測(cè)定梔子金花丸中三種成分的含量及梔子苷的溶出度

陳 威，尹長(zhǎng)江，劉翠哲，常金花，劉 沛，劉喜綱*

(1.河北省中藥研究與開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，承德醫(yī)學(xué)院中藥研究所，承德 067000；2.承德醫(yī)學(xué)院臨床技能教學(xué)中心，承德 067000)

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藥品質(zhì)量與檢驗(yàn)

測(cè)定梔子金花丸中三種成分的含量及梔子苷的溶出度

陳 威1，尹長(zhǎng)江2，劉翠哲1，常金花1，劉 沛1，劉喜綱1*

(1.河北省中藥研究與開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，承德醫(yī)學(xué)院中藥研究所，承德 067000；2.承德醫(yī)學(xué)院臨床技能教學(xué)中心，承德 067000)

目的：建立同時(shí)測(cè)定梔子金花丸中梔子苷、鹽酸小檗堿和黃芩苷含量的方法，并測(cè)定丸中梔子苷的溶出度。方法：采用高效液相色譜法，流動(dòng)相為甲醇-0.1%磷酸溶液，梯度洗脫，流速為0.8 ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm；采用《中國(guó)藥典》中槳法測(cè)定梔子金花丸中梔子苷在水中的溶出量，計(jì)算累積溶出度。結(jié)果：梔子苷在0.007～0.336 μg 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r=0.999 9)，平均回收率為99.7%，RSD為2.5%；鹽酸小檗堿在0.013～0.624 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r=0.999 8)，平均回收率為100.2%，RSD為1.7%；黃芩苷在0.010 5～0.630 μg 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r=0.999 8)，平均回收率為99.0%，RSD為2.3%。梔子苷45 min和120 min累積溶出度分別為79.9%和92.7% 結(jié)論：建立的方法簡(jiǎn)便、重復(fù)性好，可用于梔子金花丸的質(zhì)量控制。

梔子金花丸，梔子苷，鹽酸小檗堿，黃芩苷，溶出度

梔子金花丸由梔子、黃連、黃芩、黃柏、大黃、金銀花、知母、天花粉等8味中藥組成，收載于《中國(guó)藥典》2010年版一部。臨床用于肺胃熱盛、口舌生瘡、牙齦腫痛、目赤眩暈、咽喉腫痛、吐血衄血、大便秘結(jié)等癥?！吨袊?guó)藥典》中已有梔子苷的含量測(cè)定，規(guī)定每1 g含梔子以梔子苷計(jì)不得少于2.8 mg，其他藥物的含量測(cè)定尚未收錄。處方中梔子、黃芩、黃柏、黃連等4味藥約占處方量的60%，這4味藥的主要有效成分為梔子苷、黃芩苷和鹽酸小檗堿，進(jìn)行3種有效成分的含量測(cè)定可同時(shí)控制丸中4味藥的含量。參考文獻(xiàn)[1-4]，本文建立了HPLC法同時(shí)測(cè)定梔子金花丸中梔子苷、鹽酸小檗堿和黃芩苷的含量，同時(shí)以梔子苷為指標(biāo)成分，考查其在水中的溶出度，以進(jìn)一步評(píng)價(jià)其質(zhì)量。

1 儀器與試藥

Agilent 1260高效液相色譜儀(AT-350柱溫箱，美國(guó)安捷倫公司)；JA2003電子天平(北京精科天平)；AG-254電子分析天平(瑞士METTLER公司)；北利離心機(jī)(北京時(shí)代北利離心有限公司)；KQ2200DE超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；RC806溶出試驗(yàn)儀(天津市天大天發(fā)科技有限公司)；梔子苷、鹽酸小檗堿和黃芩苷對(duì)照品(批號(hào)分別為110749-201115、110713-201212、110715-201117，均購自中國(guó)藥品生物制品檢定所)；梔子金花丸(北京同仁堂制藥有限公司，水丸，9 g/瓶，10瓶/盒，批號(hào)3083063、4082211、4082209)；甲醇為色譜純；水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱為Dimonsil-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相為甲醇(A)-0.1%磷酸溶液(B)梯度洗脫，梯度洗脫程序?yàn)? min(25%A)，18 min(25%A)，20 min(35%A)，30 min(35%A)，50 min(60%A)，55 min(80%A)，60 min(25%A)；檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm；流速為0.8 ml/min；柱溫35 ℃；進(jìn)樣量5 μl。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取梔子苷、鹽酸小檗堿和黃芩苷對(duì)照品，分別置于25 ml量瓶中，加入70%甲醇超聲(100 W，40 kHz)溶解，放至室溫，再加入70%甲醇定容至刻度，搖勻。分別精密量取上述3種對(duì)照品溶液各5 ml，置于25 ml量瓶中，用70%甲醇定容至刻度，制成每1 ml含梔子苷 28 μg、鹽酸小檗堿52 μg和黃芩苷42 μg的混合溶液，作為對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取梔子金花丸(水丸)適量，用研缽研細(xì)，精密稱取約1 g置于50 ml量瓶中，加入適量70%甲醇溶液，超聲40 min(100 W，40 kHz)，放至室溫，加70%甲醇定容至刻度，然后置離心機(jī)中離心15 min(13 000 r/min)，取上清液作為供試品溶液。

2.2.3 陰性對(duì)照溶液的制備 取知母、天花粉、大黃和金銀花，分別粉碎，按照《中國(guó)藥典》2010年版一部梔子金花丸項(xiàng)下各味藥的處方量，稱取知母、天花粉、大黃和金銀花，混合，用水泛丸制備得到缺梔子、黃連、黃柏與黃芩的陰性樣品。取陰性樣品適量，研細(xì)，精密稱取1 g，按“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液的制備方法制備，即得。

2.3 專屬性考查 分別精密吸取對(duì)照品、供試品和陰性對(duì)照溶液各5 μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，結(jié)果見圖1。在上述色譜條件下，樣品溶液的梔子苷、鹽酸小檗堿和黃芩苷的主峰與雜質(zhì)峰之間的分離良好，且陰性無干擾。

2.4 線性關(guān)系考查 取上述3種對(duì)照品的混合對(duì)照品溶液，分別進(jìn)樣0.5、1、3、5、8、10和12 μl，測(cè)定峰面積，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積值(Y)為縱坐標(biāo)繪制工作曲線，分別得到回歸方程：梔子苷Y=2.17×106X-538(r=0.999 9)；鹽酸小檗堿Y=8.54×106X+4 785(r=0.999 8)；黃芩苷Y=3.29×106X+40 044(r=0.999 8)；表明梔子苷在0.007～0.336 μg、鹽酸小檗堿在0.013～0.624 μg、黃芩苷在0.010 5～0.630 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取上述混合對(duì)照品溶液5 μl，重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積，結(jié)果梔子苷、鹽酸小檗堿和黃芩苷峰面積的RSD分別為1.97%、1.80%和1.69%。

1.梔子苷 2.鹽酸小檗堿 3.黃芩苷

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取一定量的供試品溶液，室溫放置0、4、8、12和24 h，分別進(jìn)樣測(cè)定峰面積，結(jié)果梔子苷、鹽酸小檗堿和黃芩苷峰面積的RSD分別為2.13%、1.48%和0.75%，表明24 h內(nèi)溶液穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 分別精密稱取樣品共6份，按“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備并測(cè)定樣品含量，結(jié)果梔子苷含量為6.59 mg/g，RSD為1.99%；鹽酸小檗堿含量為4.42 mg/g，RSD為1.93%；黃芩苷含量為15.92 mg/g，RSD為0.76%。

2.8 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的梔子金花丸細(xì)粉6份，精密稱定，分別加入一定量的梔子苷、鹽酸小檗堿和黃芩苷對(duì)照品溶液，按“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備，測(cè)定并計(jì)算回收率，結(jié)果梔子苷平均回收率為99.7%，RSD為2.5%，鹽酸小檗堿平均回收率為100.2%，RSD為1.7%；黃芩苷平均回收率為99.0%，RSD為2.3%。見表1。

2.9 樣品測(cè)定 取梔子金花丸3批，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備，分別取對(duì)照品溶液與供試品溶液各5 μl進(jìn)樣，按上述色譜條件測(cè)定，計(jì)算，結(jié)果見表2。

2.10 溶出度測(cè)定 按《中國(guó)藥典》2010年版二部溶出度測(cè)定法(附錄ⅩC 第二法，槳法)，以900 ml脫氣純化水為溶出介質(zhì)，溫度(37±0.5)℃，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速100 r/min，取樣品6份，精密稱定置于溶出杯中，分別于5、8、10、20、30、45、60、90和120 min時(shí)取樣2 ml，同時(shí)補(bǔ)加同溫介質(zhì)2 ml，離心，注入液相色譜儀，測(cè)定峰面積并計(jì)算溶出度，結(jié)果平均累積溶出度分別為21.0%、30.4%、33.1%、53.2%、64.6%、79.9%、87.1%、92.2%和92.7%。溶出曲線見圖2。

表1 3種成分的加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

表2 梔子金花丸樣品中3種成分的含量測(cè)定結(jié)果

圖2 梔子金花丸中梔子苷在水中的溶出曲線

從梔子苷在水中的溶出度結(jié)果可以看出，45 min時(shí)為79.9%，120 min時(shí)為92.7%，其結(jié)果符合《中國(guó)藥典》二部溶出度測(cè)定法中規(guī)定的一般在45 min溶出70%以上的要求。一般認(rèn)為傳統(tǒng)丸劑(如蜜丸和水丸等)釋放遲緩，起效慢，而本研究發(fā)現(xiàn)，梔子金花丸在100 r/min情況下梔子苷的溶出行為更符合普通制劑。由于丸劑多以藥材粉末入藥，藥材經(jīng)過粉碎后，一部分破碎細(xì)胞的有效成分溶出和化學(xué)藥物相似，另一部分具完好細(xì)胞結(jié)構(gòu)的有效成分的溶出需要經(jīng)過溶劑滲透入細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)溶解后經(jīng)過細(xì)胞壁，再擴(kuò)散到介質(zhì)中的過程，相比化學(xué)藥物來說，溶出過程會(huì)延緩，因此本研究選擇了攪拌強(qiáng)度為“最強(qiáng)級(jí)”的100 r/min[5]。同時(shí)由于丸劑以藥材粉末入藥，由于產(chǎn)地的差異，藥材質(zhì)量差異大[6]，相應(yīng)制劑質(zhì)量差異較大，但質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)控制卻不如化學(xué)藥嚴(yán)格，中藥沒有溶出度檢查，從本研究來看，在相對(duì)化學(xué)藥的溶出條件適當(dāng)寬松的情況下，增加一些丸劑的溶出度指標(biāo)控制，如增加梔子金花丸的梔子苷溶出度控制指標(biāo)，可以更好地控制丸劑的質(zhì)量。

3 討論

3.1 采用DAD 檢測(cè)器考查了不同波長(zhǎng)下梔子苷、鹽酸小檗堿、黃芩苷峰形及峰面積，檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm時(shí)，發(fā)現(xiàn)3種成分的峰型，分離度均較好，故選擇254 nm作為測(cè)定波長(zhǎng)。

3.2 分別采用不同比例和梯度的流動(dòng)相時(shí)，發(fā)現(xiàn)雜質(zhì)干擾測(cè)定，分離效果不好，采用文中的流動(dòng)相比例時(shí)，使得3種成分能夠很好的分離。

3.3 在進(jìn)行溶出度考查研究時(shí)，由于梔子苷溶解于水，選擇水作為溶出介質(zhì)，轉(zhuǎn)速選擇100 r/min，而其在“最弱級(jí)”50 r/min和“中級(jí)”75 r/min時(shí)的溶出情況還需要進(jìn)一步研究[5]。而且由于梔子金花丸中有效成分較多，僅以梔子苷作為指標(biāo)研究溶出度，并不能全面反映制劑的質(zhì)量，需要測(cè)定其他成分的溶出度，但以水為溶出介質(zhì)時(shí)液相色譜圖中未檢測(cè)到鹽酸小檗堿和黃芩苷的峰，這可能與鹽酸小檗堿和黃芩苷在水中的溶解度小有關(guān)，故本文只考查了梔子苷的溶出情況，鹽酸小檗堿和黃芩苷的溶出情況需要下一步改變?nèi)艹鰲l件來進(jìn)行測(cè)定。雖然本文只考查了梔子苷的溶出情況，但也提示我們，在一定的溶出條件下，通過溶出度檢查來控制梔子金花丸的質(zhì)量是可行的。

1 高曉燕，盧建秋. 梔子金花丸中梔子苷、黃芩苷、番瀉苷A和番瀉苷B的含量測(cè)定方法研究[J]. 中國(guó)中藥雜志，2009，34(20)：2649-2651

2 李偉佳，王強(qiáng).HPLC測(cè)定4種中藥制劑中梔子苷和黃芩苷的含量[J].中成藥，2007，29(8)：1177-1179

3 黃燕萍，黃焜. HPLC法同時(shí)測(cè)定梔子金花丸中梔子苷和黃芩苷的含量[J].中國(guó)藥事，2010，24(10):1002-1004

4 馬群，艾路，劉勇，等. 安宮牛黃丸中梔子苷、黃芩苷和鹽酸小檗堿含量測(cè)定研究[J].中國(guó)中藥雜志，2009，34(20)：2647-2648

5 謝沐風(fēng). 如何科學(xué)、客觀地制訂溶出度試驗(yàn)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[J]. 中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)雜志,2012,43(3):A23-A32

6 郭蘭萍，張燕，朱壽東，等. 中藥材規(guī)范化生產(chǎn)(GAP)10年:成果、問題與建議[J]. 中國(guó)中藥雜志, 2014, 39(7):1143-1151

Deter mination the content of three active components in Zhizi Jinhua pills and dissolution of geniposide

Chen Wei1，Yin Changjiang2，Liu Cuizhe1，Chang Jinhua1，Liu Pei1，Liu Xigang1

(1. Hebei Province key laboratory of Research and Development for Chinese Traditional Medicine；2. Clinical Skills Teaching Center，Chengde Medical College，Chengde 067000)

Objective：To develop an HPLC method for smultaneously determining the contents of geniposide, berberine hydrochloride and baicalin in Zhizi Jinhua pills and dissolution of geniposide. Methods: An HPLC analytical system established here included with methanol-0.1% phosphoric acid solution as mobile phase,the flow rate of which was 0.8 ml/min, the detection wave length was at 254 nm. The dissolubility of geniposide from tablets in aqueous solution was determined and the cumulative dissolution rate was calculated. Results:The linear range of geniposide was between 0.007～0.336 μg(r=0.999 9)；The linear range of berberine hydrochloride was between 0.013～0.624 μg(r=0.999 8)； the linear range of baicalin was between 0.010 5～0.630 μg(r=0.999 8). The average recoveries of geniposide, berberine hydrochloride, baicalin were 99.7% (RSD was 2.5%)，100.2%(RSD was 1.7%), 99.0% (RSD was 2.3%), respectively. The cumulative dissolution rate of geniposide was 79.9% in 45 min and 92.7% in 120 min. Conclusion：The method is simple and reproducible, it can be used for the quality evaluation of Zhizi Jinhua pills.

Zhizi Jinhua pills，geniposide，berberine hydrochloride，baicalin，dissolution

2015-02-04

河北省高等學(xué)?？茖W(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(No.QN2014145)；承德市科學(xué)技術(shù)研究與發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(No.201021020)；河北省高校定點(diǎn)學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目(No.冀教高[2003]4號(hào))

R+.

A

1006-5687(2015)03-0004-03

*通訊作者：劉喜綱，E-mail：liuxgmail@sina.com。