內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)因子CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白在蛛網(wǎng)膜下腔出血后早期腦損傷中的作用

黃嘯元，趙 冬，劉 祺，許 暉，戴 晶，代林志，徐偉華，王業(yè)忠

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·論著·

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)因子CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白在蛛網(wǎng)膜下腔出血后早期腦損傷中的作用

黃嘯元，趙 冬，劉 祺，許 暉，戴 晶，代林志，徐偉華，王業(yè)忠

目的 探討內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)因子CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白(CHOP)的表達(dá)及其在蛛網(wǎng)膜下腔出血(SAH)后早期腦損傷(EBI)中的作用。方法 選取健康雄性SD大鼠78只，采用隨機(jī)數(shù)字表法將其分為空白對(duì)照組(6只)、假手術(shù)組(36只)與SAH組(36只)。將假手術(shù)組和SAH組分別于1、6、12、24、48、72 h，采用簡(jiǎn)單隨機(jī)抽樣法選取6只大鼠處死。比較各組不同時(shí)間點(diǎn)光鏡及電鏡下大鼠海馬神經(jīng)元形態(tài)改變、CHOP相對(duì)表達(dá)水平、海馬神經(jīng)元凋亡細(xì)胞水平及神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分。結(jié)果 3組大鼠6、12、24、48 h時(shí)CHOP相對(duì)表達(dá)水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；其中SAH組大鼠6、12、24、48 h時(shí)CHOP相對(duì)表達(dá)水平均高于空白對(duì)照組和假手術(shù)組(P<0.05)。空白對(duì)照組和假手術(shù)組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)CHOP相對(duì)表達(dá)水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)?？瞻讓?duì)照組與假手術(shù)組僅有極少數(shù)海馬神經(jīng)元凋亡細(xì)胞；SAH組1 h海馬神經(jīng)元未見(jiàn)明顯凋亡改變；SAH組6、12 h海馬神經(jīng)元凋亡細(xì)胞較前增多，部分散在的海馬神經(jīng)元凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核呈棕褐色；SAH組24 h海馬神經(jīng)元凋亡細(xì)胞明顯增多；SAH組48 h海馬神經(jīng)元凋亡細(xì)胞逐漸減少，72 h可見(jiàn)少量海馬神經(jīng)元凋亡細(xì)胞。3組大鼠6、12、24、48 h時(shí)海馬神經(jīng)元凋亡細(xì)胞水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；其中SAH組大鼠6、12、24、48 h時(shí)海馬神經(jīng)元凋亡細(xì)胞水平均高于空白對(duì)照組和假手術(shù)組(P<0.01)?？瞻讓?duì)照組和假手術(shù)組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)海馬神經(jīng)元凋亡細(xì)胞水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。空白對(duì)照組、假手術(shù)組及SAH組大鼠實(shí)驗(yàn)前神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。3組大鼠6、12、24、48 h時(shí)神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；其中SAH組大鼠6、12、24、48 h時(shí)神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分均低于空白對(duì)照組和假手術(shù)組(P<0.01)?？瞻讓?duì)照組和假手術(shù)組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。SAH組CHOP相對(duì)表達(dá)水平與海馬神經(jīng)元凋亡細(xì)胞水平呈正相關(guān)(r=0.933，P<0.01)。結(jié)論 SAH后早期CHOP表達(dá)增高，海馬神經(jīng)元凋亡細(xì)胞增多，神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分降低，提示CHOP在SAH后內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用。

蛛網(wǎng)膜下腔出血；腦損傷；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激；CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白類；血管痙攣，顱內(nèi)；細(xì)胞凋亡

黃嘯元，趙冬，劉祺，等.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)因子CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白在蛛網(wǎng)膜下腔出血后早期腦損傷中的作用[J].中國(guó)全科醫(yī)學(xué)，2015，18(24)：2911-2916，2921.[www.chinagp.net]

Huang XY，Zhao D,Liu Q,et al.Effects of endoplasmic reticulum stress-induced transcriptional factor CHOP on early brain injury after subarachnoid hemorrhage[J].Chinese General Practice，2015，18(24)：2911-2916，2921.

自發(fā)性蛛網(wǎng)膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage，SAH)是一種臨床常見(jiàn)的急性腦血管疾病，該病致殘率和病死率較高。盡管目前診斷技術(shù)、顯微外科技術(shù)以及介入治療技術(shù)發(fā)展迅速，但其預(yù)后并未明顯改善。近期研究表明，造成SAH患者預(yù)后差的主要原因可能為早期腦損傷( early brain injury，EBI)[1]。EBI發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，包括：神經(jīng)血管炎癥、血-腦脊液屏障破壞、腦損傷和腦水腫、急性腦血管痙攣(CVS)、微循環(huán)功能障礙和細(xì)胞凋亡等[2]，其中細(xì)胞凋亡則是EBI發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的主要病理生理機(jī)制。Mehmet[3]研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)可能是細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)凋亡的一個(gè)新場(chǎng)所，因此提出了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress,ERS) 反應(yīng)性凋亡途徑，而CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白 (C/EBP-homologous protein，CHOP)是ERS介導(dǎo)的凋亡通路中最重要的凋亡信號(hào)分子之一。已有文獻(xiàn)報(bào)道，CHOP在缺血再灌注后細(xì)胞凋亡中起著重要作用[4]。本研究擬通過(guò)觀察SAH后CHOP的表達(dá)水平和SAH后EBI的變化來(lái)探討CHOP在SAH后EBI過(guò)程中所發(fā)揮的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 健康雄性SD大鼠78只，3～4月齡，體質(zhì)量(290±40)g，由新疆維吾爾自治區(qū)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為空白對(duì)照組6只、假手術(shù)組36只與SAH組36只。

1.2 主要試劑 CHOP單克隆抗體購(gòu)自英國(guó)abcam公司，內(nèi)參β-actin購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，TUNEL試劑盒購(gòu)自美國(guó)Roche公司，DAB顯色試劑盒購(gòu)自丹麥Dako公司。

本研究要點(diǎn)：

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡是蛛網(wǎng)膜下腔出血(SAH)后早期腦損傷(EBI)發(fā)病機(jī)制的重要組成部分，CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白(CHOP)/GADD153 (生長(zhǎng)停滯因子及DNA損傷基因)是ERS的特異轉(zhuǎn)錄因子，CHOP表達(dá)升高是ERS的標(biāo)志,其在ERS和細(xì)胞凋亡的聯(lián)系中起到重要作用,是一個(gè)舉足輕重的中間信號(hào)分子，目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于ERS相關(guān)因子CHOP在EBI細(xì)胞凋亡中作用的報(bào)道尚少，因此本研究通過(guò)觀察海馬神經(jīng)元內(nèi)CHOP在SAH后海馬組織中表達(dá)的時(shí)相性變化，分析CHOP表達(dá)的變化與海馬神經(jīng)元凋亡細(xì)胞水平之間的關(guān)系，探討CHOP在SAH后EBI過(guò)程中所發(fā)揮的作用，為尋找SAH后EBI的潛在治療靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 建立大鼠模型 SAH組大鼠每100 g給予35 g/L水合氯醛1 ml腹腔注射麻醉，完全麻醉后分離暴露股動(dòng)脈并穿刺置管，將頭固定于立體定向儀上，取顱頂正中矢狀線切口，逐層分離頭皮，暴露顱骨，于冠狀縫前5 mm，中線旁開3 mm處鉆透露顱骨，顯露額極，挑開硬腦膜，可見(jiàn)清亮腦脊液流出，將PE10導(dǎo)管從額極緊貼前顱窩底向雙耳連線中點(diǎn)送入,進(jìn)入深度約為10 mm，骨蠟封閉骨孔。連接1 ml無(wú)菌注射器，回抽可見(jiàn)清亮腦脊液，取自體動(dòng)脈血0.3 ml,連接導(dǎo)管，在12 s內(nèi)勻速注入大鼠蛛網(wǎng)膜下腔。小心拔出導(dǎo)管,骨蠟封閉骨孔,逐層縫合頭皮,并保持大鼠頭低位30 min。假手術(shù)組除將自體血換為0.3 ml 0.9%氯化鈉溶液注入蛛網(wǎng)膜下腔外，余步驟均與SAH組相同?？瞻讓?duì)照組不予任何處理。

1.3.2 組織固定及處理 造模成功后，將假手術(shù)組和SAH組分別于1、6、12、24、48、72 h，采用簡(jiǎn)單隨機(jī)抽樣法選取6只大鼠處死，斷頭取腦后完整剝離兩側(cè)海馬，一部分迅速放入無(wú)酶EP管中-80 ℃凍存用于免疫印跡法檢測(cè)，一部分放入4%多聚甲醛溶液中固定后常規(guī)HE染色制作切片光鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，另一部分放入2.5%戊二醛溶液中固定后由新疆醫(yī)科大學(xué)電鏡室制作切片并觀察大鼠海馬神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)變化?？瞻讓?duì)照組大鼠直接處死后，固定及處理方法同上。

1.3.2.1 免疫印跡法檢測(cè)CHOP相對(duì)表達(dá)水平 各組均稱取30 mg海馬組織，放入不同無(wú)酶EP管中，各加入150 μl裂解液，超聲粉碎組織，4 ℃條件下，13 000 r/min離心15 min(離心半徑10 cm)，后取上清液。紫外分光光度計(jì)測(cè)CHOP表達(dá)水平，各組測(cè)3次，取平均值。CHOP變性后，進(jìn)行SDS凝膠電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，用5%脫脂奶粉封閉2 h后，加入CHOP抗體(1∶500)及β-actin抗體(1∶1 000)，4 ℃孵育過(guò)夜，TBST洗膜后，加入二抗(辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的大鼠抗小鼠二抗IgG)常溫孵育2 h，后TBST洗膜，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法(ECL)顯色，圖像分析儀測(cè)定各條帶灰度值，將各組CHOP條帶灰度值與相應(yīng)內(nèi)參β-actin條帶灰度值相比，計(jì)算各組CHOP相對(duì)表達(dá)水平。

1.3.2.2 TUNEL法檢測(cè)大鼠海馬神經(jīng)元凋亡細(xì)胞水平 各組在66 ℃烘片后，常規(guī)脫蠟、水化，20 μg/ml的蛋白酶K消化組織15 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)震洗后，用焦碳酸二乙酯(DEPC)水浸泡45 min，后PBS震洗5 min (3次)，滴加50 μl TUNEL反應(yīng)混合液(酶溶液∶標(biāo)記液=1∶9)；37 ℃濕盒中孵育1 h，PBS震洗后滴加過(guò)氧化物酶(POD)轉(zhuǎn)換液，后 37 ℃濕盒中孵育30 min，后PBS震洗5 min(3次)，滴加DAB并在鏡下控制顯色程度，清水洗凈后HE復(fù)染，后梯度乙醇溶液脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。在高倍鏡(×400)下隨機(jī)選取不重復(fù)的10個(gè)視野，細(xì)胞核呈棕黃色為陽(yáng)性細(xì)胞，計(jì)數(shù)視野下陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)及細(xì)胞總數(shù)，陽(yáng)性細(xì)胞率=陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%，以陽(yáng)性細(xì)胞率的均值作為海馬神經(jīng)元凋亡細(xì)胞水平。

1.4 神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分 各組大鼠均采用加西亞(Garcia)評(píng)分法[5]于實(shí)驗(yàn)前、6、12、24、48、72 h處死前進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分，評(píng)分范圍為5～18分，共分6項(xiàng)進(jìn)行評(píng)價(jià)：自主活動(dòng)、四肢活動(dòng)對(duì)稱性、前肢伸展活動(dòng)、攀爬能力、本體感覺(jué)、胡須觸碰反射。得分越低表示大鼠神經(jīng)功能受損越嚴(yán)重。

2 結(jié)果

2.1 建立大鼠模型 SAH組中共有2只大鼠因麻醉意外死亡，1只在注血后死亡，及時(shí)補(bǔ)做3只。SAH組大鼠開顱后于大腦willis環(huán)附近蛛網(wǎng)膜下腔可見(jiàn)大量積血，前循環(huán)處可見(jiàn)血凝塊；假手術(shù)組蛛網(wǎng)膜下腔未見(jiàn)血凝塊(見(jiàn)圖1)。

注：SAH=蛛網(wǎng)膜下腔出血

圖1 建立大鼠模型

Figure 1 Images of the rat models

2.2 光鏡及電鏡下海馬神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)變化 光鏡下：空白對(duì)照組大鼠海馬神經(jīng)元大小及染色質(zhì)分布均勻；假手術(shù)組海馬神經(jīng)元出現(xiàn)皺縮，細(xì)胞核染色質(zhì)濃縮明顯；SAH組海馬神經(jīng)元皺縮，出現(xiàn)核固縮現(xiàn)象。電鏡下：空白對(duì)照組及假手術(shù)組大鼠海馬神經(jīng)元形態(tài)飽滿，異染質(zhì)少見(jiàn)，細(xì)胞器形態(tài)正常；SAH組1 h可見(jiàn)海馬神經(jīng)元核內(nèi)異染質(zhì)稍增多，細(xì)胞器形態(tài)基本正常；SAH組6 h可見(jiàn)明顯內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脫顆粒、擴(kuò)張，線粒體腫脹、空泡早期凋亡，廣泛的細(xì)胞水樣變性及腦組織間質(zhì)水腫；SAH組12 h可見(jiàn)細(xì)胞水腫較前消退，但細(xì)胞核內(nèi)異染質(zhì)增多，細(xì)胞膜皺縮明顯，細(xì)胞質(zhì)密度增加；SAH組24 h海馬神經(jīng)元凋亡變化最為明顯，可見(jiàn)細(xì)胞核膜內(nèi)陷、染色質(zhì)固縮邊集、細(xì)胞質(zhì)密度增高、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)明顯擴(kuò)張；SAH組48 h仍可見(jiàn)細(xì)胞核內(nèi)異染質(zhì)增加，細(xì)胞質(zhì)密度增加；SAH組72 h海馬神經(jīng)元形態(tài)大致正常，與空白對(duì)照組和假手術(shù)組比較無(wú)明顯變化(見(jiàn)圖2)。

2.3 3組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)CHOP相對(duì)表達(dá)水平比較 各組不同時(shí)間點(diǎn)CHOP表達(dá)水平電泳圖見(jiàn)圖3。3組大鼠6、12、24、48 h時(shí)CHOP相對(duì)表達(dá)水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；其中SAH組大鼠6、12、24、48 h時(shí)CHOP相對(duì)表達(dá)水平均高于空白對(duì)照組和假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)?？瞻讓?duì)照組和假手術(shù)組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)CHOP相對(duì)表達(dá)水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見(jiàn)表1)。

2.4 3組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)海馬神經(jīng)元凋亡細(xì)胞水平比較 空白對(duì)照組與假手術(shù)組僅有極少數(shù)海馬神經(jīng)元凋亡細(xì)胞；SAH組1 h海馬神經(jīng)元未見(jiàn)明顯凋亡改變；SAH組6、12 h海馬神經(jīng)元凋亡細(xì)胞較前增多，部分散在的海馬神經(jīng)元凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核呈棕褐色；SAH組24 h海馬神經(jīng)元凋亡細(xì)胞明顯增多；SAH組48 h海馬神經(jīng)元凋亡細(xì)胞逐漸減少，72 h可見(jiàn)少量海馬神經(jīng)元凋亡細(xì)胞(見(jiàn)圖4)。3組大鼠6、12、24、48 h時(shí)海馬神經(jīng)元凋亡細(xì)胞水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；其中SAH組大鼠6、12、24、48 h時(shí)海馬神經(jīng)元凋亡細(xì)胞水平均高于空白對(duì)照組和假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)?？瞻讓?duì)照組和假手術(shù)組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)海馬神經(jīng)元凋亡細(xì)胞水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見(jiàn)表2)。

2.5 3組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分比較 空白對(duì)照組、假手術(shù)組及SAH組大鼠實(shí)驗(yàn)前神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。3組大鼠6、12、24、48 h時(shí)神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；其中SAH組大鼠6、12、24、48 h時(shí)神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分均低于空白對(duì)照組和假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)?？瞻讓?duì)照組和假手術(shù)組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見(jiàn)表3)。

注：a為空白對(duì)照組神經(jīng)元大小及染色質(zhì)分布均勻(HE染色,×200)；b為SAH組海馬神經(jīng)元皺縮，出現(xiàn)核固縮現(xiàn)象(HE染色,×200)；c為空白對(duì)照組海馬神經(jīng)元形態(tài)飽滿，異染質(zhì)少見(jiàn)，細(xì)胞器形態(tài)正常(電鏡,×8 000)；d為SAH組1 h時(shí)海馬神經(jīng)元核內(nèi)異染質(zhì)稍增多，細(xì)胞器形態(tài)基本正常(電鏡,×8 000)；e為SAH組6 h時(shí)明顯內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脫顆粒、擴(kuò)張，線粒體腫脹、空泡早期凋亡，細(xì)胞質(zhì)密度減低，組織間質(zhì)出現(xiàn)明顯的水樣變性(電鏡,×8 000)；f為SAH組12 h時(shí)細(xì)胞核內(nèi)異染質(zhì)增多，細(xì)胞核膜皺縮，細(xì)胞質(zhì)密度較前增高(電鏡,×8 000)；g為SAH組24 h時(shí)細(xì)胞核膜內(nèi)陷、染色質(zhì)固縮邊集、細(xì)胞質(zhì)密度增高、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)明顯擴(kuò)張(電鏡,×8 000)；h為SAH組48 h時(shí)仍可見(jiàn)細(xì)胞核內(nèi)異染質(zhì)增加，細(xì)胞質(zhì)密度增加(電鏡,×8 000)；i為SAH組72 h時(shí)海馬神經(jīng)元形態(tài)大致正常(電鏡,×8 000)；j為假手術(shù)組海馬神經(jīng)元形態(tài)飽滿，異染質(zhì)少見(jiàn)，細(xì)胞器形態(tài)正常(電鏡,×8 000)

圖2 光鏡及電鏡下大鼠海馬神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)變化

注：與SAH組比較，aP<0.05；SAH=蛛網(wǎng)膜下腔出血

注：A為空白對(duì)照組，B為1 h SAH組，C為6 h SAH組，D為12 h SAH組，E為24 h SAH組，F(xiàn)為48 h SAH組，G為72 h SAH組，H為假手術(shù)組

圖4 光鏡下大鼠海馬神經(jīng)元凋亡細(xì)胞(TUNEL染色，×400)

注：與SAH組比較，aP<0.05

表3 3組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分比較±s，分,n=6)

注：與SAH組比較，aP<0.05

注：1泳道為空白對(duì)照組， 2泳道為1 h，3泳道為6 h，4泳道為 12 h，5泳道為24 h， 6泳道為48 h，7泳道為72 h；CHOP=CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白

圖3 SAH組和假手術(shù)組不同時(shí)間點(diǎn)CHOP表達(dá)水平電泳圖

Figure 3 Electrophoretogram of the expression level of CHOP of SAH group and sham operation group at different time points

2.6 SAH組大鼠CHOP相對(duì)表達(dá)水平與海馬神經(jīng)元凋亡細(xì)胞水平的相關(guān)性分析 SAH組CHOP相對(duì)表達(dá)水平與海馬神經(jīng)元凋亡細(xì)胞水平呈正相關(guān)(r=0.933，P<0.01)。

3 討論

影響SAH預(yù)后的原因主要有CVS和EBI兩個(gè)方面[6]。既往學(xué)者在CVS上做了大量研究，但患者的預(yù)后沒(méi)有改善[7]。有學(xué)者認(rèn)為，SAH后EBI是SAH患者死亡的首要原因[8]。因此，目前越來(lái)越多的研究轉(zhuǎn)向EBI。EBI是一個(gè)整體性的概念，其涉及SAH后72 h內(nèi)腦組織發(fā)生的所有病理及生理變化[9]，包括顱內(nèi)壓增高、腦血流量減少以及血液流入蛛網(wǎng)膜下腔后對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的直接毒性反應(yīng)等，這些反應(yīng)促使早期腦水腫、氧化應(yīng)激以及腦梗死的發(fā)展[10]，導(dǎo)致廣泛性的細(xì)胞凋亡[11]，主要包括血-腦脊液屏障、海馬和血管內(nèi)皮細(xì)胞等，其損傷程度與SAH后導(dǎo)致的神經(jīng)行為功能障礙有關(guān)。深入研究SAH后EBI的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，對(duì)于降低SAH致殘率和病死率具有重要意義[12]。

筆者既往研究顯示，ERS在SAH后的EBI中發(fā)揮重要作用[13]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞維持正常生理功能的重要亞細(xì)胞器，是分泌蛋白和膜蛋白在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行折疊、修飾和組裝的場(chǎng)所，這些過(guò)程是細(xì)胞成熟所必需的條件。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通過(guò)激活未折疊蛋白質(zhì)反應(yīng)(unfolded protein response，UPR) 以保護(hù)細(xì)胞損傷，過(guò)強(qiáng)、過(guò)久的ERS反應(yīng)則會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[14]。ERS介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡是最近幾年才被發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞凋亡途徑。該凋亡途徑共分為3種：CHOP/GADD153通路、Caspase通路、JNK通路。CHOP作為ERS通路中特異性的轉(zhuǎn)錄因子，正常情況下很少表達(dá)，但持久、過(guò)度的應(yīng)激則會(huì)通過(guò)UPR引起CHOP的大量激活，調(diào)控下游的促凋亡基因Bcx/Bak、抗凋亡基因Bcl-2等，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。

本研究通過(guò)透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，SAH組6 h可見(jiàn)明顯內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脫顆粒、擴(kuò)張，線粒體腫脹、空泡早期凋亡，廣泛的細(xì)胞水樣變性及腦組織間質(zhì)水腫，提示此時(shí)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體的結(jié)構(gòu)與功能受到了一定影響，已存在ERS，神經(jīng)元也開始出現(xiàn)凋亡前期的表現(xiàn)[15]；SAH組24 h海馬神經(jīng)元凋亡變化最為明顯，可見(jiàn)細(xì)胞核膜內(nèi)陷、染色質(zhì)固縮邊集、細(xì)胞質(zhì)密度增高、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)明顯擴(kuò)張，而在72 h海馬神經(jīng)元形態(tài)已趨于正常，與王春梅等[16]研究相似。以上提示SAH早期全腦缺血引發(fā)了細(xì)胞水腫[17-18]，隨著內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài)與功能的持續(xù)損害，海馬神經(jīng)元逐漸出現(xiàn)凋亡征象，雖未見(jiàn)凋亡小體等凋亡晚期表現(xiàn)，但其染色質(zhì)的變化已屬于凋亡改變，結(jié)果與Asher等[19]的研究結(jié)果相符合。本研究發(fā)現(xiàn)，SAH組大鼠6、12、24、48 h時(shí)海馬神經(jīng)元凋亡細(xì)胞水平均高于空白對(duì)照組和假手術(shù)組，且6、12、24、48 h時(shí)神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分均低于空白對(duì)照組和假手術(shù)組，3組兩種指標(biāo)不同時(shí)間點(diǎn)變化一致，說(shuō)明在SAH后早期海馬神經(jīng)元凋亡導(dǎo)致了神經(jīng)行為功能障礙。

本研究發(fā)現(xiàn)，SAH組大鼠6、12、24、48 h時(shí)CHOP相對(duì)表達(dá)水平均高于空白對(duì)照組和假手術(shù)組，其余時(shí)間點(diǎn)比較無(wú)差異，說(shuō)明CHOP在建模后6 h表達(dá)水平開始增加，提示了SAH早期ERS的出現(xiàn)；1 h和72 h CHOP相對(duì)表達(dá)水平同空白對(duì)照組無(wú)差別，24 h達(dá)到高峰，這與海馬神經(jīng)元凋亡細(xì)胞水平變化一致。由此筆者認(rèn)為，在SAH后24 h，CHOP的表達(dá)和細(xì)胞凋亡同時(shí)達(dá)到高峰，說(shuō)明了SAH后持續(xù)的應(yīng)激導(dǎo)致了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能障礙，從而誘導(dǎo)CHOP大量表達(dá)，引起細(xì)胞凋亡，但隨著時(shí)間推移，細(xì)胞凋亡情況與行為學(xué)評(píng)分逐漸恢復(fù)，這可能與ERS的保護(hù)效應(yīng)有關(guān)。本研究相關(guān)性分析顯示，CHOP相對(duì)表達(dá)水平與海馬神經(jīng)元凋亡細(xì)胞水平呈正相關(guān)，進(jìn)一步說(shuō)明了ERS在海馬神經(jīng)元凋亡中所發(fā)揮的作用。CHOP的表達(dá)升高是ERS的標(biāo)志，CHOP在ERS和海馬神經(jīng)元凋亡聯(lián)系中發(fā)揮重要作用。

綜上所述，SAH后早期發(fā)生了ERS，刺激CHOP表達(dá)水平增高，從而進(jìn)一步誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元凋亡并造成神經(jīng)功能障礙，說(shuō)明CHOP在SAH后EBI的病理過(guò)程中發(fā)揮了重要作用，這將為今后深入研究CHOP的作用以及尋找針對(duì)性的治療提供理論依據(jù)。

本文鏈接：

異染質(zhì)：在細(xì)胞周期中，間期、早期或中、晚期，某些染色體或染色體的某些部分的固縮常較其他染色質(zhì)早些或晚些，其染色較深或較淺，具有這種固縮特性的染色體稱為異染質(zhì)。細(xì)胞核內(nèi)異染質(zhì)增多可看作為細(xì)胞凋亡早期的表現(xiàn)。

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(本文編輯：李婷婷)

Effects of Endoplasmic Reticulum Stress-induced Transcriptional Factor CHOP on Early Brain Injury After Subarachnoid Hemorrhage

HUANGXiao-yuan，ZHAODong,LIUQi,etal.

DepartmentofNeurosurgery,theFirstAffiliatedHospitaloftheMedicalCollege,ShiheziUniversity,Shihezi832000,China

Objective To investigate the effects of endoplasmic reticulum stress factor-induced transcriptional factor CHOP on early brain injury (EBI) after subarachnoid hemorrhage (SAH).Methods A total of 78 healthy male Sprague-Dawley rats were selected and randomly assigned into control group (n=6),sham operation group (n=36) and SAH group (n=36).At 1, 6, 12, 24, 48 and 72 h,we selected 6 rats from both sham operation group and SAH group using simple random sampling method and killed these rats.Comparison was made in the morphological change of hippocampal neurons,the relative expression level of CHOP,the apoptosis level of hippocampal neuron cells and the score of neuroethology observed under light microscope and electron microscope among the three groups at different time points.Results In each group,the relevant expression levels of CHOP at 6,12,24 and 48 h were significantly different (P<0.05).SAH group was higher (P<0.05) than control group and sham operation group in the relative expression level of CHOP at 6,12,24 and 48 h.No significant difference (P>0.05) was noted between control group and sham group in the relevant expression level of CHOP at different time points.In control group and sham operation group,very few apoptotic hippocampal neuron cells were observed;in SAH group,no obvious apoptosis of hippocampal neuron cells was observed at 1 h;in SAH group,the apoptotic hippocampal neuron cells increased at 6 and 12 h than before,and the karyons of some scattered apoptotic hippocampal neuron cells took on the color of sepia;in SAH group,apoptotic hippocampal neuron cells increased notably at 24 h and decreased gradually at 48 h,and a small number of apoptotic hippocampal neuron cells were observed at 72 h.In each group,the apoptosis levels of hippocampal neuron cells at 6,12,24 and 48 h were significantly different (P<0.05).SAH group was higher (P<0.01) than control group and the sham operation group in the apoptosis level of hippocampal neuron cells at 6,12,24 and 48 h.No significant difference (P>0.05) was noted between control group and sham group in the apoptosis level of hippocampal neuron cells at different time points.No significant difference (P>0.05) was noted among the three groups in the score of neuroethology before intervention.In each group,the scores of neuroethology at 6,12,24 and 48 h were significantly different (P<0.05).SAH group was lower (P<0.01) than control group and sham operation group in the score of neuroethology at 6,12,24 and 48 h.No significant difference (P>0.05) was noted between control group and sham group in the score of neuroethology at different time points.In SHA group,the expression level of CHOP was positively correlated with the apoptosis level of hippocampal neuron cells (r=0.933，P<0.01).Conclusion At the early stage following SAH,the expression of CHOP increases,the apoptotic hippocampal neuron cells increase,and the score of neuroethology decreases.It suggests that CHOP plays an important role in cell apoptosis induced by endoplasmic reticulum stress after SAH.

Subarachnoid hemorrhage；Brain injuries；Endoplasmic reticulum stress；CCAAT-enhancer-binding proteins;Vasospasm,intracranial；Apoptosis

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81360186)；石河子大學(xué)“自然科學(xué)與技術(shù)創(chuàng)新”資助項(xiàng)目(ZRKXYB-15)

832000新疆石河子市，石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科

王業(yè)忠，832000新疆石河子市，石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科；E-mail:Wangyz2008@126.com

R 651.15

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2015.24.009

2015-02-21；

2015-06-13)