H3N2亞型SIV核蛋白基因的克隆及在大腸桿菌中的表達

朱春平，李 燕，吳亞麗，常婧竹，劉 琳，高文明，李新生

(1 河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 牧醫(yī)工程學(xué)院,河南 鄭州450002;2 中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所,北京100081)

H3N2亞型SIV核蛋白基因的克隆及在大腸桿菌中的表達

朱春平1，2，李 燕1，吳亞麗1，常婧竹1，劉 琳1，高文明1，李新生1

(1 河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 牧醫(yī)工程學(xué)院,河南 鄭州450002;2 中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所,北京100081)

【目的】 克隆和表達H3N2型豬流感病毒(SIV) A/swine/Henan/1/2010(H3N2)的核蛋白(NP)基因，為制備NP抗體和SIV基因工程疫苗奠定基礎(chǔ)?！痉椒ā?提取SIV A/swine/Henan/1/2010(H3N2)的RNA，用RT-PCR擴增NP基因，將其定向克隆到pET-28a(+)原核表達載體，構(gòu)建重組表達載體，并將其轉(zhuǎn)化入大腸桿菌Rosetta中表達，用SDS-PAGE和Western blotting檢測表達產(chǎn)物，同時考察IPTG不同濃度(0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mmol/L)和不同誘導(dǎo)時間(2，4，6，8 h)對重組NP蛋白表達量的影響?！窘Y(jié)果】 克隆到1 512 bp的NP基因，與預(yù)期的核蛋白基因大小一致，共編碼498個氨基酸；構(gòu)建的重組表達載體在大腸桿菌Rosetta中表達出了分子質(zhì)量約60 ku的重組核蛋白，其主要以包涵體的形式存在。IPTG不同誘導(dǎo)濃度和不同誘導(dǎo)時間對重組NP蛋白表達量的影響均較小。【結(jié)論】 克隆和表達了H3N2亞型豬流感病毒的核蛋白基因。

豬流感病毒；核蛋白；H3N2亞型；大腸桿菌

豬流感(Swine influenza，SI)是由正黏病毒科A型流感病毒屬的豬流感病毒(Swine influenza virus，SIV)引起的豬的一種急性呼吸道傳染病，其特征為高熱、精神沉郁、流鼻涕、咳嗽、呼吸困難、衰竭等，常反復(fù)發(fā)作[1-4]。1918年美國首先報道了豬流感，1930年Shope等從衣阿華州分離到第1株H1N1亞型SIV[5]。1991年中國首次從豬群中分離到H1N1亞型SIV[6]。目前已發(fā)現(xiàn)的SIV至少有H1N1、H1N2、H1N7、H3N2、H2N3、H3N1、H3N6、H4N6、H5N1和H9N2共10種不同的亞型[7-8]。根據(jù)病原學(xué)、血清學(xué)和流行病學(xué)的研究，我國目前發(fā)現(xiàn)的亞型有H1Nl、H1N2、H3N2、H5N1和H9N2[9]，其中以H1Nl和H3N2亞型的流行和危害比較嚴重[10]。

SIV基因組由8個分節(jié)段的單股負鏈RNA組成，編碼至少10種病毒蛋白。核蛋白(Nucleoprotein，NP)由第5節(jié)段的RNA編碼，NP基因在流感病毒中高度保守[11-14]，而NP蛋白是流感病毒診斷中最具有代表性的蛋白。本研究對SIV A/swine/Henan/1/2010(H3N2)株的NP基因進行了克隆，并在大腸桿菌系統(tǒng)中進行誘導(dǎo)表達，旨在為下一步豬流感病毒核蛋白單克隆抗體的篩選以及豬流感病毒診斷試劑和亞單位疫苗的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 病毒及菌種 SIV A/swine/Henan/1/2010(H3N2)株，由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院動物性食品質(zhì)量與安全實驗室分離保存。

1.1.2 載體和感受態(tài)細胞 pET-28a(+)原核表達載體和Rosetta感受態(tài)細胞，由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院動物性食品質(zhì)量與安全實驗室保存。

1.1.3 工具酶和主要試劑 M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、T4 DNA Ligase、EcoRⅠ和XhoⅠ限制性內(nèi)切酶、DL2000 DNA Marker、DL5000 DNA Marker、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、胰蛋白胨、酵母提取物和高純度瓊脂糖等，均購自寶生物工程(大連)有限公司；2×TaqPCR Mix聚合酶，購自鄭州博美生物技術(shù)公司；B型質(zhì)粒小量快速提取試劑盒，購自北京博大泰克基因技術(shù)有限公司；B型小量DNA片段快速回收試劑盒(離心柱型)、辣根過氧化物酶(HRP)標記的抗His-tag鼠單抗和DAB顯色試劑盒，均購自康為世紀公司。

1.1.4 H3N2NP基因引物的設(shè)計與合成 根據(jù)GenBank上發(fā)布的NP基因參考序列(GenBank登錄號：KF541240)，采用DNA Star 5.0和Primer Premier 5.0軟件設(shè)計1對特異性引物：P1.5′-CCG-GAATTCATGGCGTCCCAAGGCACCAAAC-3′;P2.5′-CCGCTCGAGATTGTCATACTCTTCTG-CATTGTCT-3′。P1和P2 5′端下劃線堿基分別引入EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位點，引物由深圳華大基因科技有限公司合成，預(yù)期擴增片段長度為1 512 bp，包含完整開放閱讀框；經(jīng)DNA Star 5.0計算，重組NP蛋白的大小約為60 ku。

1.2 方 法

1.2.1 H3N2亞型SIV的增殖與RNA的提取 將種毒按1∶10的體積比稀釋，以0.2 mL/胚接種10日齡SPF雞胚，37 ℃ 孵育72 h，收取尿囊液，8 000 r/min離心15 min，吸取上清液，采用TRIZOL法提取尿囊液中病毒的RNA。

1.2.2 H3N2亞型SIVNP基因的RT-PCR擴增 將1.2.1提取的RNA按Takara公司的M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶說明書進行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,反應(yīng)條件：70 ℃ 10 min，冰浴5 min，42 ℃ 1 h，70 ℃ 15 min。以反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模板擴增NP基因，PCR反應(yīng)體系為25 μL:上、下游引物(25 mol/L)各0.5 μL，cDNA模板2 μL，Premix LATaq(0.1 U/μL) 12.5 μL，滅菌超純水補足至25 μL。對NP基因引物設(shè)置退火溫度梯度進行PCR擴增，通過核酸電泳結(jié)果選取最佳退火溫度。PCR擴增程序為:95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性20 s，59.4 ℃退火45 s，72 ℃ 延伸3 min，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。取5 μL PCR產(chǎn)物于10 g/L瓊脂糖凝膠中電泳并觀察結(jié)果，采用B型小量DNA片段快速回收試劑盒對剩余的PCR產(chǎn)物進行切膠回收并送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

1.2.3 pET-28a(+)-NP-R重組質(zhì)粒的構(gòu)建 對回收純化的PCR產(chǎn)物和pET-28a(+)原核表達載體，分別用EcoRⅠ、XhoⅠ限制性內(nèi)切酶進行同步雙酶切，酶切體系根據(jù)EcoRⅠ和XhoⅠ說明書上的體系構(gòu)建，將酶切體系瞬時離心后，于37 ℃恒溫箱內(nèi)酶切2 h。取酶切產(chǎn)物進行10 g/L瓊脂糖凝膠電泳，按照膠回收試劑盒說明書切膠回收目的片段。將酶切回收的目的基因與表達載體按照1∶3～1∶10物質(zhì)的量比混合，并加入T4 DNA Ligase和緩沖液，在16 ℃下連接過夜。將連接的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到Rosetta感受態(tài)細胞中，并取100 μL涂布在含有50 μg/mL卡那霉素的LB平板上，37 ℃培養(yǎng)12～16 h，挑取單個菌落于含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃搖菌，培養(yǎng)過夜。提取質(zhì)粒，進行EcoRⅠ、XhoⅠ雙酶切鑒定，并送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序鑒定，將鑒定為陽性的質(zhì)粒命名為pET-28a(+)-NP-R。

1.2.4 重組NP蛋白的誘導(dǎo)表達及可溶性分析 將鑒定為陽性的重組質(zhì)粒pET-28a(+)-NP-R轉(zhuǎn)化到Rosetta感受態(tài)細胞中，挑取菌落，并對其進行增殖培養(yǎng)及測序鑒定，將鑒定為陽性的重組菌接種于新鮮的含卡那霉素終質(zhì)量濃度為50 μg/mL的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)過夜至OD600約為0.6時，加入100 mmol/L IPTG至終濃度為0.6 mmol/L，37 ℃誘導(dǎo)振蕩培養(yǎng)4 h后，12 000 r/min 離心3 min，每mL菌體沉淀用40 μL的雙蒸水重懸，并加入10 μL的5×SDS Loading buffer混勻，水浴煮沸5 min，取10 μL上樣進行SDS-PAGE電泳，經(jīng)考馬斯亮藍染色2 h和脫色液脫色4 h后觀察電泳結(jié)果，試驗同時設(shè)IPTG誘導(dǎo)和未誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)化pET-28a(+)的Rosetta感受態(tài)細胞(pET-28a(+)-Rosetta)為對照。

通過菌體裂解、離心、SDS-PAGE等可溶性分析方法對重組NP蛋白進行可溶性分析，發(fā)現(xiàn)NP蛋白以包涵體的形式存在，試驗同時設(shè)IPTG誘導(dǎo)和未誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)化pET-28a(+)的Rosetta感受態(tài)細胞(pET-28a(+)-Rosetta)為對照。

1.2.5 重組NP蛋白誘導(dǎo)表達條件的優(yōu)化 (1)IPTG濃度的優(yōu)化。用接種環(huán)挑取陽性重組細菌的單一菌落，接種于含卡那霉素終質(zhì)量濃度為50 μg/mL 的LB培養(yǎng)液中，在37 ℃搖床上培養(yǎng)到OD600約為0.6時，加入IPTG，使其終濃度分別為0.2，0.4，0.6，0.8和1.0 mmol/L，之后繼續(xù)在37 ℃搖床上培養(yǎng)。6 h后，分別吸取IPTG終濃度不同的各組菌液1 mL，對菌液進行適當處理后，通過SDS-PAGE對處理好的菌液樣品進行鑒定，以便確定IPTG的最佳誘導(dǎo)濃度。

(2)誘導(dǎo)時間的優(yōu)化。用接種環(huán)挑取陽性重組細菌的單一菌落，接種于含卡那霉素終質(zhì)量濃度為50 μg/mL的LB培養(yǎng)液中，在37 ℃搖床上培養(yǎng)到OD600約為0.6時，加入IPTG至終濃度為1.0 mmol/L，然后繼續(xù)在37 ℃對其進行誘導(dǎo)培養(yǎng)，分別在0，2，4，6 和8 h時各取1 mL菌液，對菌液進行適當處理后，通過SDS-PAGE進行鑒定，以便確定最佳的誘導(dǎo)時間。

1.2.6 重組NP蛋白的純化及Western blotting鑒定 取200 mL誘導(dǎo)表達后的陽性重組菌，7 000 r/min 離心得菌體沉淀，加入溶菌酶至終質(zhì)量濃度為1 mg/mL，再加入Triton X-100至終質(zhì)量濃度為10 g/L，孵育45 min；將孵育好的菌體在冰浴下用300 W的功率進行超聲破碎(2 s/9 s/100次)，得菌體裂解液，然后于4 ℃、12 000 r/min離心10 min，得菌體裂解液上清和沉淀。純化步驟按照《分子克隆實驗指南(第3版)》進行[15]。純化得到的重組NP蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，用50 g/L的脫脂奶粉室溫封閉1 h，然后用1∶1 000 倍稀釋的HRP標記的抗His-tag鼠單抗孵育，4 ℃過夜，孵育結(jié)束后用TBST緩沖液洗滌3次，每次10 min。最后用DAB顯色試劑盒顯色。

2 結(jié)果與分析

2.1 NP基因的擴增與重組質(zhì)粒的酶切鑒定

陽性重組質(zhì)粒的酶切鑒定結(jié)果和目的基因的擴增結(jié)果見圖1。由圖1可知，擴增出了與預(yù)期目的片段長度相符的特異性目的片段，擴增的NP基因大小為1 512 bp，共編碼498個氨基酸。用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、XhoⅠ酶切重組質(zhì)粒pET-28a(+)-NP-R，結(jié)果獲得了與預(yù)期目的片段長度相符的2個片段。NP基因的測序結(jié)果經(jīng)DNA Star 5.0分析發(fā)現(xiàn)，其與NP基因參考序列(GenBank登錄號：KF541240)的同源性為100%，說明重組質(zhì)粒pET-28a(+)-NP-R構(gòu)建成功。

2.2 重組NP蛋白的誘導(dǎo)表達

將重組質(zhì)粒pET-28a(+)-NP-R轉(zhuǎn)化入宿主菌Rosetta內(nèi)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，可在Rosetta中表達出帶有His標簽的重組蛋白。經(jīng)計算，SIV NP蛋白的分子質(zhì)量與載體上蛋白的分子質(zhì)量相加，則重組NP蛋白的大小約為60 ku。表達菌經(jīng)過處理后，進行SDS-PAGE電泳，用考馬斯亮蘭染色，再用脫色液脫色，結(jié)果顯示，重組NP蛋白分子質(zhì)量的大小與預(yù)期相符 (圖2)，表明重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入宿主菌，經(jīng)過IPTG誘導(dǎo)后，成功表達出了重組NP蛋白。

圖1 H3N2亞型SIVNP基因的RT-PCR擴增及重組質(zhì)粒pET-28a(+)-NP-R的EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定
M1.DNA Marker DL2000;M2.DNA Marker DL5000;1.NP基因的RT-PCR擴增產(chǎn)物;2.pET-28a(+)-NP-R的雙酶切產(chǎn)物
Fig.1 Amplification of swine influenza A virus (H3N2)NPgene by RT-PCR and double digestion identification of recombinant plasmid pET-28a(+)-NP-R withEcoRⅠandXhoⅠ
M1.DNA Marker DL2000;M2.DNA Marker DL5000; 1.RT-PCR amplification products ofNPgene;2.Plasmid pET-28a(+)-NP-R digested withEcoRⅠandXhoⅠ

2.3 重組NP蛋白的可溶性分析

對誘導(dǎo)的NP蛋白上清和沉淀分別進行SDS-PAGE電泳分析，結(jié)果(圖3)顯示，菌體裂解液的沉淀中含有目的蛋白，而上清中沒有。由此可知，重組NP蛋白以包涵體的形式表達。

2.4 IPTG誘導(dǎo)濃度對重組NP蛋白表達量的影響

用不同濃度IPTG誘導(dǎo)表達產(chǎn)物，在約60 ku處出現(xiàn)目的蛋白條帶(圖4)。

BandScan 5.0軟件掃描結(jié)果顯示，經(jīng)不同濃度(0.2，0.4，0.6，0.8和1.0 mmol/L)IPTG誘導(dǎo)，重組NP蛋白表達量分別占菌體總蛋白的32.6%，32.2%，33.2%，32.5%和30.6%，說明不同濃度IPTG對重組NP蛋白表達量的影響較小。

2.5 IPTG誘導(dǎo)時間對重組NP蛋白表達量的影響

用IPTG誘導(dǎo)不同時間，表達產(chǎn)物均在約60 ku處出現(xiàn)目的蛋白條帶(圖5)。BandScan 5.0軟件掃描結(jié)果顯示，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)不同時間(2，4，6和8 h)，重組NP蛋白表達量分別占菌體總蛋白的24.4%，30.4%，28.0%和28.9%，說明IPTG誘導(dǎo)時間對重組NP蛋白表達量的影響較小。

2.6 重組NP蛋白的Western blotting鑒定

Western blotting鑒定結(jié)果顯示，重組NP蛋白在約60 ku處出現(xiàn)單一且特異的清晰條帶(圖6)，表明重組NP蛋白在大腸桿菌中得到了高效表達，且與預(yù)測蛋白大小一致。

3 討 論

近年來，國內(nèi)外對SIV越來越關(guān)注，一方面是由于豬在禽流感和人流感傳播中發(fā)揮著重要的中間宿主的作用，因而具有重要的公共衛(wèi)生意義；另一方面，SIV是豬急性呼吸道疾病、豬流產(chǎn)以及免疫抑制等問題的一個主要誘因[16]。對豬流感進行及時、準確的診斷，是控制該病流行發(fā)生的基礎(chǔ)。豬流感病毒的NP蛋白在不同亞型流感病毒中非常保守[17]，其誘導(dǎo)機體產(chǎn)生的細胞免疫可抵御不同亞型流感病毒的感染，具有良好的種間交叉反應(yīng)性[18-19]，是流感病毒分型和診斷的基礎(chǔ)。

本研究利用大腸桿菌表達系統(tǒng)對A/swine/Henan/1/2010(H3N2)的NP基因進行了克隆和表達。而在本研究的前期試驗中，將構(gòu)建好的陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BL21(DE3)pLysS誘導(dǎo)處理后，經(jīng)SDS-PAGE鑒定，在約60 ku處并未發(fā)現(xiàn)表達的重組NP蛋白。之后，又將構(gòu)建好的陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)入Rosetta中，誘導(dǎo)處理后，在約60 ku處發(fā)現(xiàn)了表達的重組NP蛋白，Western blotting鑒定結(jié)果與預(yù)期結(jié)果完全一致。Rosetta菌種本身含有一種質(zhì)粒，此質(zhì)粒編碼稀有密碼子的tRNA，而這恰恰是BL21(DE3)pLysS菌種所不具備的，因此，SIV A/swine/Henan/1/2010(H3N2)株的NP基因可能含有大量的稀有密碼子，通過密碼子在線分析網(wǎng)站http://people.mbi.ucla.edu/sumchan/caltor.html證實了這一點，對NP基因的稀有密碼子進行分析，結(jié)果顯示該NP基因含有33%的稀有密碼子，從而導(dǎo)致其可在Rosetta中表達，而在BL21(DE3)pLysS中不表達。

由于原核表達系統(tǒng)具有成本低和表達量高等優(yōu)點，所以本研究結(jié)果為流感病毒診斷試劑的開發(fā)、亞單位疫苗的研制以及NP蛋白功能的研究等奠定了基礎(chǔ)。

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Clone of nucleoprotein gene of influenza A virus (H3N2) and its expression inEscherichiacoli

ZHU Chun-ping1,2,LI Yan1,WU Ya-li1,CHANG Jing-zhu1,LIU Lin1，GAO Wen-ming1,LI Xin-sheng1

(1CollegeofHusbandryandVeterinary,HenanAgriculturalUniversity,Zhengzhou,Henan450002,China; 2ChinaInstituteofVeterinaryDrugsControl,Beijing100081,China)

【Objective】 The nucleoprotein (NP) gene from swine influenza virus (SIV) A/swine/Henan/1/2010 (H3N2) was cloned and expressed to lay foundation for the preparation of NP antibody and genetic engineering vaccine of SIV.【Method】 The total RNA of SIV A/swine/Henan/1/2010(H3N2) was extracted.TheNPgene was amplified from the total RNA by using RT-PCR and it was inserted into prokaryotic expression vector pET-28a(+) to construct recombinant expression vector.Then the vector was transformed and expressed inEscherichiacoliRosetta.The expressed protein was detected by SDS-PAGE and Western blotting,and the expression levels of recombinant NP protein under different IPTG concentrations (0.2,0.4,0.6,0.8,and 1.0 mmol/L) and different induction times (2,4,6,and 8 h) were determined.【Result】 The clonedNPgene (1 512 bp) was consistent with the expected nucleoprotein gene,encoding 498 amino acids. Recombinant expression vector expressed inE.coliRosetta as recombinant nucleoprotein with the relative molecular weight of ～60 ku and mainly in the form of inclusion bodies.The expression level of recombinant NP protein was slightly influenced by IPTG concentration and induction time.【Conclusion】 H3N2 swine influenza virus nucleoprotein gene was successfully cloned and expressed.

SIV;nucleoprotein;H3N2;Escherichiacoli

2013-11-04

國家農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化資金項目(2012GB2D000273)；河南省科技成果轉(zhuǎn)化計劃項目(122201110027)

朱春平(1989-)，男，河南湯陰人，在讀碩士，主要從事動物病毒分子病原學(xué)研究。E-mail：woailanqiu.1989@163.com

李新生(1969-)，男，河南鄭州人，副教授，博士，碩士生導(dǎo)師，主要從事病毒病原學(xué)研究。 E-mail：harmony69@gmail.com

時間:2015-01-19 09:19

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.03.011

S852.65+9.5

A

1671-9387(2015)03-0001-06

網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20150119.0919.011.html