‘雪球’海棠組織培養(yǎng)體系的建立與優(yōu)化

王冰潔，李厚華，闕 怡，魏新翠，王亞杰

(1 西北農(nóng)林科技大學 林學院，陜西 楊凌712100；2 重慶大學城市科技學院 建筑學院，重慶402167)

‘雪球’海棠組織培養(yǎng)體系的建立與優(yōu)化

王冰潔1，李厚華1，闕 怡2，魏新翠1，王亞杰1

(1 西北農(nóng)林科技大學 林學院，陜西 楊凌712100；2 重慶大學城市科技學院 建筑學院，重慶402167)

【目的】 建立‘雪球’海棠離體植株組織培養(yǎng)快繁體系，并對組織培養(yǎng)體系進行優(yōu)化。【方法】 以‘雪球’海棠當年生莖段為起始接種材料，獲得無菌苗，利用無菌苗和試管苗葉片為材料，以MS為基礎培養(yǎng)基，采用正交試驗研究不同激素及其配比對雪球組培苗擴繁、植株再生和組培苗生根的影響?！窘Y果】 用2 g/L HgCl2處理‘雪球’海棠莖段外植體是較為恰當?shù)南炯矮@得無菌苗的方法。在MS+2.5 mg/L 6-BA+0.3 mg/L IBA培養(yǎng)基中組培苗的總增殖倍數(shù)最高，為9.11，為最適增殖培養(yǎng)基；在MS+0.5 mg/L 6-BA+0.3 mg/L IBA培養(yǎng)基中組培苗的總增殖倍數(shù)為6.38，分化的芽生長良好，無玻璃化，為獲取葉盤不定芽再生試驗用葉片的最適培養(yǎng)基。在MS+0.2 mg/L TDZ+0.1 mg/L NAA培養(yǎng)基(以山梨醇為碳源)中，葉盤不定芽再生效率最高，為60.71%，為不定芽再生最適培養(yǎng)基?！┣颉Ｌ纳菀?，在1/2 MS+0.2 mg/L IBA培養(yǎng)基中，組培苗培養(yǎng)7 d開始生根，生根率為100.0%?！窘Y論】 建立了‘雪球’海棠組織培養(yǎng)體系，明顯提高了其繁殖速率，使其生根率可達到100.0%。

‘雪球’海棠；組織培養(yǎng)；植株再生；生根誘導

‘雪球’海棠(Malus‘Snow drift’)為薔薇科蘋果屬植物，是中國從美國引進的白色花海棠品種，其樹形整齊、均勻，樹冠開展，株型緊湊，葉色鮮亮，春夏兩季綠意盎然；花苞淡粉色，花期4月中下旬，花開后純白色，花團錦簇，遠觀如一團雪球，甚是可愛，叢植和孤植觀賞效果俱佳[1]?！┣颉Ｌ墓麑嵆墒鞎r呈亮桔紅色，可食用，觀果期長，從8月至冬季，落葉后一簇簇紅色的果子掛滿枝頭，不僅觀賞價值很高，還可以為庭園吸引鳥類。另外，‘雪球’海棠抗寒性和抗旱性均較好[2-3]，抗病能力強，是園林綠化及美化環(huán)境的優(yōu)良品種，具有很好的市場前景。但是由于該種是近年才從國外引進的品種，繁殖主要依賴于枝條的嫁接，繁殖速度很慢，成本高、效率低，不能滿足國內需求[1]，而植物組培快繁技術是解決此類問題的最有效途徑。目前關于蘋果的組織培養(yǎng)研究已經(jīng)取得了一些成果[4]，但對海棠組織培養(yǎng)的研究較少。本試驗在借鑒蘋果組織培養(yǎng)研究成果的基礎上，對‘雪球’海棠組織培養(yǎng)體系的建立與優(yōu)化進行了研究，以期為‘雪球’海棠的快速繁殖及實現(xiàn)工廠化生產(chǎn)奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 植物材料

10年生以上‘雪球’海棠健康且?guī)в酗枬M腋芽的當年生枝條，采自北京植物園海棠栒子園。

1.2 外植體消毒

去掉‘雪球’海棠枝條上的葉片，僅保留一小段葉柄，流水沖洗1 h，置于添加Tween 20(每升2～3滴)的無菌水中攪拌浸泡30 min，在超凈工作臺上用體積分數(shù)75%酒精消毒1 min，無菌水清洗2次，再分別用1和2 g/L的HgCl2處理8 min，無菌水清洗3次，備用。

1.3 初代培養(yǎng)獲取無菌苗

將經(jīng)消毒處理的‘雪球’海棠枝條切成1～2 cm帶1個腋芽的莖段，接種到用于蘋果擴繁的培養(yǎng)基(MS+1 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IBA)上，30 d后統(tǒng)計褐化率、污染率、出芽率及成活率。將萌發(fā)后的無菌莖段接種到相同培養(yǎng)基上進行初代培養(yǎng)，以獲得足夠的無菌苗進行擴繁培養(yǎng)基的優(yōu)化。

1.4 6-BA及IBA對‘雪球’海棠組培苗增殖的影響

選擇初代培養(yǎng)獲得的健壯的‘雪球’海棠無菌苗作為試驗材料，以MS(30 g/L蔗糖+7 g/L瓊脂，pH 5.8)為基礎培養(yǎng)基，添加不同質量濃度6-BA(0.5，1.5，2.5 mg/L)與IBA(0.1，0.2，0.3 mg/L)，進行正交試驗組合設計，另設置3個對照組，分別為MS、MS+1.5 mg/L 6-BA、MS+0.2 mg/L IBA。試驗共設置12種組合，每種組合接種15株組培苗，重復3次。培養(yǎng)條件：溫度(23±2) ℃，光照強度2 000 lx，光周期為光照16 h/黑暗8 h。30 d后統(tǒng)計增殖及植株生長情況。

總增殖倍數(shù)=總擴增的組培苗數(shù)/原接種的組培苗數(shù)，增殖倍數(shù)=(新增組培苗數(shù)+接種組培苗數(shù))/原接種的組培苗數(shù)。株高用坐標紙測量。

對組培苗的健康指數(shù)進行統(tǒng)計，健康指數(shù)分為3個等級：1級.擴增組培苗玻璃化，植株水漬狀或植株葉片枯黃死亡；2級.組培苗無玻璃化，但莖干細弱，葉片過小或過大老化，可用于擴繁但不能取葉再生；3級.擴增組培苗生長健壯，葉片大小適中，葉片鮮綠[5]。

1.5 TDZ及NAA對葉盤不定芽再生的影響

選擇繼代培養(yǎng)30 d左右長出的健壯組培苗，取其頂部完全展開的最幼嫩葉片，切成0.5 cm2的葉盤，生理正面向下培養(yǎng)。再生培養(yǎng)基以MS(7 g/L瓊脂，pH 5.8)為基礎培養(yǎng)基，以30 g/L山梨醇替換蔗糖作為碳源[6-7]，添加不同質量濃度的TDZ(0.2，0.6，1.0，1.5 mg/L)與NAA(0.1，0.3，0.5 mg/L)，將二者進行正交試驗組合設計，共設置12種組合。每種組合15 個葉盤，重復3次。23 ℃下暗培養(yǎng)2周[8],誘導出愈傷組織后轉入光照(2 000 lx，光照16 h/黑暗8 h)下培養(yǎng)進行不定芽分化。每2周更換1次培養(yǎng)基。14 d后統(tǒng)計愈傷組織誘導情況，60 d后統(tǒng)計不定芽分化情況。

將愈傷組織分為4個等級：0級.無愈傷組織；1級.僅在主葉脈的切口處有極少量愈傷組織；2級.僅在一端切口處誘導出大量愈傷組織，另一端愈傷量較少或無；3級.兩端切口處均長滿致密的愈傷組織[5]。愈傷組織誘導率=誘導出愈傷組織的葉盤數(shù)/接種葉盤總數(shù)×100%；葉盤再生效率=再生出芽的葉片數(shù)/接種葉片數(shù)×100%。

1.6 IBA對生根的影響

以繼代培養(yǎng)30～35 d后長出的1.5 cm以上的健壯組培苗為材料進行生根誘導。以1/2 MS(30 g/L蔗糖+7 g/L瓊脂，pH 5.8)為基礎培養(yǎng)基[5,9]，添加不同質量濃度的IBA(0，0.1，0.2，0.3 mg/L)，每處理9株苗，重復3次。出根前在室內自然光下培養(yǎng)，出根后移至正常組培光照(2 000 lx)下培養(yǎng)，40 d后統(tǒng)計生根率及根生長情況。生根率=(生根的組培苗數(shù)/接種組培苗數(shù))×100%。

1.7 數(shù)據(jù)分析方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件對試驗數(shù)據(jù)進行方差分析和多重比較分析。

2 結果與分析

2.1 不同質量濃度HgCl2對‘雪球’海棠外植體消毒效果的比較

本研究共接種‘雪球’海棠側芽188個，結果(表1)表明，用2 g/L HgCl2處理‘雪球’海棠側芽外植體的污染率比1 g/L HgCl2處理低，且污染主要發(fā)生在接種后的前10 d，在接種后10～20 d時污染率增加幅度明顯變??；而用1 g/L HgCl2處理的材料在接種后20 d內持續(xù)有污染；接種20 d后，2和1 g/L HgCl2處理的材料污染率均不再增加。2種HgCl2處理下，材料的褐化率均為0。2 g/L HgCl2處理的出芽率和成活率是1 g/L HgCl2處理的1.58倍和1.86倍。表明用2 g/L HgCl2處理‘雪球’海棠側芽外植體，其消毒及獲得無菌苗的效率比用1 g/L HgCl2處理高，所以2 g/L HgCl2應較為適宜用于‘雪球’海棠莖段外植體的消毒(圖1-A)。

圖1 ‘雪球’海棠的組織培養(yǎng)
A.莖段外植體腋芽萌發(fā)；B.莖段愈傷組織誘導的不定芽；C.組培苗腋芽萌發(fā)芽；D.擴繁培養(yǎng)基K3組中的組培苗；E.再生培養(yǎng)基Z1組中再生的葉盤不定芽；F.生根培養(yǎng)基R2中組培苗的生根情況
Fig.1 Tissue culture ofMalus‘Snow drift’
A.Stem segment explants germinated axillary buds;B.Adventitious buds from callus induction;C.Adventitious buds from tissue-cultured axillary buds;D.Seedlings cultured in the propagation medium K3;E.Leaf dish adventitious buds regeneration cultured in regeneration medium Z1;F.Seedlings cultured in rooting medium R2

2.2 6-BA及IBA配比對‘雪球’海棠組培苗增殖的影響

‘雪球’海棠擴繁苗有2種發(fā)生途徑：一是通過莖端愈傷組織誘導芽(圖1-B)；二是通過腋芽直接萌發(fā)芽(圖1-C)。培養(yǎng)30 d后的結果(表2)表明，當IBA質量濃度相同時，總增殖倍數(shù)隨著6-BA質量濃度的增加呈增大趨勢，腋芽萌發(fā)芽的增殖倍數(shù)也隨6-BA質量濃度的增加而明顯增大，但莖端愈傷組織誘導芽的增殖倍數(shù)隨6-BA質量濃度的增加變化規(guī)律不明顯；在不含6-BA的培養(yǎng)基中沒有愈傷組織誘導芽的產(chǎn)生，而是誘導植株生根，并且植株粗壯、葉大，說明IBA對‘雪球’海棠有促進生根的作用。當6-BA質量濃度相同時，隨著IBA質量濃度的增加，2種方式擴繁的新生苗的苗高均呈遞增趨勢。無論是愈傷組織誘導芽還是腋芽萌發(fā)芽長成的組培苗，在IBA質量濃度相同時，在高質量濃度6-BA培養(yǎng)基中的組培苗苗高較低質量濃度6-BA培養(yǎng)基中的矮，說明高質量濃度6-BA有抑制組培苗增高的趨勢。腋芽萌發(fā)芽的健康指數(shù)明顯比莖端愈傷組織誘導芽高。在K9組中，‘雪球’海棠組培苗的總增殖倍數(shù)為9.11，莖端愈傷組織誘導芽和腋芽萌發(fā)芽的健康指數(shù)均為2，為最適增殖培養(yǎng)基。在K3組中，組培苗的總增殖倍數(shù)為6.38，愈傷組織誘導芽的健康指數(shù)為2，腋芽萌發(fā)芽的健康指數(shù)為3，且2種組培苗均為同系列中最高(圖1-D)，因此K3組為獲取葉盤不定芽再生試驗葉片的最適培養(yǎng)基。

注：同列數(shù)據(jù)后標不同小寫字母者表示用Duncan’s法檢測在P<0.05水平上差異顯著，下表同。*.生根率(%)。

Note:Different lowercase letters in each column indicate significant difference by Duncan’s test atP<0.05.The same below.* indicates rooting rate (%).

2.3 TDZ及NAA配比對‘雪球’海棠離體葉盤不定芽再生的影響

14 d暗培養(yǎng)后，不同質量濃度TDZ和NAA組合的12種處理均能誘導出愈傷組織，且愈傷組織誘導率均能達到100%。培養(yǎng)60 d時葉盤再生情況見表3。

由表3可知，不同質量濃度TDZ和NAA配比處理對‘雪球’海棠葉盤再生效率和平均再生芽數(shù)均影響顯著。當NAA質量濃度相同時，在TDZ質量濃度小于1.0 mg/L時，隨TDZ質量濃度的增加，葉盤再生效率整體呈現(xiàn)增長趨勢，但當TDZ質量濃度達到1.5 mg/L時，葉盤再生效率顯著減小。在Z1組中，葉盤再生效率最高，為60.71%；在Z9組中,葉平均再生芽數(shù)最多，為5.78個，顯著高于其他組別，但本組葉盤再生效率卻低于Z1組。綜合考慮，選擇Z1組為最適的‘雪球’海棠離體葉盤不定芽再生培養(yǎng)基(圖1-E)。

2.4 IBA對‘雪球’海棠組培苗生根的影響

將健康的‘雪球’海棠組培苗接種到含不同質量濃度IBA的培養(yǎng)基中，于室內自然光下培養(yǎng)后，最早5 d開始生根。40 d后的生根培養(yǎng)結果(表4)表明，‘雪球’海棠生根容易，當IBA質量濃度為0.2 mg/L時，生根率達到了100.0%(圖1-F)；在不含IBA的培養(yǎng)基中，‘雪球’海棠的生根率較低，出根時間長且須根少；在含有IBA的培養(yǎng)基中，組培苗生根率均較高，且低質量濃度(0.1～0.2 mg/L)的IBA有利于須根的生長，隨著IBA質量濃度的升高出根時間逐漸延遲。綜合考慮，選擇1/2 MS+0.2 mg/L IBA為‘雪球’海棠最適生根培養(yǎng)基。

3 討 論

‘雪球’海棠組培苗的擴增有2種發(fā)生途徑：通過莖端愈傷組織誘導不定芽或通過腋芽直接萌發(fā)芽。已有的研究表明，絕大多數(shù)蘋果屬植物均是通過前一種途徑誘導分化芽進行擴增[8,10-11]，通過誘導腋芽萌發(fā)芽進行擴增的途徑報道較少，在已有報道中，蘋果屬組培苗需切掉莖尖去除頂端優(yōu)勢才會刺激腋芽生長[12-13]。而本試驗中‘雪球’海棠組培苗不需去除頂端優(yōu)勢即可直接使側芽萌發(fā)成苗。‘雪球’海棠腋芽易萌發(fā)的特性，一方面可顯著提高擴增效率；另一方面愈傷組織誘導芽要經(jīng)過脫分化再分化的過程，而腋芽萌發(fā)芽直接從原植株的芽萌發(fā)，這能夠降低突變發(fā)生的概率，有利于植株優(yōu)良性狀的保持。此外，在篩選的最適增殖培養(yǎng)基中，通過腋芽萌發(fā)產(chǎn)生的芽不會出現(xiàn)玻璃化問題，其健康指數(shù)均高于相同培養(yǎng)條件下由愈傷組織誘導產(chǎn)生的芽，所以在‘雪球’海棠組培苗擴繁或保存過程中，可優(yōu)先選擇腋芽萌發(fā)產(chǎn)生的植株作為材料。

基因型是影響蘋果屬離體葉盤再生的關鍵因素，即蘋果屬不同種或不同品種在相似的培養(yǎng)條件下，其再生的難易程度及再生效率差異很大[4,11,14]。本研究對‘雪球’海棠離體葉盤不定芽再生的優(yōu)化試驗結果表明，隨著TDZ和NAA質量濃度的變化，葉盤再生效率和平均再生芽數(shù)呈現(xiàn)一定變化規(guī)律，且在一定的激素質量濃度比(TDZ與NAA質量濃度比為2∶1)下，葉盤再生效率高于其他組合，這與吳雅琴等[14]的研究結果相似，而與其他研究結果相差較大[4,11]。

蘋果屬植物嫁接繁殖速度慢，扦插繁殖生根率低[15]，種子繁殖不能保持親本的優(yōu)良性狀，普通繁殖方法不能實現(xiàn)快速繁殖。而本試驗建立的‘雪球’海棠快繁體系擴繁效率高，總增殖倍數(shù)最高可達9.11；組培苗生根容易，在優(yōu)化的生根培養(yǎng)基中其生根率可達到100.0%，極大地提高了‘雪球’海棠的繁殖速率，為‘雪球’海棠的快速繁殖和工業(yè)化生產(chǎn)提供了很好的理論依據(jù)。

園林應用中的海棠種類繁多，但是花色多為紅色系或白色，沒有黃色系。筆者曾經(jīng)嘗試通過基因工程調控紅色花海棠中黃色色素的生物合成，化學分析結果表明，黃色色素合成增加，但因為黃色被紅色所覆蓋，花未能呈現(xiàn)黃色(未發(fā)表)。由于‘雪球’海棠花色為白色，所以它可以作為海棠花色研究的良好材料。本試驗建立的‘雪球’海棠組織培養(yǎng)體系為進一步通過基因工程進行海棠花色研究奠定了基礎。

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Establishment and optimization of tissue culture system forMalus‘Snow drift’

WANG Bing-jie1,LI Hou-hua1,QUE Yi2,WEI Xin-cui1,WANG Ya-jie1

(1CollegeofForestry,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi712100,China; 2CityCollegeofScienceandTechnology,ChongqingUniversity,Chongqing402167,China)

【Objective】 This study aimed to establish and optimize a tissue culture system forMalus‘Snow drift’.【Method】 Stems with buds of Malus ‘Snow drift’ were used as explants to obtain aseptic seedlings.Using aseptic seedlings and leaves as materials and MS as basal medium,orthogonal test was conducted to analyze the effects of hormone on propagation,shoots regeneration and rooting of tissue cultured seedlings.【Result】 The treatment with 2 g/L HgCl2was efficient for disinfecting and obtaining aseptic seedlings.The optimum medium for shoot proliferation was MS+2.5 mg/L 6-BA+0.3 mg/L IBA with the average proliferation of 9.11.The optimum medium for healthy leaves was MS+0.5 mg/L 6-BA+0.3 mg/L IBA with the average proliferation of 6.38,and the health index was highest.The optimum medium for adventitious shoot regeneration was MS+0.2 mg/L TDZ+0.1 mg/L NAA and using sorbitol as carbon source,with the highest regeneration rate of 60.71%.The optimum medium for rooting was 1/2 MS+0.2 mg/L IBA,with the rooting rate of 100.0% after 7 d.【Conclusion】 The established tissue culture system forMalus‘Snow drift’ improved the reproduction rate significantly with the rooting rate of up to 100.0%.

Malus‘Snow drift’;tissue culture;shoots regeneration;root induction

2013-11-04

國家林業(yè)公益性行業(yè)科研專項(201204308)；高等學校博士學科點專項(20120204120006)

王冰潔(1989-)，女，河北邢臺人，在讀碩士，主要從事植物分子生物學研究。E-mali：bingjie_wang@nwsuaf.edu.cn

李厚華(1973-)，男，山東濟寧人，副教授，碩士生導師，主要從事植物基因工程和類黃酮次生代謝研究。 E-mail:lihouhua73@163.com

時間:2015-01-19 09:19

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.03.002

S661.404+.7

A

1671-9387(2015)03-0077-06

網(wǎng)絡出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20150119.0919.002.html