絲素蛋白作為非病毒基因傳遞載體的研究

余艷妮，李明忠

（蘇州大學(xué) 紡織與服裝工程學(xué)院，江蘇 蘇州215123）

基因治療是將用于治療的外源性基因運(yùn)送到靶細(xì)胞內(nèi)，使其適當(dāng)表達(dá)，達(dá)到治療疾病的目的［1］?；蛑委煹年P(guān)鍵之一是選擇合適的傳遞和表達(dá)載體。理想的基因傳遞載體應(yīng)具有良好生物相容性和生物可降解性，無細(xì)胞毒性、無免疫源性；能包裝并壓縮DNA形成較小的載體／DNA復(fù)合物；能保護(hù)DNA不被降解；能高效地將外源性DNA傳遞到靶細(xì)胞內(nèi)，使目的基因從內(nèi)涵體逃逸并得到穩(wěn)定的表達(dá)?；騻鬟f載體分為病毒載體和非病毒載體兩大類［2］。

1 用于基因傳遞的病毒載體

病毒的基因組比較簡(jiǎn)單，易于改造，是一類高效的基因傳遞載體。用作基因傳遞載體的病毒有逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒相關(guān)病毒和腺病毒等。

逆轉(zhuǎn)錄病毒在病毒載體中應(yīng)用最早。用逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝基因后感染細(xì)胞的技術(shù)已被廣泛研究試圖用于骨修復(fù)、軟骨修復(fù)、傷口愈合和組織工程血管領(lǐng)域。包裝骨形成蛋白-2基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染骨髓基質(zhì)細(xì)胞后，將細(xì)胞種植在支架內(nèi)移植到大鼠的骨缺損部位，在體內(nèi)可以誘導(dǎo)骨的形成［3-4］。用攜帶血管衍生生長(zhǎng)因子（PDGF-B）和血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（VEGF121）基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染種植在聚乙醇酸的支架上的真皮成纖維細(xì)胞，植入動(dòng)物的皮膚缺損創(chuàng)面的結(jié)果表明，可以加快傷口的愈合速度［5］。但逆轉(zhuǎn)錄病毒有可能被整合到靶細(xì)胞的基因組，表達(dá)其所攜帶的外源性基因，這存在基因突變致癌的潛在風(fēng)險(xiǎn)。

腺病毒相關(guān)病毒（AAV）是一種無包膜的單鏈DNA缺陷型病毒。在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，有將AAV用作組織工程相關(guān)的基因的傳遞載體的報(bào)道。將AAV／血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子基因復(fù)合物用于治療小鼠深度燒傷創(chuàng)面［6］、大鼠全層皮缺損創(chuàng)面［7］和糖尿病小鼠的皮膚傷口［8］的研究表明，AAV／血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子基因復(fù)合物可以促進(jìn)創(chuàng)面的血管化和細(xì)胞外基質(zhì)的成熟，加快傷口的愈合。

腺病毒是雙鏈DNA病毒，具有宿主范圍廣、攜帶外源性基因的容量大等優(yōu)點(diǎn)。導(dǎo)入的基因在宿主細(xì)胞內(nèi)是以游離的形式存在，不會(huì)整合到宿主細(xì)胞的基因組中［9］。腺病毒作為基因傳遞載體在組織工程領(lǐng)域也被廣泛研究。將攜帶VEGF基因的腺病毒直接混合到移植顆粒脂肪內(nèi)注射到體內(nèi)后，可以促進(jìn)血管的形成，提高移植脂肪的成活率［10］。但病毒類基因載體仍存在免疫原性等潛在風(fēng)險(xiǎn)，所以構(gòu)建生物安全性高、生物相容性好、轉(zhuǎn)染效率高和靶向特異性強(qiáng)的新型基因傳遞載體是基因治療領(lǐng)域的重要課題。

2 用于基因傳遞的非病毒載體

非病毒基因傳遞載體的生物安全性隱患小、免疫原性低、操作簡(jiǎn)單，近年來得到廣泛研究。陽(yáng)離子脂質(zhì)體是最常見的非病毒基因傳遞載體，聚乙烯亞胺（PEI）、聚賴氨酸（PLL）、殼聚糖、明膠等聚合物作為非病毒基因傳遞載體也備受關(guān)注。

帶正電荷的陽(yáng)離子脂質(zhì)體［11］與帶負(fù)電荷的質(zhì)粒DNA能夠通過靜電相互作用結(jié)合，形成脂質(zhì)體／DNA復(fù)合物。陽(yáng)離子脂質(zhì)體表面的過剩正電荷為脂質(zhì)體／DNA復(fù)合物被帶負(fù)電荷的細(xì)胞膜吸附提供條件。脂質(zhì)體本身具有的親脂性，使脂質(zhì)體／DNA復(fù)合物能夠通過細(xì)胞的內(nèi)吞作用或者細(xì)胞膜的融合作用進(jìn)入細(xì)胞，復(fù)合物在細(xì)胞質(zhì)或者細(xì)胞核內(nèi)釋放DNA，實(shí)現(xiàn)基因的轉(zhuǎn)錄、翻譯和表達(dá)［12］。陽(yáng)離子脂質(zhì)體通常由陽(yáng)離子脂質(zhì)和中性輔助磷脂兩部分組成。其中，陽(yáng)離子脂質(zhì)可以通過靜電引力與帶負(fù)電荷的DNA質(zhì)粒結(jié)合，包被DNA質(zhì)粒形成復(fù)合物；而中性輔助磷脂則可降低陽(yáng)離子脂質(zhì)的細(xì)胞毒性，并增強(qiáng)陽(yáng)離子脂質(zhì)的細(xì)胞滲透能力，提高陽(yáng)離子脂質(zhì)體的基因轉(zhuǎn)染效率［13-14］。Jeschke等［15］用陽(yáng)離子脂質(zhì)體作為胰島素樣生長(zhǎng)因子（IGF-Ⅰ）基因的傳遞載體，用于大鼠的燒傷創(chuàng)面治療，結(jié)果表明大鼠血清和肝臟中的生長(zhǎng)因子蛋白濃度有所提高，創(chuàng)面愈合顯著加快。在陽(yáng)離子脂質(zhì)體中引入膽固醇或其衍生物后，可以提高脂質(zhì)體／DNA復(fù)合物對(duì)靶細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)染效率。例如，在陽(yáng)離子脂質(zhì)體中嵌入膽固醇后，由于膽固醇具有親脂性，可以使陽(yáng)離子脂質(zhì)體／DNA復(fù)合物更順利地通過質(zhì)膜，提高復(fù)合物的細(xì)胞滲透功能，并穩(wěn)定脂質(zhì)雙層膜、減輕陽(yáng)離子成分對(duì)細(xì)胞的毒性［16-17］。Shigeta等［18］合成的具有較寬pH緩沖能力的膽固醇衍生物與陽(yáng)離子脂質(zhì)體共同包被質(zhì)粒DNA，轉(zhuǎn)染肝細(xì)胞的結(jié)果表明，該復(fù)合物具有類似聚乙烯亞胺作為基因傳遞載體時(shí)的質(zhì)子海綿效應(yīng)，能夠加速?gòu)?fù)合物從溶酶體釋放，使外源性質(zhì)粒DNA有效被釋放到靶細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，明顯提高基因轉(zhuǎn)染效率。

除陽(yáng)離子脂質(zhì)體外，近年將聚賴氨酸（PLL）、聚乙烯亞胺（PEI）等合成的陽(yáng)離子聚合物以及殼聚糖、明膠等天然聚合物用作基因傳遞載體的研究也很活躍。Laemmli等［19］在1975年證明PLL有壓縮DNA質(zhì)粒的能力，體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)都表明其可用于基因傳遞載體［20-21］。伯胺基的數(shù)量影響PLL壓縮DNA質(zhì)粒形成復(fù)合物的能力，只有當(dāng)PLL的分子量大于3kDa時(shí)，才能有效地壓縮質(zhì)粒DNA形成穩(wěn)定的復(fù)合物［22］，而高分子量的PLL存在相對(duì)較大的細(xì)胞毒性。用聚乙二醇修飾PLL后，可以提高PLL／DNA復(fù)合物的穩(wěn)定性，同時(shí)降低對(duì)細(xì)胞的毒性［23］。

聚乙烯亞胺（PEI）是目前研究最廣泛的陽(yáng)離子聚合物基因載體，也是基因傳遞能力最強(qiáng)的合成聚合物，被認(rèn)為是合成高分子基因傳遞載體的金標(biāo)準(zhǔn)［24］。它有線性和支化兩種結(jié)構(gòu)形式。支化PEI作為基因傳遞載體時(shí)的最重要特性是具有質(zhì)子海綿效應(yīng)，基因轉(zhuǎn)染效率較高。PEI／DNA復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞后，在吞噬泡的酸性環(huán)境中質(zhì)子化，正電荷增多，使溶酶體破裂，復(fù)合物可被有效釋放，這為后續(xù)的基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)提供了良好基礎(chǔ)［25-26］。高分子量的PEI雖然轉(zhuǎn)染效率較高，但因帶有高密度的正電荷，且不易被降解，在細(xì)胞內(nèi)的積累影響細(xì)胞的功能，細(xì)胞毒性較大。通過對(duì)高分子量PEI進(jìn)行化學(xué)修飾可以降低其細(xì)胞毒性［27］，例如用聚乙二醇修飾PEI后，不僅可降低PEI的細(xì)胞毒性、明顯提高細(xì)胞的存活率，而且可提高PEI／DNA復(fù)合物的穩(wěn)定性，與未經(jīng)修飾的PEI相比，體外的細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率提高約三倍［28］。

殼聚糖是天然的陽(yáng)離子高分子，具有細(xì)胞毒性低、可被生物降解、免疫原性低等優(yōu)點(diǎn)。將其用作基因傳遞載體的研究表明，它可以有效地壓縮DNA并保護(hù)其不被核酸酶降解［29-30］。殼聚糖的脫乙酰度、分子量以及DNA濃度、pH值等影響殼聚糖與DNA形成的復(fù)合物的性能和基因轉(zhuǎn)染效率［31-32］。殼聚糖也存在與其他非病毒基因傳遞載體相似的兩大不足，即細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率較低和細(xì)胞靶向性弱。

明膠也具有細(xì)胞毒性低、可被生物降解、免疫原性低等優(yōu)點(diǎn)。已被證明可以作為基因傳遞載體［33］。Hosseinkhani等［34］制備陽(yáng)離子化明膠／骨形成蛋白基因納米復(fù)合物，將復(fù)合物裝載于膠原海綿支架內(nèi)體外轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)表明，陽(yáng)離子化明膠能夠使其攜帶的骨形成蛋白基因轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，并使目的基因表達(dá)、促進(jìn)骨的形成。

無論是合成高分子還是天然高分子，用作基因傳遞載體時(shí)需要進(jìn)一步解決的問題是如何使其兼具良好的生物降解性、低毒性、高靶向性和高轉(zhuǎn)染效率。

3 絲素蛋白作為基因傳遞載體的研究

絲素蛋白具有良好的生物相容性，可被生物降解［35］，對(duì)生物體無毒性、無刺激性、無明顯的免疫原性，且絲素的降解產(chǎn)物對(duì)生物體無毒副作用［36-37］，被廣泛地用于細(xì)胞培養(yǎng)載體和組織工程支架。經(jīng)基因工程方法改性的絲蛋白具有新的性能。將蜘蛛絲蛋白的基因與聚賴氨酸基因片段重組后，可得到含聚賴氨酸序列的重組蜘蛛絲蛋白［38］。該重組蜘蛛絲蛋白的表面帶更多的正電荷，有助于包被、壓縮DNA，形成重組蜘蛛絲蛋白／DNA納米級(jí)的復(fù)合物。含有30個(gè)賴氨酸殘基的重組絲蛋白與DNA復(fù)合后轉(zhuǎn)染HEK細(xì)胞時(shí)的轉(zhuǎn)染效率約為14%，而不含聚賴氨酸序列的絲蛋白的轉(zhuǎn)染效率僅為約0.4%。

柞蠶絲素蛋白是最常見的一種野蠶絲素蛋白，其氨基酸序列中含有的精氨酸-甘氨酸-天門冬氨酸（RGD）三肽序列能與哺乳動(dòng)物細(xì)胞表面黏附家族中的整合素特異性結(jié)合，有利于其用作基因傳遞載體時(shí)被細(xì)胞粘附、吞噬［39］。Ma等［40］利用帶負(fù)電荷的柞蠶絲素蛋白的良好細(xì)胞相容性和可降解性，能夠屏蔽PEI多余的正電荷、減小細(xì)胞毒性，表面存在細(xì)胞特異性粘附序列，可以與血管內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等細(xì)胞表面的受體發(fā)生特異性相互作用等特點(diǎn)，用柞蠶絲素蛋白和PEI（25kDa）共同作為VEGF165和Ang-1雙基因共表達(dá)質(zhì)粒的傳遞載體，研究了與PEI單獨(dú)作為傳遞載體相比，載體的形態(tài)、結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)的變化，及其對(duì)細(xì)胞毒性、轉(zhuǎn)染效率的影響。柞蠶絲素蛋白的導(dǎo)入，能夠提高PEI／DNA復(fù)合物的細(xì)胞親和性，更好地避免其被核酸酶降解。用柞蠶絲素／PEI／DNA復(fù)合物體外轉(zhuǎn)染小鼠成纖維細(xì)胞L929的結(jié)果表明，與單純使用PEI相比，能有效降低細(xì)胞毒性、提高轉(zhuǎn)染效率并使目的基因表達(dá)。依靠靜電相互作用，用柞蠶絲素蛋白與PEI聯(lián)合包被質(zhì)粒DNA后轉(zhuǎn)染HEK293和HCT116細(xì)胞時(shí)，同樣能顯著降低PEI／DNA復(fù)合物的細(xì)胞毒性，更高效地使外源性基因轉(zhuǎn)染HEK293 和 HCT116細(xì)胞［41］。

由于未經(jīng)改性的絲素蛋白在生理?xiàng)l件下帶有負(fù)電荷，與帶負(fù)電荷的質(zhì)粒DNA之間存在靜電斥力，難以包裹、壓縮DNA?；瘜W(xué)改性是調(diào)節(jié)絲素的性能以適應(yīng)不同應(yīng)用需求的重要手段。絲素蛋白含有一定量的帶極性側(cè)鏈的氨基酸殘基，能夠作為化學(xué)修飾的潛在反應(yīng)位點(diǎn)，這為絲素蛋白的化學(xué)改性及其用作基因傳遞載體提供了物質(zhì)基礎(chǔ)［42-43］。扈永培等［44］利用陽(yáng)離子多胺類物質(zhì)精胺對(duì)柞蠶絲素蛋白進(jìn)行化學(xué)修飾，使改性后的柞蠶絲素蛋白在生理環(huán)境下帶正電荷，得到陽(yáng)離子化的柞蠶絲素蛋白，用陽(yáng)離子化柞蠶絲素包被VEGF165-Ang-1雙基因共表達(dá)質(zhì)粒體外轉(zhuǎn)染小鼠成纖維細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞，能明顯提高細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率和降低對(duì)細(xì)胞的毒性，為皮膚真皮等含血管組織的微血管網(wǎng)絡(luò)再生和缺損組織的修復(fù)提供了一種新的基因傳遞載體。Numata等［45］利用基因工程的方法在家蠶絲素鏈上插入L-賴氨酸和RGD序列，構(gòu)建新型絲素蛋白用作基因載體。研究結(jié)果表明，當(dāng)該新型絲素-賴氨酸-RGD聚合物與DNA的N／P比大于2／1時(shí)，能夠有效包裝、壓縮DNA。轉(zhuǎn)染人宮頸癌細(xì)胞（Hela）和人胚腎成纖維細(xì)胞（HEK）的結(jié)果表明，該新型絲素蛋白用作基因傳遞載體時(shí)，能夠有效地被細(xì)胞粘附，尤其能夠被細(xì)胞膜表明存在大量RGD受體的Hela細(xì)胞粘附，能夠有效地使其攜帶的目的基因轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞。

4 結(jié)語

絲素蛋白經(jīng)生物、化學(xué)或物理方法改性后得到的陽(yáng)離子化絲素蛋白具備作為基因傳遞載體的基本條件。通過對(duì)絲素蛋白的修飾、改性技術(shù)及其介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染機(jī)制的深入研究，有可能為生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域提供一類高效、低毒性的新型基因傳遞載體。

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