乙肝病毒血清標(biāo)志物與其DNA檢測(cè)結(jié)果對(duì)比分析及臨床意義

馮　佳

四川省南充市中心醫(yī)院　637000

乙肝病毒血清標(biāo)志物與其DNA檢測(cè)結(jié)果對(duì)比分析及臨床意義

馮佳

四川省南充市中心醫(yī)院637000

摘要目的：比較乙肝血清不同模式標(biāo)志物與HBV-DNA結(jié)果進(jìn)行對(duì)比分析，探討二者之間的關(guān)系及臨床意義。方法：收集2012年8月-2013年3月乙肝患者標(biāo)本548例，采用酶聯(lián)免疫方法和實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法分別檢測(cè)乙肝病毒血清標(biāo)記物和病毒DNA，比較它們之間的關(guān)系。結(jié)果：HBsAg陽(yáng)性組共514例，HBV-DNA定量小于1×103copies/L(陰性)共244例，HBV-DNA定量大于1×103copies/L(陽(yáng)性)共270例，HBV-DNA對(duì)數(shù)值為(5.31±1.74)；HBsAg、HBeAg、HBcAb陽(yáng)性組共118例,HBV-DNA對(duì)數(shù)值為(7.03±1.01)；HBsAg、HBeAb、HBcAb陽(yáng)性組共260例，HBV-DNA定量陽(yáng)性共111例，其對(duì)數(shù)值為(4.21±1.20)，HBV-DNA定量陰性共149例；HBsAg、HBcAb陽(yáng)性組共116例，HBV-DNA定量陰性共70例，HBV-DNA定量陽(yáng)性共46例，其對(duì)數(shù)值為(4.90±1.66)；其他標(biāo)志物模式組共34例，HBV-DNA定量陰性。HBV-DNA對(duì)數(shù)值在HBeAg陽(yáng)性組與HBeAb陽(yáng)性組間相比，有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。Real-time PCR法和ELISA法診斷乙肝的敏感性分別為49.3%和93.8%，符合率為55.5%。結(jié)論：Real-time PCR法和ELISA法在HBeAg陽(yáng)性組有良好的相關(guān)性，兩種方法分別檢測(cè)乙肝病毒感染機(jī)體不同狀態(tài)，它們之間能互為補(bǔ)充，不能相互替代。

關(guān)鍵詞乙肝標(biāo)志物HBV-DNA酶聯(lián)免疫反應(yīng)實(shí)時(shí)熒光定量PCR

Comparison and Clinical Significance of Quantitative Fluorescent Detection of HBV-DNA and the Results of Serum Marker

FENG Jia.NanchongCentralHospital,NanchongCity,SichuanProvince637000

ABSTRACT Objective:To compare the results of quantitative fluorescent detection of HBV-DNA with the HBV serum marker and explore the relationship and clinical significance.Methods:548 serum samples of HBV patients were collected from August 2012 to March 2013，all samples were detected by enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)and Real-time quantitative Polymerase Chain Reaction(Real-time PCR)at the same time,then the results of serum markers of hepatitis B virus and viral DNA were analyzed.Results:There were 514 patients in the group of HBsAg(+)，the positive patients of HBV-DNA in the group of HBsAg(+)were 270 and the average logarithmic value was(5.31±1.74).The patients in the group of HBsAg(+), HBeAg(+), HBcAb(+)were 118 and the positive patients of HBV-DNA were 118，the average logarithmic value was(7.03±1.01).The patients in the group of HBsAg(+), HBeAb(+), HBcAb(+)were 260 and the positive patients of HBV-DNA were 111，the average logarithmic value was(4.21±1.20).The patients in the group of HBsAg(+),HBcAb(+)were 116 and the positive patients were 46，the average logarithmic value was(4.90±1.66).The patients of the other group were 34 and the quantitative detection of HBV-DNA was negative. The diagnostic sensitivity of Real-time PCR and ELISA was 49.3% and 93.8% respectively, the coincidence rate of those two methods was 55.5%.Conclusion:There is a good correlation between Real-time PCR and ELISA,and the results of HBV patients detected by those two methods reflect the different states of hepatitis B infection.These two methods can complement each other and not substitute for each other.

KEY WORDS HBV marker，HBV-DNA，ELISA，Real-time PCR

乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)感染是一個(gè)全球性嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題。據(jù)世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)報(bào)道，全球60億人口中，約20億人曾感染過(guò)HBV，其中4.0億人為慢性HBV感染，每年約有100萬(wàn)人死于HBV感染所致的肝衰竭、肝硬化和原發(fā)性肝細(xì)胞癌[1]。因此，乙肝病毒檢測(cè)對(duì)乙肝的診斷、治療和預(yù)后極為重要。隨著免疫學(xué)和分子生物技術(shù)的迅速發(fā)展，檢測(cè)乙肝病毒標(biāo)志物的方法不斷更新。目前臨床使用的主要方法有酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法和分子診斷技術(shù)中的實(shí)時(shí)熒光定量PCR法。本文對(duì)548例乙肝患者的乙肝免疫學(xué)標(biāo)志物與HBV-DNA定量的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)對(duì)比分析，探討二者之間的關(guān)系及臨床意義。

1資料和方法

1.1病例資料548例乙肝患者均來(lái)自2012年8月-2013年3月來(lái)我院就診的門(mén)診及住院乙肝患者，病程超過(guò)1年以上，其中男373例，女175例，年齡最大86歲，最小6歲，平均年齡(37.6±16.6)歲。乙型肝炎診斷標(biāo)準(zhǔn)按《乙型病毒性肝炎診斷標(biāo)準(zhǔn)(WS299-2008)》執(zhí)行。

1.2儀器與試劑HBV-DNA檢測(cè)系統(tǒng)包含實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀、乙型肝炎病毒核酸定量檢測(cè)試劑盒、校準(zhǔn)品、操作程序、數(shù)據(jù)處理軟件來(lái)自于上?？迫A生物工程股份有限公司，質(zhì)控品為本實(shí)驗(yàn)室按文獻(xiàn)方法自制[2,3]；酶聯(lián)免疫檢測(cè)系統(tǒng)包含酶標(biāo)儀、乙型肝炎病毒診斷試劑盒(五項(xiàng))、洗板機(jī)、操作程序、數(shù)據(jù)處理軟件來(lái)自于上?？迫A生物工程股份有限公司，質(zhì)控品為衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心。所有的儀器和檢測(cè)項(xiàng)目操作均按本室制定SOP文件執(zhí)行，所有檢測(cè)項(xiàng)目室內(nèi)質(zhì)控在控。

1.3方法血清標(biāo)本的采集與處理：HBV-DNA標(biāo)本采集采用滅菌的一次性真空帶蓋塑料管，清晨空腹抽取靜脈血3~5ml，離心分離血清分裝于1.5ml滅菌EP管，保存于-20℃冰箱備用，1周內(nèi)完成實(shí)時(shí)熒光定量PCR；HBV血清標(biāo)志物標(biāo)本采集采用一次性真空帶蓋塑料管，清晨空腹抽取靜脈血3~5ml，離心分離血清后當(dāng)天完成ELISA檢測(cè)。

1.4數(shù)據(jù)處理HBV-DNA定量以大于1×103copies/L為判斷陽(yáng)性的標(biāo)準(zhǔn)，小于1×103copies/L為陰性；ELISA方法cut off值按試劑盒操作說(shuō)明書(shū)設(shè)置并驗(yàn)證。計(jì)量資料用均值±標(biāo)準(zhǔn)差形式，結(jié)果比較采用t檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1HBV感染血清標(biāo)志物主要組合模式與HBV-DNA定量陽(yáng)性結(jié)果的比較見(jiàn)表1。A組表示HBsAg、HBeAg、HBcAb陽(yáng)性組；B組表示HBsAg、HBeAb、HBcAb陽(yáng)性組；C組表示HBsAg、HBcAb陽(yáng)性組；D組表示HBsAg陰性(其他標(biāo)志物陽(yáng)性)組；E組表示HBsAg陽(yáng)性組(其他標(biāo)志物可能陽(yáng)性)

表1　HBV感染血清標(biāo)志物主要組合模式與

注：*：表示A組與B組比較；△表示A組與C組比較；#表示A組與E組比較。

2.2548例乙肝患者以HBsAg陽(yáng)性和陰性進(jìn)行分組，分析兩種檢測(cè)方法的符合率和敏感性，具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表2。

表2　兩種方法診斷乙肝患者的符合率和敏感性比較

3討論

乙肝病毒血清標(biāo)志物是目前診斷乙型肝炎最常用的指標(biāo)，包括HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb和HBcAb五項(xiàng)指標(biāo)，主要反映人體對(duì)乙肝病毒的免疫反應(yīng)狀態(tài)。檢測(cè)乙肝血清標(biāo)志物的免疫學(xué)方法中最常用的是酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)，該法靈敏度較高，可達(dá)到納克水平，如引入生物素和親和素系統(tǒng)或采用化學(xué)發(fā)光等技術(shù)，其靈敏度還可進(jìn)一步提高。不同血清免疫學(xué)標(biāo)志物代表不同的臨床意義，如HBsAg是乙肝病毒感染的特異性標(biāo)志，陽(yáng)性常見(jiàn)于急性乙肝的潛伏期、急性期及慢性乙肝病毒感染狀態(tài)。HBeAg其陽(yáng)性和滴度可反映乙肝病毒的復(fù)制情況及傳染性的強(qiáng)弱等。

實(shí)時(shí)定量PCR是目前臨床檢測(cè)HBV-DNA的分子生物學(xué)方法，既保持了PCR技術(shù)靈敏與快速的特點(diǎn)，又克服了以往傳統(tǒng)PCR的假陽(yáng)性污染和不能進(jìn)行準(zhǔn)確定量的缺點(diǎn)，其重復(fù)性好但檢測(cè)過(guò)程較復(fù)雜而且費(fèi)用較高。HBV-DNA陽(yáng)性代表有完整的乙肝病毒顆粒的復(fù)制，被認(rèn)為是衡量乙肝病毒復(fù)制有無(wú)及高低最靈敏、最精確與最直接的證據(jù)。

本文在兩種方法同時(shí)檢測(cè)乙肝患者血清發(fā)現(xiàn)(表1)，HBV-DNA在HBV血清學(xué)標(biāo)志物陽(yáng)性的各種模式中的檢出率不一樣，HBeAg陽(yáng)性組(A組)HBV-DNA檢出率為100%，其HBV-DNA平均含量約為107copies/ml，平均水平對(duì)數(shù)值為7.03；HBeAg陰性組(HBsAg陽(yáng)性，B、C組)HBV-DNA檢出率為41.8%，其HBV-DNA平均含量約為2.63×104copies/ml，平均水平對(duì)數(shù)值為4.42；與HBeAg陽(yáng)性組相比有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。這組數(shù)據(jù)表明，HBeAg陽(yáng)性組患者體內(nèi)存在HBV病毒復(fù)制，有大量的病毒顆粒釋放入外周血中；HBeAg陰性組(HBsAg陽(yáng)性，B、C組)通常HBeAg 向HBeAb 的轉(zhuǎn)換被認(rèn)為是肝細(xì)胞中活躍復(fù)制病毒的清除期, 但仍能檢出HBV-DNA ,這可能是編碼HBeAg所在C區(qū)因發(fā)生突變時(shí)HBeAg 不能表達(dá), 而HBV-DNA 不斷復(fù)制的結(jié)果[4]，可表現(xiàn)為HBeAg陰性，但HBV-DNA為陽(yáng)性。用定量PCR 技術(shù)檢測(cè)慢性乙肝患者血清HBV-DNA含量表明: HBeAb 出現(xiàn)并不能表示HBV 復(fù)制的停止, 而只是復(fù)制水平的降低。 因此, 對(duì)HBeAb 陽(yáng)性, DNA 也陽(yáng)性者要慎重對(duì)待，這些乙肝病毒變異株與重型肝炎或肝炎慢性惡化有著極大關(guān)聯(lián)。同時(shí)有研究表明研究證實(shí)，亞洲人平均50%的HBeAg陰性的慢性乙肝患者存在前C區(qū)突變[5]，即前C區(qū)G1896 A變異，導(dǎo)致終止密碼子TAG改變，不能編碼HBeAg；C區(qū)啟動(dòng)子A1762 T和G1764 A的雙變異，前C區(qū)mRNA的產(chǎn)生減少，使HBeAg分泌減少。因此單以HBeAg作為乙肝病毒復(fù)制活躍與否的指標(biāo)是不夠的[5]。此外，兩種方法在診斷乙肝的敏感性也存在較大差異，ELISA方法的特異性是93.8%，而FQ-PCR診斷乙肝的敏感性為49.3%，二者的符合率55.5%。這主要是因?yàn)镕Q-PCR主要是通過(guò)檢測(cè)HBV病毒DNA，準(zhǔn)確地反映體內(nèi)病毒的復(fù)制情況，對(duì)乙肝治療方案的選擇和療效觀察有較大的指導(dǎo)意義，而ELISA方法檢測(cè)血清標(biāo)志物主要是反映患者感染乙肝后免疫學(xué)狀態(tài)，由于受到基因突變、免疫耐受及方法學(xué)檢測(cè)敏感性等方面的影響，它還不能完全反映病毒顆粒在體內(nèi)的復(fù)制情況，除非增加新的血清標(biāo)志物，如前S1抗原等[6]。此外，在本次實(shí)驗(yàn)中亦出現(xiàn)乙肝五項(xiàng)標(biāo)志物全部陰性者27例, PCR 方法檢出2例DNA( + ) , 陽(yáng)性率為7.4%, 這是由于HBV-DNA 的出現(xiàn)早于其他血清學(xué)指標(biāo)[7], 受檢者可能處于感染早期。

傳統(tǒng)乙肝血清標(biāo)志物由于其價(jià)格低廉、操作簡(jiǎn)便、診斷乙肝的敏感性較高等特點(diǎn)，臨床上把它作為我國(guó)實(shí)驗(yàn)室乙肝檢測(cè)與篩查時(shí)的主要選擇指標(biāo)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR的臨床應(yīng)用使乙肝病毒的量化上了一個(gè)新的臺(tái)階，雖然其存在檢測(cè)費(fèi)用較高、檢測(cè)過(guò)程復(fù)雜、在多數(shù)實(shí)驗(yàn)室尚不能普及規(guī)范檢測(cè)等缺點(diǎn)，但許多資料表明,只要有HBV-DNA 就可以引起HBV感染 , 這不僅有診斷意義, 而且也有流行病學(xué)意義。其在臨床治療方案選擇和藥物療效評(píng)價(jià)上也有不可比擬的優(yōu)勢(shì)。因此，這兩種方法不能相互取代，可聯(lián)合檢測(cè)對(duì)乙肝臨床診斷、治療方案評(píng)估及療效觀察提供較客觀的臨床意義。

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(編輯羽飛)

收稿日期2014-09-04

中圖分類(lèi)號(hào)：R446；R512.6+2

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1001-7585(2015)03-0298-03