腎缺血再灌注損傷大鼠模型足細(xì)胞損傷及機(jī)制研究*

艾娜 謝席勝 王強(qiáng) 龍瓊先 王彥江 夏夢迪

(1.川北醫(yī)學(xué)院第二臨床醫(yī)學(xué)院·南充市中心醫(yī)院 腎內(nèi)科，四川 南充 637000；2.瀘州醫(yī)學(xué)院，四川 瀘州 646000；3.川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，四川 南充 637000；4.川北醫(yī)學(xué)院第二臨床醫(yī)學(xué)院·南充市中心醫(yī)院 病理科，四川 南充 637000)

腎缺血再灌注損傷大鼠模型足細(xì)胞損傷及機(jī)制研究*

艾娜1，2謝席勝1王強(qiáng)3龍瓊先4王彥江1夏夢迪1，2

(1.川北醫(yī)學(xué)院第二臨床醫(yī)學(xué)院·南充市中心醫(yī)院 腎內(nèi)科，四川 南充 637000；2.瀘州醫(yī)學(xué)院，四川 瀘州 646000；3.川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，四川 南充 637000；4.川北醫(yī)學(xué)院第二臨床醫(yī)學(xué)院·南充市中心醫(yī)院 病理科，四川 南充 637000)

目的 探討腎缺血再灌注損傷(renal ischemia reperfusion injury，IRI)大鼠模型足細(xì)胞的損傷，并對(duì)其損傷機(jī)制進(jìn)行初步研究。方法 雄性SD大鼠42只，隨機(jī)分為正常組(n=5)、假手術(shù)組(n=5)和模型組(n=32)，模型組下設(shè)IRI后1h、6h、12h、24h 4個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)8只大鼠。通過阻斷大鼠雙側(cè)腎臟血流構(gòu)建腎IRI模型。采用全自動(dòng)生化分析儀檢測各組大鼠的腎功能，流式細(xì)胞儀檢測血活性氧(reactive oxygen species, ROS)的變化，糖原染色(periodic Acid Schiff, PAS)了解腎臟病理損害，通過透射電鏡觀察足細(xì)胞損傷情況。結(jié)果 在IRI大鼠模型中，我們發(fā)現(xiàn)了明顯的足細(xì)胞損傷現(xiàn)象，即足細(xì)胞減少，足突消失，基底膜增厚。同時(shí)觀察到，隨著缺血再灌注后時(shí)間的延長，大鼠肌酐、尿素氮水平逐漸升高，紅細(xì)胞中ROS熒光強(qiáng)度陽性率逐漸升高，腎小管出現(xiàn)不同程度的管腔擴(kuò)張、變性與壞死，間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤、充血水腫等。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，紅細(xì)胞ROS熒光強(qiáng)度陽性率與腎小管損傷評(píng)分、肌酐、尿素氮水平成正相關(guān)，與足細(xì)胞計(jì)數(shù)呈負(fù)相關(guān)。結(jié)論 腎IRI早期足細(xì)胞就可出現(xiàn)明顯的損傷，同時(shí)伴有血ROS熒光強(qiáng)度陽性率明顯上升；血ROS的變化可能參與了腎IRI足細(xì)胞損傷及病理損害的過程。

腎缺血再灌注損傷； 活性氧； 足細(xì)胞損傷

腎臟缺血再灌注損傷(renal ischemia reperfusion injury，IRI)誘導(dǎo)的急性腎功能衰竭是臨床常見疾病，其發(fā)病率高，但臨床治療效果差。既往研究多關(guān)注腎IRI引起急性腎小管壞死機(jī)制，而腎IRI是否引起腎小球病變的研究報(bào)道甚少。本實(shí)驗(yàn)擬通過構(gòu)建腎IRI大鼠模型，觀察腎IRI大鼠腎小球足細(xì)胞的變化，以及通過流式細(xì)胞儀檢測大鼠血活性氧(reactive oxygen species，ROS)的變化，了解IRI大鼠模型足細(xì)胞的損傷情況，并對(duì)其損傷機(jī)制進(jìn)行初步探討。

1 材料與方法

1.1 材料 清潔級(jí)雄性SD大鼠42只，6～8周齡，體重(220～250)g，購自川北醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK(川)2008- 1B。尿素(BUN)檢測試劑盒、肌酐(Cr)檢測試劑盒(上?？迫A生物公司)；活性氧檢測試劑盒(碧云天生物研究所)。HITACHI全自動(dòng)生化分析儀(日立公司)；KDC-40低速離心機(jī)(科大創(chuàng)新公司)；FAsccaliber流式細(xì)胞儀(BD公司)；日立H-600IV型透射電鏡(日立公司)。

1.2 動(dòng)物分組及造模 雄性SD大鼠42只，隨機(jī)分為正常組(n=5)、假手術(shù)組(n=5)和模型組(n=32)，模型組下設(shè)IRI后1h、6h、12h、24h，4個(gè)時(shí)間點(diǎn)(n=8)。實(shí)驗(yàn)組：3%戊巴比妥鈉(1ml/kg)注射麻醉后[1]，沿腹正中線切口，逐層分離暴露雙側(cè)腎臟，游離出雙側(cè)腎動(dòng)脈，將消毒的壓脈帶片段包裹在腎動(dòng)脈外層，將手術(shù)線系在壓脈帶片段外迅速打結(jié)，使腎缺血45min后再灌注。假手術(shù)組除不阻斷雙側(cè)腎臟血流，其余處理與實(shí)驗(yàn)組相同。

手術(shù)前后情況觀察：術(shù)中阻斷雙側(cè)腎動(dòng)脈后，可見腎臟由鮮紅變紫黑色，去結(jié)扎線后，恢復(fù)血流灌注，可見腎臟迅速由紫黑色變?yōu)轷r紅；術(shù)后1～3h，可見大鼠蘇醒，逐漸恢復(fù)活動(dòng)，視為造模成功。腎臟恢復(fù)血流后5 min，腎臟未恢復(fù)正常顏色；或術(shù)中大出血；或術(shù)后1～3 h，大鼠未蘇醒或死亡，視為造模不成功。

1.3 指標(biāo)檢測

1.3.1 Scr和BUN檢測 處死大鼠前心臟采血3ml，按4200 r/min 5min離心后保存于-20℃冰箱，待標(biāo)本收集完后統(tǒng)一檢測。

1.3.2 流式細(xì)胞儀檢測血ROS的變化 紅細(xì)胞洗滌：將收集的血液用0.9%的生理鹽水反復(fù)漂洗，離心(3800r/min 5min)，直至離心后漂洗液清亮為止，去除上清液備用。

實(shí)驗(yàn)組：取DCFH-DA 1μl，用無血清培養(yǎng)液按照1∶1000稀釋DCFH-DA，使終濃度為10μmmol/L。向DCFH-DA稀釋液中加入1μl已洗滌好的紅細(xì)胞，放入流式細(xì)胞儀專用暗盒，在37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育30min，每3-5min混勻一次，使探針和細(xì)胞充分接觸。孵育結(jié)束后，離心去除上清液，用無血清培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞三次，充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA，最后加入3ml無血清培養(yǎng)液，放到流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。對(duì)照組：在DCFH-DA稀釋液中加入活性氧陽性對(duì)照試劑(Rosup 1μl)，其余操作同實(shí)驗(yàn)組。依據(jù)各組大鼠紅細(xì)胞ROS熒光強(qiáng)度陽性率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.3.3 腎臟PAS染色 將雙側(cè)腎臟取下后沿縱軸剖開，用10%中性福爾馬林固定，常規(guī)切片，PAS染色，光鏡下觀察。根據(jù)腎小管壞死程度，參考文獻(xiàn)[2]的半定量病理評(píng)估法評(píng)分：評(píng)分越高說明腎小管壞死越嚴(yán)重(最高4分)，0分：正常腎臟；1分：最輕微的(<25%的腎小管受累)；2分：輕度壞死(25%～50%的腎小管受累)；3分：中度壞死(50%～75%的腎小管受累)；4分：重度壞死(>75%的腎小管受累)。選擇兩個(gè)不同的區(qū)域，在400倍光鏡下分別選擇10個(gè)不同的視野進(jìn)行評(píng)分。

1.3.4 腎組織超微結(jié)構(gòu)及足細(xì)胞的電鏡觀察：取部分腎組織經(jīng)3%戊二醛固定，1%四氧化鋨再固定，丙酮逐級(jí)脫水，Epon812包埋，1μm半薄切片光學(xué)定位，超薄切片，醋酸鈾及枸櫞酸鉛雙重染色，在透射電鏡下觀察亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的病理改變以及腎微血管超微結(jié)構(gòu)的改變。每只大鼠腎組織在10000×放大倍數(shù)下取30個(gè)視野，以確保每只大鼠最少觀察100個(gè)足細(xì)胞，應(yīng)用計(jì)算機(jī)圖像分析軟件計(jì)數(shù)足細(xì)胞數(shù)目，以及腎小球基底膜的厚度。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠一般情況 正常組大鼠活動(dòng)自如，飲食飲水正常。手術(shù)后各組大鼠的蘇醒時(shí)間不一，假手術(shù)組大約于術(shù)后30min蘇醒。模型組大鼠多在術(shù)后1h蘇醒。術(shù)后，假手術(shù)組大鼠精神尚可，偶有進(jìn)食飲水，模型組大鼠精神欠佳，活動(dòng)減少。實(shí)驗(yàn)組32只大鼠，造模成功30例，成功率為93.75%。其中12h組1只大鼠于腎動(dòng)脈結(jié)扎后40min死亡；24h組1只大鼠于腎動(dòng)脈結(jié)扎30min后死亡。對(duì)其解剖未發(fā)現(xiàn)腹腔內(nèi)出血等明顯異常。

2.2 各組尿量記錄 正常組大鼠尿量為(10.08±0.97)ml，假手術(shù)組大鼠尿量為(1.94±0.63)ml，IRI各組大鼠均無小便，結(jié)果見圖1。

Figure 1 The urine volume of each group

注：與正常對(duì)照組相比，*P<0.05

2.3 各組大鼠腎功變化 結(jié)果見表1。

表1 各組大鼠的腎功檢測情況

注：肌酐 與正常組相比：①P<0.05；與假手術(shù)相比：②P<0.05 尿素氮 與正常組相比：①P<0.05，②P>0.05；與假手術(shù)相比：①P<0.05,②P>0.05

2.4 各組大鼠紅細(xì)胞ROS檢測 結(jié)果見表2，圖2。

表2 各組大鼠紅細(xì)胞ROS熒光強(qiáng)度陽性率檢測情況

注：與正常組相比：①P<0.05，與假手術(shù)相比：②P>0.05。

2.5 各組大鼠病理改變

2.5.1 外觀 假手術(shù)組為正常腎組織表現(xiàn)；IRI組肉眼可見腎皮質(zhì)，腎髓質(zhì)瘀血、色深暗。

2.5.2 PAS染色 IRI組腎小管上皮細(xì)胞腫脹，界限不清，出現(xiàn)不同程度的變性與壞死，間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤，充血水腫。結(jié)果見圖3、圖4。

2.5.3 電鏡檢查結(jié)果 正常組大鼠腎小球上皮細(xì)胞及突足，內(nèi)皮細(xì)胞完好，血管開放良好，系膜基質(zhì)及系膜細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰。IRI組大鼠腎小球出現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞核染色質(zhì)聚集，核固縮，壞死。上皮細(xì)胞增生微絨毛樣變，突足消失，系膜基質(zhì)增生嚴(yán)重，結(jié)果見表3，圖5。

圖2 缺血再灌注大鼠紅細(xì)胞活性氧陽性率檢測Figure 2 Ischemia-reperfusion in rat erythrocytes reactive oxygen positive rate

①:正常對(duì)照組 ②:假手術(shù)組 ③:IRI 1h組 ④:IRI 6h組 ⑤:IRI 12h組 ⑥:IRI 24h組

圖3 各組大鼠腎小管損傷評(píng)分

注：與正常對(duì)照組相比，①P<0.05，各IRI組間比較P>0.05

2.6 相關(guān)性分析 紅細(xì)胞ROS熒光強(qiáng)度陽性率與肌酐呈正相關(guān)(r=0.706，P<0.01)；與尿素氮呈正相關(guān)(r=0.648，P<0.01)，與腎小管損傷評(píng)分呈正相關(guān)(r=0.752，P<0.01)，與足細(xì)胞計(jì)數(shù)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.875，P<0.01)。足細(xì)胞計(jì)數(shù)與肌酐呈負(fù)相關(guān)(r=-0.651，P<0.01)；足細(xì)胞計(jì)數(shù)與尿素氮呈負(fù)相關(guān)(r=-0.580，P<0.01)；與腎小管損傷評(píng)分呈負(fù)相關(guān)(r=-0.635，P<0.01),結(jié)果見圖6。

圖4 缺血再灌注大鼠腎小管組織學(xué)改變(PAS×200)

Figure 4 The renal tubular tissue changes of ischemia-reperfusion rat(PAS×200)

①:正常對(duì)照組 ②:假手術(shù)組 ③:IRI 1h組 ④:IRI 6h組 ⑤:IRI 12h組 ⑥:IRI 24h組

圖5 各組大鼠腎臟電鏡圖片(×10000)

Figure 5 Electron microscopy images of rats of all groups(×10000)

①:正常對(duì)照組 ②:假手術(shù)組 ③:IRI 1h組 ④:IRI 6h組 ⑤:IRI 12h組 ⑥:IRI 24h組

3 討論

本研究通過阻斷雙側(cè)腎臟血流建立腎IRI動(dòng)物模型，動(dòng)態(tài)觀察了大鼠足細(xì)胞損傷變化及腎功能腎臟病理的改變。

研究結(jié)果顯示在腎IRI術(shù)后，大鼠血肌酐、尿素氮水平持續(xù)升高，說明腎缺血再灌注對(duì)腎臟造成了損傷，表明我們的造模方法成功構(gòu)建了腎IRI大鼠模型，這與既往關(guān)于IRI大鼠模型的研究結(jié)果一致[3]。通過PAS染色發(fā)現(xiàn)，腎IRI各組大鼠腎小管上皮細(xì)胞腫脹，界限不清，出現(xiàn)不同程度的變性與壞死，間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤，充血水腫，并且隨著缺血后再灌注時(shí)間的延長呈逐漸加重趨勢，至IRI 24h時(shí)出現(xiàn)腎小管大片狀壞死，腎小管結(jié)構(gòu)紊亂。說明腎IRI后引起腎小管損傷，出現(xiàn)腎功能的異常，這與既往研究結(jié)果一致[4]。

我們之前的研究已經(jīng)證實(shí)在腎IRI早期，血紅細(xì)胞ROS熒光強(qiáng)度陽性率的升高也能很好的反應(yīng)腎組織和全身氧化應(yīng)激的狀態(tài)[5]。我們的研究發(fā)現(xiàn)，與正常組相比，在缺血再灌注損傷早期，血紅細(xì)胞ROS熒光強(qiáng)度陽性率已明顯升高，且隨著缺血后再灌注損傷時(shí)間的延長呈逐漸升高趨勢。通過相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，血紅細(xì)胞ROS熒光強(qiáng)度陽性率與腎小管損傷評(píng)分、肌酐、尿素氮均呈正相關(guān)。進(jìn)一步證實(shí)ROS的產(chǎn)生增多與IRI的病理損害和腎功能的改變密切相關(guān)，這與既往研究一致[6]。

我們的研究不僅發(fā)現(xiàn)腎IRI大鼠腎小管上皮細(xì)胞的損傷嚴(yán)重，還發(fā)現(xiàn)在腎IRI早期，大鼠腎小球足細(xì)胞即出現(xiàn)嚴(yán)重的損傷，呈現(xiàn)足細(xì)胞突足消失，系膜基質(zhì)增生嚴(yán)重。而既往關(guān)于腎IRI模型腎小球足細(xì)胞的變化的研究結(jié)果存在較大分歧。李俊[7]等通過切除大鼠右腎，夾閉左腎動(dòng)脈45分鐘構(gòu)建腎IRI模型，觀察再灌注后6小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)、72小時(shí)后，發(fā)現(xiàn)腎IRI大鼠腎小球結(jié)構(gòu)變化不明顯。Andersson等[8]通

圖6 相關(guān)性分析結(jié)果

Figure 6 The correlation analysis

注：紅細(xì)胞ROS熒光強(qiáng)度陽性率與①肌酐、②尿素氮、③腎小管損傷評(píng)分呈正相關(guān)，與④足細(xì)胞計(jì)數(shù)呈負(fù)相關(guān)；足細(xì)胞計(jì)數(shù)與⑤肌酐、⑥尿素氮、⑦腎小管損傷評(píng)分呈負(fù)相關(guān)。

過阻斷腎臟血流15分鐘，發(fā)現(xiàn)輕度腎IRI后足細(xì)胞和基底膜沒有重大變化。而王新良[9]等通過離斷右側(cè)腎動(dòng)脈，夾閉左側(cè)腎動(dòng)脈45分組構(gòu)建腎IRI模型，再灌注后持續(xù)觀察5小時(shí)，發(fā)現(xiàn)腎小球足細(xì)胞足突排列紊亂，有明顯的融合現(xiàn)象，與我們的研究結(jié)果一致。我們推測腎IRI大鼠出現(xiàn)嚴(yán)重的足細(xì)胞損傷，可能與腎缺血及再灌注時(shí)間的長短，以及與腎IRI模型制作的手術(shù)方式等有關(guān)。關(guān)于腎IRI腎小球足細(xì)胞損傷的機(jī)制，相關(guān)研究報(bào)道較少。我們通過相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，足細(xì)胞計(jì)數(shù)與血ROS熒光強(qiáng)度陽性率呈負(fù)相關(guān)，在腎IRI早期血紅細(xì)胞ROS熒光強(qiáng)度陽性率明顯升高，與此同時(shí)腎小球足細(xì)胞即出現(xiàn)明顯的損傷，因此我們推測血紅細(xì)胞ROS的變化與腎小球足細(xì)胞的損傷密切相關(guān)，但是血紅細(xì)胞ROS具體通過何種機(jī)制引起足細(xì)胞損傷還需進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果顯示，腎IRI早期足細(xì)胞即出現(xiàn)明顯的損傷，同時(shí)伴有血ROS熒光強(qiáng)度陽性率明顯上升；血ROS的變化可能參與了腎IRI足細(xì)胞損傷及病理損害的過程。

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Mechanism of podocyte injury of renal ischemia-reperfusion injury in rats

AI Na1,2, XIE Xi-sheng1, WANG Qiang3,etal

(1.DepartmentofNephrology,NanchongCentralHospital,Nanchong637001,Sichuan;2.LuzhouMedicalCollege,Luzhou646000,Sichuan;3.Clinicallaboratory,TheAffiliatedHospitalofNorthSichuanMedicalCollege,Nanchong637001,Sichuan;4.DepartmentofPathology,NanchongCentralHospital,Nanchong637001,Sichuan)

Objective To investigate the changes of podocytes and its mechanism in the rat of renal ischemia-reperfusion injury (IRI).Methods 42 male Sprague-Dawley rats were randomly divided into normal group(n=5), sham group(n=5) and IRI roup(n=32). IRI group is divided into four time points：1 hour, 6 hour, 12 hour and 24 hour. Each time point contained 8 animals. Through blocking bilateral renal blood flow in rats, the IRI model was established. The renal function, the ROS of erythrocyte, the renal pathological damage and podocyte injury were observed. Results We found the obvious podocyte damage phenomenon in the IRI rat model, such as decreased podocyte and foot processes and thick basement. The level of creatinine and blood urea nitrogen (BUN) and the positive rate of ROS fluorescence intensity in erythrocyte were gradually increased with the extension of the time after ischemia-reperfusion injury rats. Tubular could appearing vary degrees of luminal expansion and degeneration and necrosis and interstitial inflammatory cell infiltration and congestion and edema and so on. Correlation analysis found that the positive rate of erythrocyte ROS fluorescence intensity was positively correlated with tubular injury score, creatinine and blood urea nitrogen leve, but negatively correlated with podocyte count. Conclusion The damage of podocytes obvious in the early of IRI, at the same time the blood of ROS is significantly increased. The change of blood ROS may be involved in the process of renal IRI podocyte injury.

Renal ischemia-reperfusion injury; Reactive oxygen species; Podocyte injury

；四川省教育廳科研項(xiàng)目(10ZC027)

謝席勝，E-mail：xishengx@163.com

R 692.3+9

A

10.3969/j.issn.1672-3511.2015.02.004

2014-07-11； 編輯： 張文秀)