藏雪蓮水提取物對(duì)中波紅斑效應(yīng)紫外線輻射后人角質(zhì)形成細(xì)胞中蛋白表達(dá)的影響研究

郭 硯，孫 娟，王麗雯

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·論著·

藏雪蓮水提取物對(duì)中波紅斑效應(yīng)紫外線輻射后人角質(zhì)形成細(xì)胞中蛋白表達(dá)的影響研究

郭 硯，孫 娟，王麗雯

目的 探討藏雪蓮水提取物對(duì)中波紅斑效應(yīng)紫外線(UVB)輻射后人角質(zhì)形成細(xì)胞(HaCaT細(xì)胞)中白介素6(IL-6)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、p38絲裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)、p53、B細(xì)胞淋巴瘤因子2(Bcl-2)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)、半胱氨酸蛋白酶3(Caspase-3)的表達(dá)水平。方法 體外培養(yǎng)HaCaT細(xì)胞，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為3組，對(duì)照組、UVB輻射組(UVB 30 mJ/cm2，輻射1 h)、藏雪蓮水提取物組(UVB 30 mJ/cm2，輻射1 h+藏雪蓮 5 g/L)，藏雪蓮水提取物于UVB輻射前1 h加入細(xì)胞培養(yǎng)基中，輻射后18 h，收集細(xì)胞，采用臺(tái)盼藍(lán)染色觀察細(xì)胞形態(tài)，檢測(cè)HaCaT細(xì)胞IL-6、TNF-α、p38MAPK、p53、Bcl-2、Bax、Caspase-3表達(dá)水平。結(jié)果 臺(tái)盼藍(lán)染色顯示，UVB輻射組與對(duì)照組比較，HaCaT細(xì)胞藍(lán)染數(shù)量增加，并出現(xiàn)腫脹、細(xì)胞漂浮，但仍可看出細(xì)胞形態(tài)；藏雪蓮水提取物組與UVB輻射組比較，HaCaT細(xì)胞藍(lán)染數(shù)量下降，細(xì)胞水腫程度減輕，并且細(xì)胞形態(tài)接近對(duì)照組。UVB輻射組與對(duì)照組比較，HaCaT細(xì)胞IL-6、TNF-α、p38MAPK、p53、Bax、Caspase-3表達(dá)水平升高，Bcl-2表達(dá)水平降低(P<0.05)；藏雪蓮水提取物組與UVB輻射組比較，HaCaT細(xì)胞IL-6、TNF-α、p38MAPK、p53、Bax、Caspase-3表達(dá)水平降低，Bcl-2表達(dá)水平升高(P<0.05)。結(jié)論 藏雪蓮水提取物能夠降低UVB輻射后HaCaT細(xì)胞IL-6、TNF-α、p38MAPK、p53、Bax、Caspase-3表達(dá)水平，升高 Bcl-2表達(dá)水平。

紫外線；輻射；藏雪蓮；角質(zhì)形成細(xì)胞；白介素6；腫瘤壞死因子α

郭硯，孫娟，王麗雯.藏雪蓮水提取物對(duì)中波紅斑效應(yīng)紫外線輻射后人角質(zhì)形成細(xì)胞中蛋白表達(dá)的影響研究[J].中國(guó)全科醫(yī)學(xué)，2015，18(24)：2929-2933.[www.chinagp.net]

Guo Y,Sun J,Wang LW.Influence of Saussurea tridactyla Sch-Bip water extracts on the protein expression of HaCaT cells after UVB radiation[J].Chinese General Practice，2015，18(24)：2929-2933.

藏雪蓮絕大部分產(chǎn)于我國(guó)青藏高原及其毗鄰地區(qū),屬菊科鳳毛菊屬雪蓮亞屬草本植物，是傳統(tǒng)珍貴藏藥，含有揮發(fā)油、生物堿、甾醇、黃酮類(lèi)、酚類(lèi)、糖類(lèi)、鞣質(zhì)原糖和16種氨基酸、雪蓮內(nèi)酯以及鉀、鈣、鋅、鐵、鎂等元素,具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。中波紅斑效應(yīng)紫外線(UVB)(280～319 nm)輻射損傷是引起皮膚光老化最重要的因素，主要損傷皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞(HaCaT細(xì)胞)。已有研究證實(shí)，UVB輻射后可升高白介素6(IL-6)[1]、腫瘤壞死因子α(TNF-α)[2],降低線粒體膜電位并升高細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+[3]，激活p38激酶[4-6]，抑制B細(xì)胞淋巴瘤因子2(Bcl-2)的表達(dá)[7]，進(jìn)而引起半胱氨酸蛋白酶(Caspase)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，引起細(xì)胞凋亡[8]。藏雪蓮水提取物5 g/L能夠減輕UVB輻射后HaCaT細(xì)胞的氧化損傷[9]，但關(guān)于p38絲裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)、p53、Bcl-2、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)、Caspase-3表達(dá)尚未見(jiàn)報(bào)道。故本研究觀察藏雪蓮水提取物對(duì)UVB輻射后HaCaT細(xì)胞中IL-6、TNF-α、p38MAPK、p53、Bcl-2、Bax、Caspase-3的表達(dá)，探討其減輕輻射損傷的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 藏雪蓮購(gòu)自青海眾康醫(yī)藥連鎖有限公司，HaCaT細(xì)胞購(gòu)自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；10%胎牛血清(FBS)購(gòu)自Biological Industries，DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自賽默飛世爾生物化學(xué)制品(北京)有限公司，胰酶購(gòu)自Solarbio公司，臺(tái)盼藍(lán)染色液購(gòu)自美國(guó)Sigma生物公司，IL-6酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒及TNF-α ELISA試劑盒購(gòu)自武漢優(yōu)爾生科技股份有限公司；人p38MAPK酶聯(lián)免疫試劑盒、人p53酶聯(lián)免疫試劑盒、人Bcl-2酶聯(lián)免疫試劑盒、人Bax酶聯(lián)免疫試劑盒、人Caspase-3酶聯(lián)免疫試劑盒均購(gòu)自北京瑞格博科技發(fā)展有限公司；二氧化碳(CO2)培養(yǎng)箱購(gòu)自上海力申科學(xué)儀器有限公司,IX71型Olympus倒置顯微鏡購(gòu)自O(shè)lympus,飛利浦TL 20 W/12紫外線UVB燈管購(gòu)自上海杰圖商貿(mào)有限公司，UV-340A UVB輻照度監(jiān)示器購(gòu)自北京精密儀器科技有限公司，X-Mark型bio-rad酶標(biāo)儀購(gòu)自Bio-Rad公司，手持勻漿儀購(gòu)自無(wú)錫沃信儀器有限公司,恒溫混勻儀TS-100購(gòu)自杭州瑞誠(chéng)儀器有限公司。

1.2 藏雪蓮水提取物的提取 根據(jù)文獻(xiàn)[10]，準(zhǔn)確稱(chēng)取100 g藏雪蓮(藏雪蓮經(jīng)青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系陳湘宏副教授鑒定)，加入蒸餾水浸泡過(guò)夜(料液比為1∶5)，加熱至100 ℃后，文火(85 ℃)煎煮2 h，每隔15 min攪拌1次，過(guò)濾，濾渣加蒸餾水后繼續(xù)煎煮，重復(fù)3次，過(guò)濾，合并濾液，冷凍干燥得到藏雪蓮水提取物。以含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基為溶劑，配置成藏雪蓮水提取物5 g/L，并用0.22 μm孔徑過(guò)濾器過(guò)濾，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3 HaCaT細(xì)胞的培養(yǎng) 根據(jù)文獻(xiàn)[11]，HaCaT細(xì)胞以含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基(內(nèi)含10 U/ml青霉素和10 U/ml鏈霉素)，接種于培養(yǎng)瓶后，置于37 ℃，5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱，當(dāng)細(xì)胞達(dá)90%融合時(shí)傳代，取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期3～5代的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組 當(dāng)HaCaT細(xì)胞達(dá)到85%～90%融合時(shí)，將培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的細(xì)胞按1×106ml細(xì)胞濃度傳到96孔板及6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞達(dá)80%～90%融合時(shí)，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為3組，對(duì)照組、UVB輻射組(UVB 30 mJ/cm2，輻射1 h)、藏雪蓮水提取物組(UVB 30 mJ/cm2，輻射1 h+藏雪蓮 5 g/L)。UVB輻射前1 h將HaCaT細(xì)胞用無(wú)菌磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3遍，并將藏雪蓮水提取物加入培養(yǎng)基中，對(duì)照組用錫紙包住置暗處，UVB輻射組和藏雪蓮水提取物組打開(kāi)培養(yǎng)皿蓋，在預(yù)設(shè)好的UVB輻射儀中照射1 h，立即用無(wú)菌PBS洗滌3遍，并加含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)18 h。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1 臺(tái)盼藍(lán)染色 將含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基的96孔板，無(wú)菌PBS洗滌3遍，各組細(xì)胞中每孔加入0.4%臺(tái)盼藍(lán)染色液50 μl，3 min，IX71型Olympus倒置顯微鏡照相系統(tǒng)觀察并攝片。

1.5.2 IL-6、TNF-α表達(dá)水平檢測(cè) 貼壁細(xì)胞用胰液消化，手持勻漿儀裂解細(xì)胞，1 500×g離心10min后，吸取上清液，將100 μl不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品(0～100 pg/ml IL-6、0～1 000 pg/ml TNF-α)及樣本(各組細(xì)胞的上清液)加入酶標(biāo)板，覆膜后37 ℃溫育2 h，棄去液體甩干，每孔加A工作液(IL-6、TNF-α ELISA試劑盒內(nèi)配備)100 μl，覆膜后37 ℃溫育1 h，棄去液體，洗板機(jī)洗板3次，甩干后每孔加B工作液(IL-6、TNF-α ELISA試劑盒內(nèi)配備)100 μl，覆膜后37 ℃溫育30 min，棄去液體，洗板機(jī)洗板5次，甩干后每孔加底物溶液90 μl，覆膜后37 ℃避光顯色15～25 min，每孔加終止溶液50 μl，于酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)處測(cè)量各孔的吸光度并記錄結(jié)果，每組單獨(dú)重復(fù)測(cè)量5次。實(shí)驗(yàn)步驟按照IL-6、TNF-α ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.5.3 p38MAPK、p53、Bcl-2、Bax、Caspase-3表達(dá)水平檢測(cè) 貼壁細(xì)胞用胰液消化，手持勻漿儀裂解細(xì)胞，1 500×g離心10 min，吸取上清液，除空白孔外，標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣品孔分別加入標(biāo)準(zhǔn)品(p38MAPK、p53、Bcl-2、Bax、Caspase-3)和樣品(各組細(xì)胞的上清液)50 μl，加入酶標(biāo)試劑50 μl，覆膜后37 ℃孵育1 h，棄去液體，洗板機(jī)洗板5次，每孔加入顯色試劑A、顯色試劑B(p38MAPK、p53、Bcl-2、Bax、Caspase-3試劑盒內(nèi)配備)各50 μl，37 ℃避光顯色10 min，每孔加終止液50 μl，以空白孔調(diào)零后，酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)測(cè)定各孔吸光度并記錄結(jié)果。每組單獨(dú)重復(fù)5次。實(shí)驗(yàn)步驟按照p38MAPK、p53、Bcl-2、Bax、Caspase-3試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 臺(tái)盼藍(lán)染色結(jié)果 UVB輻射組與對(duì)照組比較，HaCaT細(xì)胞藍(lán)染數(shù)量增加，并出現(xiàn)腫脹、細(xì)胞漂浮，但仍可看出細(xì)胞形態(tài)；藏雪蓮水提取物組與UVB輻射組比較，HaCaT細(xì)胞藍(lán)染數(shù)量下降，細(xì)胞水腫程度減輕，并且細(xì)胞形態(tài)接近對(duì)照組(見(jiàn)圖1)。

2.2 3組HaCaT細(xì)胞IL-6、TNF-α表達(dá)水平比較 3組HaCaT細(xì)胞IL-6、TNF-α表達(dá)水平比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；其中UVB輻射組與對(duì)照組比較HaCaT細(xì)胞IL-6、TNF-α表達(dá)水平升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；藏雪蓮水提取物組與UVB輻射組比較HaCaT細(xì)胞IL-6、TNF-α表達(dá)水平降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見(jiàn)表1)。

2.3 3組HaCaT細(xì)胞p38MAPK、p53、Bcl-2、Bax、Caspase-3表達(dá)水平比較 3組HaCaT細(xì)胞p38MAPK、p53、Bcl-2、Bax、Caspase-3表達(dá)水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；其中UVB輻射組與對(duì)照組比較HaCaT細(xì)胞p38MAPK、p53、Bax、Caspase-3表達(dá)水平升高,Bcl-2表達(dá)水平降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；藏雪蓮水提取物組與UVB輻射組比較HaCaT細(xì)胞p38MAPK、p53、Bax、Caspase-3表達(dá)水平降低,Bcl-2表達(dá)水平升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見(jiàn)表2)。

3 討論

青藏高原具有高海拔、強(qiáng)紫外線和缺氧的地理環(huán)境，居住人群長(zhǎng)期暴露于強(qiáng)紫外線中，導(dǎo)致皮膚光老化，引發(fā)多種皮膚疾病,尤其表現(xiàn)在皮膚UVB損傷和皮膚癌發(fā)病率不斷增加。而藏雪蓮是最負(fù)盛名的高山植物之一，性辛熱,有“通經(jīng)活血，祛風(fēng)勝濕”和暖宮散疹等功效,具有散寒除濕、壯陽(yáng)補(bǔ)血、抗炎鎮(zhèn)痛、延緩衰老等作用[12-13]。

UVB損傷皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞是引起皮膚光老化的最重要因素。既往研究證實(shí)，UVB輻射后可升高IL-6[1]、TNF-α[2],降低線粒體膜電位，升高細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+[3]，激活p38激酶[4-6]，活化下游p53，特異地降低Bcl-2的表達(dá)水平[7]，提高Bax的表達(dá)水平，進(jìn)而引起Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，引起細(xì)胞凋亡[8]。但目前為止，藏雪蓮水提取物能否通過(guò)降低IL-6、TNF-α表達(dá)水平，降低UVB輻射后HaCaT細(xì)胞的炎癥損傷以及通過(guò)降低p38MAPK、p53、Bax、Caspase-3，升高Bcl-2，減輕UVB輻射后HaCaT細(xì)胞凋亡，進(jìn)而減輕HaCaT細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化的文獻(xiàn)尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究主要通過(guò)臺(tái)盼藍(lán)染色觀察UVB輻射后HaCaT細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化，并通過(guò)觀察UVB輻射HaCaT細(xì)胞中炎性因子(IL-6、TNF-α)及凋亡相關(guān)因子(p38MAPK、p53、Bax、Bcl-2、Caspase-3)的表達(dá)情況，來(lái)探討藏雪蓮水提取物能否通過(guò)降低炎性因子及凋亡因子來(lái)減輕UVB輻射后HaCaT細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化，進(jìn)而減輕UVB輻射對(duì)HaCaT細(xì)胞的輻射損傷。

Table 1 Comparison of the expression level of IL-6 and TNF-α of HaCaT cells among the three groups

組別IL-6TNF-α對(duì)照組15.77±1.0832.59±1.56UVB輻射組27.46±0.48a79.97±2.96a藏雪蓮水提取物組21.66±0.88b37.12±1.39bF值282.24981.52P值<0.001<0.001

注：UVB=中波紅斑效應(yīng)紫外線，IL-6=白介素6，TNF-α=腫瘤壞死因子α；與對(duì)照組比較，aP<0.05；與UVB輻射組比較，bP<0.05

UVB=中波紅斑效應(yīng)紫外線

圖1 3組HaCaT細(xì)胞臺(tái)盼藍(lán)染色結(jié)果(×10)

注：p38MAPK=p38絲裂原活化蛋白激酶,Bcl-2=B細(xì)胞淋巴瘤因子2,Bax=Bcl-2相關(guān)X蛋白,Caspase-3=半胱氨酸蛋白酶3；與對(duì)照組比較，aP<0.05；與UVB輻射組比較，bP<0.05

本研究結(jié)果表明，HaCaT細(xì)胞經(jīng)UVB照射后，出現(xiàn)輕度腫脹、漂浮，且臺(tái)盼藍(lán)藍(lán)染細(xì)胞數(shù)量增加，但細(xì)胞形態(tài)仍可看出，藏雪蓮水提取物組與UVB輻射組比較，細(xì)胞形態(tài)明顯恢復(fù)，藍(lán)染細(xì)胞數(shù)量明顯下降，細(xì)胞死亡碎片及脫片現(xiàn)象明顯改善；UVB輻射組與對(duì)照組比較，IL-6、TNF-α、p38MAPK、p53、Bax、Caspase-3表達(dá)水平上升，Bcl-2表達(dá)水平下降，藏雪蓮水提取物組與UVB輻射組比較，IL-6、TNF-α、p38MAPK、p53、Bax、Caspase-3表達(dá)水平下降，Bcl-2表達(dá)水平上升。說(shuō)明藏雪蓮水提取物能夠通過(guò)降低UVB輻射后炎性因子及凋亡因子的表達(dá)來(lái)減輕HaCaT細(xì)胞的輻射損傷。

本研究結(jié)果證實(shí)，藏雪蓮水提取物能夠降低HaCaT細(xì)胞經(jīng)UVB輻射后IL-6、TNF-α、p38MAPK、p53、Bax、Caspase-3表達(dá)水平，升高Bcl-2表達(dá)水平，減輕UVB輻射后HaCaT細(xì)胞炎性因子及凋亡因子的表達(dá)，進(jìn)而減輕UVB輻射后HaCaT細(xì)胞的輻射損傷，并為進(jìn)一步探討藏雪蓮水提取物在UVB光保護(hù)作用的機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

利益沖突聲明：本課題未涉及任何廠家及相關(guān)雇主或其他經(jīng)濟(jì)組織直接或間接的經(jīng)濟(jì)或利益的贊助。無(wú)利益沖突。

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(本文編輯：陳素芳)

Influence of Saussurea Tridactyla Sch-Bip Water Extracts on the Protein Expression of HaCaT Cells After UVB Radiation

GUOYan,SUNJuan,WANGLi-wen.

DepartmentofSkinDiseaseandVenerealDivision，AffiliatedHospitalofQinghaiUniversity,Xining810001,China

Objective To investigate the influence of Saussurea tridactyla Sch-Bip (SSB) water extract on the expressions of interleukin 6 (IL-6),tumor necrosis factor alpha (TNF-α),p38 mitogen activated protein kinase (p38MAPK),p53,B cell lymphoma factor 2 (Bcl-2),Bcl-2 associated X protein (Bax),cysteine proteinase 3 (Caspase-3) in HaCaT cell after medium wave ultraviolet erythema effect of ultraviolet rays (UVB) radiation.Methods HaCaT cells were cultured in vitro and randomly divided into 3 groups:control group,UVB radiation group (30 mJ/cm2,radiation 1 h,UVB group),UVB+SSB group (UVB 30 mJ/cm2,radiation 1 h +SSB 5 g/L).One hour before UVB irradiation,SSB water extracts were added into the culture medium.18 hours after UVB radiation,cells were collected.The morphology of cells were observed by trypan blue staining.The expressions level of IL-6,TNF-α,p38MAPK,p53,Bcl-2,Bax and Caspase-3 were detected.Results Compared with control group,in UVB radiation group,the number of HaCaT cells stained increased,HaCaT cells appeared swelled and floated,but the cell morphology could still be seen;compared with UVB radiation group,in UVB+SSB group,the number of HaCaT cells stained decreased,HaCaT cells appeared less swelled， and the morphology of cells were largely restored.UVB radiation group was higher (P<0.05) in the expressions level of IL-6，TNF-α，p38MAPK，p53，Bax，Caspase-3 and lower (P<0.05) in Bcl-2 expression than control group;UVB+SSB group was lower (P<0.05) in the expressions level of IL-6，TNF-α，p38MAPK，p53，Bax and Caspase-3 and higher (P<0.05) in the expression level of Bcl-2 than UVB radiation group.Conclusion SSB water extracts can reduce the expressions level of IL-6,TNF-α,p38MAPK,Bax,Caspase-3 and increase the expression level of Bcl-2 in HaCaT cells after UVB radiation.

Ultraviolet rays；Radiation；Tibetan saussurea；HaCaT cell；Interleukin-6；Tumor necrosis factors α

青海省科學(xué)計(jì)劃項(xiàng)目(2013-Z-003)

810001青海省西寧市，青海大學(xué)附屬醫(yī)院皮膚病與性病學(xué)(郭硯)；青海大學(xué)研究生院(孫娟，王麗雯)

郭硯，810001青海省西寧市，青海大學(xué)附屬醫(yī)院皮膚病與性病學(xué)；E-mail:qhguoyan@163.com

R 358.4

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2015.24.012

2015-03-26；

2015-07-02)