腹瀉糞便中金黃色葡萄球菌兩種檢測方法的對比分析

李文華　劉增香　謝　桃　張雪霞

中山大學(xué)附屬第五醫(yī)院　1　檢驗(yàn)科　2　兒科　3　體檢科　4　麻醉科，廣東省珠海市　519000

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腹瀉糞便中金黃色葡萄球菌兩種檢測方法的對比分析

李文華1劉增香2謝桃3張雪霞4

中山大學(xué)附屬第五醫(yī)院1檢驗(yàn)科2兒科3體檢科4麻醉科，廣東省珠海市519000

摘要目的：分析腹瀉糞便中金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)的臨床價(jià)值。方法：收集2014年1-12月本院收治的1 326例腹瀉患者臨床資料，均采取PCR基因擴(kuò)增法及細(xì)菌培養(yǎng)方法進(jìn)行糞便中金黃色葡萄球菌的檢測，分析患者臨床特征，最后探討其方法的檢測價(jià)值。結(jié)果：1 326例腹瀉患者中，PCR檢出金黃色葡萄球菌性比例為10.41%，明顯高于培養(yǎng)法的6.49%，差異顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；PCR方法檢出的138例金黃色葡萄球菌性大多是兒童，腸外并發(fā)癥發(fā)生率為28.99%，明顯高于陰性患者的9.09%，差異顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論：相比于培養(yǎng)法，PCR法在金黃色葡萄球菌的臨床檢驗(yàn)中的檢出率較高，值得臨床推廣應(yīng)用。

關(guān)鍵詞腹瀉金黃色葡萄球菌PCR檢測培養(yǎng)法

金黃色葡萄球菌引起的腸炎屬于一種全球性的腸道傳染疾病，患者可出現(xiàn)嚴(yán)重的胃腸炎、腹瀉等臨床癥狀，并發(fā)敗血癥、呼吸道、腸道外并發(fā)癥等疾病[1]，金黃色葡萄球菌主要是通過產(chǎn)生的腸毒素對人體構(gòu)成危害。為了探討腹瀉糞便中金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)的臨床價(jià)值，2014年1-12月，本院對收治的腹瀉患者留取糞便，分別采取PCR基因擴(kuò)增方法與細(xì)菌培養(yǎng)方法進(jìn)行金黃色葡萄球菌的檢測，現(xiàn)介紹如下。

1資料與方法

1.1一般資料收集2014年1-12月本院收治的1 326例腹瀉患者臨床資料，其中男764例，女562例，年齡5個(gè)月~79歲，平均年齡(28.82±4.76)歲。其中成年患者518例，未成年患者808例。所有患者每天排便次數(shù)均超過3次，并伴隨性狀改變。

1.2所需物品

1.2.1化學(xué)試劑：Taq酶、DNA標(biāo)記引物(正向引物、反向引物)購自大連寶生物工程公司，F(xiàn)TA緩沖液購自Whatama公司。血平板、麥康凱平板、高鹽甘露醇(MS)培養(yǎng)基、轉(zhuǎn)運(yùn)肉湯購自鄭州博賽生物公司。

1.2.2實(shí)驗(yàn)儀器：PCR基因擴(kuò)增儀，DXY-33A型電泳儀，華粵企業(yè)集團(tuán)有限公司UVIpro凝膠成像系統(tǒng)，德國HELA公司生產(chǎn)的CO2恒溫培養(yǎng)箱，美國BD公司鳳凰100全自動細(xì)菌鑒定儀。

1.3方法1 326例腹瀉患者均采取PCR基因擴(kuò)增法與細(xì)菌培養(yǎng)方法進(jìn)行金黃色葡萄球菌的檢測，觀察患者臨床特征，探討PCR方法的檢測價(jià)值。在Cary-Blair保存液內(nèi)放置患者糞便樣本，樣本量是0.5g，置于增菌液中進(jìn)行培養(yǎng)。(1)PCR方法：取0.5g糞便加入4.5ml生理鹽水混勻，將200μl混合物提取出來后，提取DNA。擴(kuò)增產(chǎn)物的長度是279bp，反應(yīng)預(yù)混合液、模板、引物等成為了反應(yīng)體系的重要組成部分。反應(yīng)溫度在94℃下，通過變性、循環(huán)、電泳及成像技術(shù)檢測糞便中金黃色葡萄球菌的耐熱核酸酶基因(NUC)。(2)培養(yǎng)法：將保存液中的糞便接種在血平板和麥康凱平板、高鹽甘露醇(MS)培養(yǎng)基上，挑取高鹽甘露醇(MS)培養(yǎng)基上金黃色可疑菌落或者血平板上有溶血環(huán)的菌落，通過鑒定儀做細(xì)菌鑒定。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法本文數(shù)據(jù)均采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理，計(jì)數(shù)資料對比采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1對比PCR法及細(xì)菌培養(yǎng)方法的金黃色葡萄球菌檢出率1 326例腹瀉患者中，PCR法對金黃色葡萄球菌性腸炎的檢出率為10.41%(138/1326)，培養(yǎng)法對金黃色葡萄球菌性腸炎的檢出率為6.49%(86/1326)，兩種方法檢出率對比，差異顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2對比金黃色葡萄球菌陽性與陰性患者特征PCR檢出金黃色葡萄球菌腸炎138例中大多為兒童，占77.54%，與陰性相比差異顯著(P<0.05)，大多數(shù)出現(xiàn)胃腸道方面的臨床癥狀。陽性出現(xiàn)腸外并發(fā)癥為28.99%，明顯高于陰性患者的9.09%，差異顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1　金黃色葡萄球菌陽性與陰性患者特征比較〔n(%)〕

注：與陰性患者對比，*P<0.05，差異顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3討論

金黃色葡萄球菌的臨床癥狀主要包括胃腸型癥狀、腸道外感染等[2]。胃腸型癥狀主要出現(xiàn)腹瀉腹痛、惡心嘔吐等現(xiàn)象，腸道外的感染主要包括肝脾、自身免疫性疾病以及關(guān)節(jié)炎、腦膜炎等。此疾病的感染傳播主要通過進(jìn)食污染嚴(yán)重的食物、水，由金黃色葡萄球菌引起的腹瀉具有明顯的季節(jié)性，呈夏秋高、冬春低的規(guī)律，通過了解患者病史，發(fā)現(xiàn)52.6%的病例有進(jìn)食隔日剩下的熟食或食用涼拌菜等情況，這些食品尤其在夏季是細(xì)菌生長的良好環(huán)境，細(xì)菌繁殖極快，食用后最容易引起急性腹瀉，提高了感染的發(fā)生率。另外，在臨床中沒有正確認(rèn)識與重視金黃色葡萄球菌，濫用非敏感性抗生素，導(dǎo)致腸道菌群的嚴(yán)重失調(diào)，也會加劇腸道外并發(fā)癥，從而難以改善患者預(yù)后情況。

在本次調(diào)查中，分別采取PCR[3]及細(xì)菌培養(yǎng)方法分離金黃色葡萄球菌。細(xì)菌培養(yǎng)法方便簡單，但是實(shí)驗(yàn)員需要利用肉眼判斷，其判斷缺乏準(zhǔn)確性，補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)多，而且培養(yǎng)時(shí)間較長。PCR基因擴(kuò)增法的檢出率比較高，需要檢測時(shí)間較短，減少了污染的幾率[4]。目前國內(nèi)外采用的PCR 方法檢測致病菌一般都需要進(jìn)行前增菌，雖然能提高檢測的靈敏度，但相應(yīng)的增加了檢測的時(shí)間，一般延長2 ～12h。本試驗(yàn)采用FTA 濾膜直接提取DNA 模板，無需增菌[5]，方法操作簡便、快速，有效避免了工作人員在處理標(biāo)本時(shí)可能造成的感染。

在本文中，分析了金黃色葡萄球菌感染的腹瀉患者的臨床特征，兒童發(fā)生率為77.54%；患者腸胃炎發(fā)生率為59.42%，闌尾炎發(fā)生率為11.59%，腸外并發(fā)癥發(fā)生率為28.99%。這主要是兒童沒有形成良好的飲食衛(wèi)生習(xí)慣，提高了糞口傳播感染的發(fā)生率。隨著金黃色葡萄球菌耐藥率的增加，也構(gòu)成了其定植或者傳染的主要因素[6]。因此，家長應(yīng)該加強(qiáng)對兒童的健康教育，勤洗手，不吃不衛(wèi)生的食品和過期的食品。患者大多數(shù)出現(xiàn)腸胃道等癥狀，臨床醫(yī)生應(yīng)該結(jié)合其他檢查方法鑒別患者合并疾病，再采取合適的治療方案。

綜上所述，在糞便中檢出金黃色葡萄球菌，PCR法比細(xì)菌培養(yǎng)法具有更高的檢出率；而且本次資料表明金黃色葡萄球菌是引起急性腸道感染的主要病原之一，以往由于缺少常規(guī)檢測手段，由此類細(xì)菌感染引起的急性腹瀉不能及時(shí)被明確診斷，從而造成實(shí)驗(yàn)室漏檢和臨床誤診。在臨床中更加需要重視患者腸道外表現(xiàn)，采取早期細(xì)菌檢驗(yàn)，對改善患者預(yù)后情況具有積極作用。

參考文獻(xiàn)

[1]巢國祥,焦新安,周麗萍，等.食源性金黃色葡萄球菌流行特征、產(chǎn)腸毒素特性及耐藥性研究〔J〕.中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志,2006,16(8):904-907.

[2]張愛華,劉瑜.腹瀉糞便中金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)的價(jià)值分析〔J〕.中外醫(yī)學(xué)研究,2013,11(4):72-73.

[3]付素蘭,劉景武,孫文澤.一種快速簡便的模板提取方法用于PCR檢測糞便中的金黃色葡萄球菌的研究〔J〕.河北醫(yī)藥，2014,5(36):1295-1297.

[4]鄭浩軒,姜泊.金黃色葡萄球菌感染在腹瀉病人中的臨床調(diào)查〔C〕//2010年廣東省中醫(yī)、中西醫(yī)結(jié)合脾胃消化病學(xué)術(shù)會議論文集,2010:167-168.

[5]Tack LC,Thomas M,Reich K.Automated forensic DNA purification optimized for FTA card punches and identifiable STR-based PCR analysis〔J〕.Clin Lab Med,2007,27(1):183-191.

[6]許磊,曾德唯,甘忠志,等.重慶市南岸區(qū)2009-2010年感染性腹瀉病原菌監(jiān)測及藥敏結(jié)果分析〔J〕.重慶醫(yī)學(xué),2012,8(41):2402-2404.

(編輯紫蘇)

收稿日期2015-03-29

中圖分類號：R446.1

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：B

文章編號：1001-7585(2015)18-2522-02