(guān)性。

3討論

siRNA干擾是從mRNA水平阻斷功能基因表達(dá)的新技術(shù)，在基因功能的研究和臨床靶向治療中的應(yīng)用日益廣泛[3-5]。對hMSC進(jìn)行基因修飾，觀察經(jīng)基因修飾的hMSC對腫瘤的影響，為以自體干細(xì)胞移植為重點(diǎn)的生物治療提供基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)依據(jù)[6]。轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGFβ-1)是一種具有多種功能的細(xì)胞因子。研究認(rèn)為TGFβ是細(xì)胞生長抑制因子,可抑制上皮細(xì)胞的增殖，對細(xì)胞周期的調(diào)控是TGFβ細(xì)胞生長抑制作用的重要機(jī)制，對于不同類型的細(xì)胞調(diào)控的具體機(jī)制也不同，細(xì)胞逃逸TGFβ的生長抑制作用而導(dǎo)致細(xì)胞增殖失控、腫瘤發(fā)生[7]。然而，腫瘤發(fā)生后, TGFβ成為促進(jìn)腫瘤生長的因子，TGF-β主要通過免疫抑制逃逸、增加血管生成、增加腫瘤細(xì)胞與胞外基質(zhì)的相互作用來促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移[8-9]。

基于hMSC是基因良好載體這一特性，通過基因修飾技術(shù)改變hMSC細(xì)胞中TGFβ-1基因，使TGFβ-1因子表達(dá)下降，觀察經(jīng)基因修飾的hMSC細(xì)胞對高轉(zhuǎn)移潛能肝癌細(xì)胞(MHCC97-H)的影響。實(shí)時(shí)PCR檢測結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組hMSC中TGFβ-1表達(dá)下降，表明hMSC中TGFβ-1基因沉默成功。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，hMSC在TGFβ-1基因沉默前后對MHCC97-H細(xì)胞增殖能力無明顯影響，表明外源性TGFβ-1表達(dá)(hMSC分泌)變化對腫瘤細(xì)胞(MHCC97-H)增殖無明顯作用，這與文獻(xiàn)報(bào)道的腫瘤患者主要是通過TGFβ-1的自分泌促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長的結(jié)論相一致[10-11], 只有MHCC97-H細(xì)胞分泌的內(nèi)源性TGFβ-1因子的變化才會(huì)影響腫瘤細(xì)胞的增殖。也有研究[12]認(rèn)為，腫瘤表面TGFβ受體缺失或功能異常，導(dǎo)致TGFβ-1正常促進(jìn)或抑制腫瘤增殖的功能失調(diào)。

Transwell侵襲小室技術(shù)是利用Matrigel模擬天然基底膜結(jié)構(gòu),觀察具有侵襲和遷移能力的細(xì)胞在趨化劑誘導(dǎo)下穿過多孔濾膜的情況[13-14]。MHCC97-H侵襲性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，MHCC97-H與hMSC細(xì)胞共培養(yǎng)后，侵襲能力明顯增強(qiáng), TGFβ-1基因沉默hMSC對MHCC97-H侵襲能力仍然明顯高于空白對照組，表明hMSC具有促進(jìn)肝癌細(xì)胞侵襲的作用[15]。腫瘤細(xì)胞的侵襲能力依賴于細(xì)胞間連接的丟失和成纖維細(xì)胞特性的獲得, 此過程被稱為上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)[16]。TGF-β信號(hào)通路介導(dǎo)的EMT被認(rèn)為促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。TGF-β通過上調(diào)細(xì)胞外基質(zhì)纖溶酶激活因子(PA), 如尿激酶(uPA)降解細(xì)胞外基質(zhì),促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[17-18]。因此，外源性的TGF-β可能通過上述因子，促進(jìn)實(shí)驗(yàn)中Matrigel膜的溶解起到促進(jìn)細(xì)胞侵襲的作用。

OPN檢測結(jié)果提示, OPN與腫瘤的侵襲性呈正相關(guān)，這與文獻(xiàn)報(bào)道相一致[19-20]。在本研究中，共培養(yǎng)后, MHCC97-H細(xì)胞OPN表達(dá)下降，而腫瘤細(xì)胞的侵襲性明顯增高，說明腫瘤侵襲行為是多因素共同作用的結(jié)果，非單一因素作用結(jié)果。

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marrow mesenchymal stem cells on liver cancer cells

LI Tianran1,3, ZHAO Shaohong1, ZHOU Jun1,

WEI Zhengmao2, HUO Tianlong2, LU Guangming4

(1.DepartmentofRadiology,TheFirstAffiliatedHospitalofFuzhouGeneralHospital

ofNanjingMilitaryCommand,Putian,Fujian, 351100; 2.DepartmentofRadiology,

ThePeople′sHospitalofPekingUniversity,Beijing, 100044; 3.DepartmentofRadiology,

TheFirstAffiliatedHospitalofGeneralHospitalofPeople′sLiberationArmy,Beijing,

100048; 4.DepartmentofRadiology,NanjingGeneralHospital,Nanjing,Jiangsu, 210002)

ABSTRACT:ObjectiveTo explore the influence of TGFβ-1 gene silencing of human bone marrow mesenchymal stem cells (hMSC) on liver cancer cells. MethodsExpression plasmid of mRNA and siRNA by taking TGFβ-1 for targeted gene was constructed and infected by virus. Transwell assay was used to evaluate invasive ability of MHCC97-H cells. CCK-8 assay was used to evaluate proliferative capacity of MHCC97-H. PCR assay was used to detect OPN expression of MHCC97-H cells, and its correlation with the tumor invasion was analyzed as well. ResultsThe gene silencing was successful. Down-regulation of TGFβ-1 expression was observed in experimental group. Co-culture results showed that there was no significant difference of proliferative capacity of the MHCC97-H cells before and after trial in the experimental group(P>0.05). Invasive experiment results showed that the experimental group had a significant function on promotion of MHCC97-H cell invasion

福建省自然基金資助項(xiàng)目(2013J01392)

(P<0.05), and hMSC group had a more significant function on promotion of MHCC97-H cell

invasion than TGFβ-1 hMSC group(P<0.001). OPN expression of MHCC97-H cells decreased after co-culture. The OPN expression of tumor cells was positively correlated with tumor cell invasion. ConclusionTGFβ-1 gene silencing has no significant effect on proliferation ability of MHCC97-H cell, but has significant effect on invasive ability of MHCC97-H cell. Change of OPN expression in liver cancer cell is not the key factor of invasion ability change of liver cancer.

KEYWORDS:human bone marrow mesenchymal stem cells; gene silencing; osteopontin; high metastatic potential of hepatocellular carcinoma cells

通信作者:盧光明, E-mail: cjr.luguangming@vip.163.com

基金項(xiàng)目:國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81271607); 南京軍區(qū)醫(yī)藥衛(wèi)生重點(diǎn)項(xiàng)目資助(11Z035);

收稿日期:2014-11-23

中圖分類號(hào):R 735.7

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號(hào):1672-2353(2015)03-010-05

DOI:10.7619/jcmp.201503003