尹子靜,劉裕田
(山西省呂梁市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心,山西呂梁 033000)
基層監(jiān)測采樣問題的解決措施
尹子靜,劉裕田
(山西省呂梁市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心,山西呂梁 033000)
采樣監(jiān)測是獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室檢測工作的基礎(chǔ),樣品質(zhì)量是否符合要求直接關(guān)系到檢測結(jié)果的準(zhǔn)確度,基層采樣過程中存在著血清溶血、樣品受污染、樣品采集保存不規(guī)范等問題進(jìn)行分析,建議使用負(fù)壓采血管、嚴(yán)格采樣規(guī)程等措施加以改進(jìn)。
畜禽采樣;問題;措施
采樣監(jiān)測是獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室檢測工作的基礎(chǔ),合格的樣品才能得到科學(xué)的結(jié)論,為重大動(dòng)物疫病防控、動(dòng)物檢疫和養(yǎng)殖場疫病凈化提供可靠的診斷依據(jù)。由于我市地處呂梁山區(qū),基層動(dòng)物防疫工作者技術(shù)水平低,在監(jiān)測采樣中存在著諸多問題,下面就本人在獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室檢測工作中對(duì)基層采樣存在的問題進(jìn)行總結(jié)并提出改進(jìn)方法,以供同仁參考。
1.1 血清制備存在問題
血清學(xué)檢測方法是獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室工作中最基本的檢測方法,而血清標(biāo)本的質(zhì)量是否符合要求直接影響到檢測結(jié)果的準(zhǔn)確度,因此血清的制備最為關(guān)鍵。血清是指血液凝固后,在血漿中除去纖維蛋白分離出的淡黃色透明液體。在我市基層采集血清常見的問題如溶血、膠凍樣血清等。溶血是由于各種原因造成紅細(xì)胞破壞,胞內(nèi)血紅蛋白(Hb)等物質(zhì)和細(xì)胞內(nèi)液進(jìn)入血清。制備血清過程中例如采血時(shí)在血腫的地方采集血樣、血液注入采血管中時(shí)未取下針頭或用力推出產(chǎn)生大量氣泡、機(jī)械性強(qiáng)力振蕩、突然低溫冷凍或突然化凍都能引起溶血。溶血對(duì)ELISA檢測法的影響主要是由紅細(xì)胞溶解時(shí)會(huì)釋放出具有過氧化物酶活性的物質(zhì),以HRP為標(biāo)記的ELISA測定中,溶血標(biāo)本可能會(huì)增加非特異性顯色。劉玉振等研究發(fā)現(xiàn),溶血對(duì)HBsAg的檢測有影響,當(dāng)紅細(xì)胞濃度>25%造成的溶血可導(dǎo)致假陽性。由于基層采血未能普及含有分離膠及促凝劑的采血管,現(xiàn)場分離血清使得凝血時(shí)間不足,血清中的蛋白纖維未能完全分離,導(dǎo)致析出的血清在放置一段時(shí)間后呈現(xiàn)膠凍樣(尤其是雞豬血清最明顯)。還有可能是脂濁血清,出現(xiàn)的原因脂肪堆積過多,或血清離心不合適(時(shí)間、速度等因素),導(dǎo)致分離出的血清中存在著脂質(zhì)小粒,這些小粒容易附著在酶標(biāo)板內(nèi)壁,非離子洗滌劑對(duì)這些物資洗滌不徹底,造成非特異型吸附使得吸光值偏高而造成假陽性結(jié)果。吳澤馨研究表明,脂濁標(biāo)本對(duì)ELISA法檢測乙型肝炎表面抗原實(shí)驗(yàn)結(jié)果干擾較大,極易容易形成假陽性結(jié)果,嚴(yán)重影響測定結(jié)果的正確度。
1.2 缺乏無菌概念,樣品污染嚴(yán)重
在采集豬、雞血液過程中容易扎破血管,導(dǎo)致流出血管外的血液受污染。由于血清受到細(xì)菌污染,菌體中可能含有內(nèi)源性HRP,以HRP為標(biāo)記的ELISA測定中,會(huì)產(chǎn)生假陽性反應(yīng)。
1.3 病原學(xué)采樣不規(guī)范
病原學(xué)可以從疫病的病原、流行病學(xué)、分子生物學(xué)和免疫學(xué)等角度,深入揭示重要?jiǎng)游镆卟〔≡淖儺愐?guī)律、流行特點(diǎn)、致病機(jī)制及機(jī)體免疫保護(hù)機(jī)制,為動(dòng)物疫病的監(jiān)測、預(yù)警及防控提供技術(shù)支持。隨著生物學(xué)研究由宏觀領(lǐng)域向微觀領(lǐng)域的發(fā)展,病原體檢測方法也從組織形態(tài)學(xué)水平深入到分子水平、基因水平。例如高致病性禽流感鼻咽拭子采樣是病原學(xué)監(jiān)測中的一個(gè)重要環(huán)節(jié),操作簡單,但是基層采樣過程中存在采樣器具不合格、受污染、采樣部位、樣品保存液種類、保存方法不正確等問題,使得病原學(xué)監(jiān)測結(jié)果受到影響,浪費(fèi)了大量的人力、物力、財(cái)力。樣品采集的時(shí)間、部位及采集質(zhì)量對(duì)病毒分離、提取以及制備有活性的RNA至關(guān)重要,而樣本保存與運(yùn)輸不當(dāng),也會(huì)影響病毒的分離。
1.4 樣品盛放容器標(biāo)準(zhǔn)不一,加大實(shí)驗(yàn)室檢測人員工作量
采集血清時(shí),由于各縣市區(qū)采樣的采樣器具不統(tǒng)一,分別為獸用采血器、真空管、注射器等,造成檢測過程中吸取血清困難,嚴(yán)重影響實(shí)驗(yàn)室檢測效率。
1.5 采樣單填寫簡單,難以準(zhǔn)確研判檢測結(jié)果并評(píng)估免疫結(jié)果
由于基層防疫人員文化水平低、年齡老化,采樣單填寫簡單,比如未能按照要求寫清楚畜禽種類、日齡、代次、免疫程序、免疫時(shí)間、疫苗種類、疫苗生產(chǎn)廠家及批號(hào)。由于現(xiàn)代疫苗技術(shù)發(fā)展,特異性的檢測試劑盒成為動(dòng)物防疫工作研究者的重點(diǎn)。例如薛雙等研究證實(shí),豬口蹄疫O型合成肽疫苗免疫抗體的檢測不能使用IHA試劑盒檢測,豬口蹄疫病毒VP1結(jié)構(gòu)蛋白抗體ELISA診斷試劑盒(VP1-ELISA)和口蹄疫O型抗體液相阻斷ELISA檢測試劑盒(LB-ELISA)都可以用來評(píng)價(jià)豬口蹄疫O型合成肽疫苗免疫后血清抗體水平,這和陳方志等試驗(yàn)結(jié)果相同。
1.6 采血技術(shù)不規(guī)范、不熟練
直接導(dǎo)致畜禽應(yīng)激反應(yīng)大,造成畜主對(duì)采樣工作不支持。由于基層獸醫(yī)站人員部分為“三定”時(shí)期的人員,牛羊雞采樣使用“采血針+負(fù)壓管”尚未普及,以及豬前腔靜脈采樣法使用較少,造成采血時(shí)動(dòng)物應(yīng)激反應(yīng)大,畜主對(duì)采血有抵觸情緒。
1.7 樣品采集數(shù)量少
不足以代表整個(gè)養(yǎng)殖場的抗體水平。根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)一般規(guī)律,采樣量達(dá)20頭時(shí)可信度達(dá)98%,達(dá)30頭時(shí)可信度達(dá)99%,達(dá)40頭時(shí)可信度達(dá)99.5%,達(dá)50頭時(shí)可信度達(dá)99.9%。因此建議每個(gè)階段分別至少采樣30頭??紤]到種公豬的特殊重要性,最好每頭種公豬都要采樣。
1.8 忽視樣品保存的時(shí)效性
對(duì)于市縣鄉(xiāng)三級(jí)動(dòng)物防疫部門來說,由于集中監(jiān)測的時(shí)效性和區(qū)域性,從鄉(xiāng)鎮(zhèn)獸醫(yī)站組織采血到市級(jí)獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室開展檢測需要5個(gè)工作日以上,因此存在著在夏季血清樣品冷藏容易腐敗、抗體效價(jià)降低以及細(xì)菌滋生等問題。由于血清在冰箱中長時(shí)間保存導(dǎo)致血清IgG聚合,使間接法ELISA的試劑本底加深。冷凍血清融解后,蛋白質(zhì)局部濃縮,分布不均。
2.1 采血前基層防疫人員提前告知養(yǎng)殖戶,相互配合,盡量在采血前12h減少飼喂飼料,多飲水。
2.2 普及使用真空負(fù)壓管采血技術(shù),嚴(yán)格無菌采血。只要是扎破血管流出血管外的血液不能采集,因?yàn)檠阂呀?jīng)受到污染。制備血清的過程中有條件的話盡量在無菌操作臺(tái)制備血清,也可加入適當(dāng)防腐劑。標(biāo)本在保存中如出現(xiàn)細(xì)菌污染所致的混濁或絮狀物時(shí),應(yīng)離心沉淀后取上清檢測。
2.3 制定血清制備標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程。采血完成后,迅速將采血器傾斜30度左右放入37℃恒溫箱2h以上(冬季北方天氣溫度低,采集雞血清時(shí)候要帶熱水袋,加快血液凝集進(jìn)程),拿出后在冰箱4℃放置過夜,用3000轉(zhuǎn)/min離心10min分離血清。一般說來,在5d內(nèi)測定的血清標(biāo)本可放置于4℃,超過一周測定的需-20℃保存。
2.4 采集的樣品用防水油性記號(hào)筆標(biāo)記要清楚,編號(hào)要有規(guī)律,樣品的排列要有順序,以便于檢測、統(tǒng)計(jì)結(jié)果。采集的樣品要有詳細(xì)的說明,包括畜禽的健康狀況、日齡、胎齡、種類、免疫程序、近3個(gè)月的免疫時(shí)間、疫苗種類和疫苗來源等數(shù)據(jù)。
2.5 病原學(xué)所有標(biāo)本的收集、運(yùn)輸和保藏都應(yīng)裝在有螺旋蓋的塑料管中,以防止開、關(guān)標(biāo)本管時(shí)產(chǎn)生氣溶膠,并用兩層封口袋包裹嚴(yán)實(shí),不同場(村)不能混裝,同時(shí)注意采樣過程中器械交叉污染。采集樣品要裝在有冰袋的保溫盒內(nèi)及時(shí)送達(dá)實(shí)驗(yàn)室,運(yùn)送途中盡量避免搖晃,以免溶血。采樣的鼻咽拭子WHO及美國CDC規(guī)定,鼻咽拭子采集只能用塑料桿的滌綸或人造棉拭子(如常用的聚酯纖維拭子),不能用藻酸鈣拭子或木桿拭子,因可能使某些病毒失活或抑制PCR,脫脂棉含有熒光物質(zhì),影響實(shí)時(shí)應(yīng)熒光定量PCR結(jié)果。
2.6 加強(qiáng)基層動(dòng)物防疫人員采樣技術(shù)培訓(xùn)。通過組織骨干現(xiàn)場示范、防疫人員現(xiàn)場實(shí)踐等方式舉辦實(shí)驗(yàn)室技術(shù)培訓(xùn)以及技術(shù)比武,同時(shí)發(fā)放自制的采樣視頻音像資料以期提高技術(shù)水平。
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[5]人感染H7N9禽流感病毒標(biāo)本采集及運(yùn)送技術(shù)規(guī)范.
10.3969/J.ISSN.1671-6027.2015.11.008
尹子靜(1963~),山西省興縣人,主要從事動(dòng)物疫病防治工作