RNA干擾沉默survivin基因?qū)ca-109細(xì)胞增殖與凋亡的影響*

牛朝霞，李寧寧，陳　潔，李宜培，彭蕤蕤，秦紫芳

河南醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校病理生理學(xué)教研室 鄭州 451191

△女，1979年10月生，碩士，講師，研究方向：惡性腫瘤功能基因組學(xué)，E-mail:nzx99@163.com

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RNA干擾沉默survivin基因?qū)ca-109細(xì)胞增殖與凋亡的影響*

牛朝霞△，李寧寧，陳潔，李宜培，彭蕤蕤，秦紫芳

河南醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校病理生理學(xué)教研室 鄭州 451191

△女，1979年10月生，碩士，講師，研究方向：惡性腫瘤功能基因組學(xué)，E-mail:nzx99@163.com

關(guān)鍵詞RNA干擾；survivin；細(xì)胞增殖；細(xì)胞凋亡；Eca-109細(xì)胞

摘要目的：通過(guò)RNA干擾抑制食管癌細(xì)胞Eca-109 survivin基因的表達(dá)，觀察survivin基因沉默對(duì)Eca-109細(xì)胞增殖與凋亡的影響。方法：構(gòu)建靶向survivin基因的siRNA表達(dá)載體并借助脂質(zhì)體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Eca-109細(xì)胞(干擾組)，同時(shí)設(shè)轉(zhuǎn)染無(wú)關(guān)干擾質(zhì)粒的Eca-109細(xì)胞為陰性對(duì)照，未轉(zhuǎn)染細(xì)胞為空白對(duì)照。采用Western blot檢測(cè)survivin基因沉默效果，MTT、平板克隆形成實(shí)驗(yàn)及流式細(xì)胞術(shù)分析干擾前后Eca-109細(xì)胞增殖與凋亡的變化。結(jié)果：與兩對(duì)照組相比，干擾組Survivin蛋白的表達(dá)降低(F=79.397，P<0.001)；MTT檢測(cè)結(jié)果顯示，干擾組抑制細(xì)胞增殖效果優(yōu)于兩對(duì)照組，而平板克隆形成實(shí)驗(yàn)顯示干擾組克隆形成率低于兩對(duì)照組(F=162.026，P<0.001)；流式細(xì)胞術(shù)分析顯示，干擾組凋亡指數(shù)高于兩對(duì)照組(F=2 284.205，P<0.001)。結(jié)論：RNA干擾可特異性沉默survivin基因的表達(dá)，抑制Eca-109細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

AbstractAim: To inhibit endogenous survivin expression by RNA interference technology and investigate the effects on proliferation and apoptosis of Eca-109 cells.Methods: An siRNA expressing vector targeting survivin was constructed and transfected into Eca-109 cells via LipofectamineTM2000 to establish stable transfection cell line.The Eca-109 cells transfected non-sense sequence and those untransfected were used as control.The expression level of Survivin protein was detected by Western blot to observe the interference effect; cell proliferation of Eca-109 cells was determined by MTT assay and colony formation assay; cell apoptosis of Eca-109 cells was measured by flow cytometry analysis.Results: Compared with the 2 control groups, the expression level of Survivin protein in the interference group was significantly reduced(F=79.397，P<0.001); cell proliferation in the interference group was distinctly inhibited(F=162.026，P<0.001); the apoptosis index in the interference group was significantly increased(F=2 284.205，P<0.001). Conclusion: Knockdown of endogenous survivin via specific RNA interference can effectively inhibit cell proliferation and significantly induce cell apoptosis of Eca-109 cells.

Survivin作為一種在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起重要作用的凋亡抑制蛋白，廣泛表達(dá)于人類多種腫瘤，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、抑制細(xì)胞凋亡等功能[1-4]。食管癌是我國(guó)常見(jiàn)的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，其發(fā)生發(fā)展是多因素參與、多階段進(jìn)展的過(guò)程。目前針對(duì)食管癌中晚期患者臨床上依然采取手術(shù)根治輔以放化療，但術(shù)后5 a生存率較低，預(yù)后較差[5]。由此，人們嘗試將分子靶向基因治療應(yīng)用于臨床實(shí)踐中。目前已證實(shí)[6]，survivin基因高表達(dá)于食管癌組織中，而在正常食管組織中基本不表達(dá)。因此，survivin有望成為食管癌患者基因治療的潛在新靶點(diǎn)。該研究選擇survivin基因作為干擾靶點(diǎn)，利用RNA干擾技術(shù)檢測(cè)沉默該基因?qū)κ彻馨〦ca-109細(xì)胞增殖與凋亡的影響，為食管癌的診斷與治療提供理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料Eca-109細(xì)胞由上海細(xì)胞生物研究所建株。RPMI 1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶、胎牛血清(FBS)購(gòu)自Gibco公司，MTT、DMSO及LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒購(gòu)自Invitrogen 公司，引物DNA、T4 DNA連接酶、BamHⅠ/HindⅢ限制性內(nèi)切酶、Taq DNA聚合酶均購(gòu)自TaKaRa公司，蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)購(gòu)自Promega公司，BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒、ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自美國(guó)Pierce公司，質(zhì)粒抽提試劑盒購(gòu)自上海華舜生物工程公司，Survivin和β-actin抗體購(gòu)自Santa Cruz公司，干擾質(zhì)粒pRNAT-U6.1/Neo、陰性對(duì)照干擾質(zhì)粒siRNA購(gòu)自Gencript公司,Annexin V-FITC凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)BD公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)Eca-109細(xì)胞培養(yǎng)于含體積分?jǐn)?shù)10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基中，置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度達(dá)70%~80%時(shí)，以2.5 g/L胰蛋白酶進(jìn)行消化與傳代。

1.3靶向survivin的寡核苷酸序列的設(shè)計(jì)利用生物信息學(xué)軟件，針對(duì)survivin基因487~505 bp的靶位點(diǎn)設(shè)計(jì)兩條互補(bǔ)的DNA鏈，其序列分別為：5’-GATCCAGAATTTGAGGAAACTGCGCTGTGAAGCCAC AGATGGGCGCAGTTTCCTCAAATTCTTTTTTA-3’和3’-GTCTTAAACTCCTTTGACGCGACACTTCGGTGTCT ACCCGCGTCAAAGGAGTTTAAGAAAAAATTCGA-5’;兩條DNA鏈的結(jié)構(gòu)均為：BamHⅠ+正義序列+莖環(huán)序列+反義序列+轉(zhuǎn)錄終止子+HindⅢ，在細(xì)胞內(nèi)形成所謂的“發(fā)夾結(jié)構(gòu)”。

1.4siRNA表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建載體pRNAT-U6.1/Neo經(jīng)BamH Ⅰ和Hind Ⅲ雙酶切后與由TaKaRa公司合成的靶向survivin的寡核苷酸退火后連接，并進(jìn)行轉(zhuǎn)化，隨后挑取克隆，進(jìn)行質(zhì)粒抽提、菌落PCR鑒定及測(cè)序，得到針對(duì)survivin的siRNA表達(dá)質(zhì)粒pRNAT-siRNA-survivin，同法構(gòu)建陰性對(duì)照質(zhì)粒：pRNAT-siRNA-control，最后兩質(zhì)粒分別大量抽提后備用。

1.5細(xì)胞轉(zhuǎn)染待Eca-109細(xì)胞達(dá)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，將干擾質(zhì)粒pRNAT-siRNA-survivin和陰性對(duì)照質(zhì)粒pRNAT-siRNA-control按照LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒說(shuō)明分別轉(zhuǎn)染Eca-109細(xì)胞，48 h后用G418篩選2~3周，可見(jiàn)典型的抗性克隆，擴(kuò)大培養(yǎng)，建成穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系，分別為干擾組和陰性對(duì)照組，同時(shí)設(shè)未轉(zhuǎn)染的Eca-109細(xì)胞為空白對(duì)照。

1.6survivin基因沉默效果的Western blot檢測(cè)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的上述3組細(xì)胞，按蛋白抽提要求進(jìn)行處置，分別取50 μg總蛋白進(jìn)行不連續(xù)SDS-PAGE電泳；電泳結(jié)束后，用半干石墨電轉(zhuǎn)移2 h，將分離出的蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，用PBS配制的50 g/L脫脂奶粉溶液在室溫?fù)u床上封閉1~2 h，加入鼠抗人單克隆一抗(按1300稀釋)，4 ℃過(guò)夜孵育，洗膜，再加入相應(yīng)二抗，室溫孵育1.5 h，再洗膜，經(jīng)ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)和拍照，以β-actin作為內(nèi)對(duì)照，結(jié)果進(jìn)行灰度掃描，以Survivin/β-actin灰度值的比值作為Survivin蛋白的表達(dá)水平。重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

1.7細(xì)胞增殖的MTT檢測(cè)分別將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的上述3組細(xì)胞按0.5×104個(gè)/孔接種于96孔板，每孔200 μL，每組接種8孔；培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞融合達(dá)80%左右時(shí)每孔加MTT 20 μL，繼續(xù)孵育4 h，棄培養(yǎng)液，每孔再加入150 μL DMSO，振蕩10 min；然后在酶標(biāo)儀上測(cè)定490 nm處的OD值進(jìn)行比色；如此每隔24 h重復(fù)上述步驟，共檢測(cè)6 d。最后以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，間隔時(shí)間為橫坐標(biāo)，繪制生長(zhǎng)曲線。

1.8細(xì)胞增殖的平板克隆形成檢測(cè)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的上述3組細(xì)胞，分別行常規(guī)胰蛋白酶消化，并吹打成單細(xì)胞懸液，按200個(gè)/孔接種于6孔板，每種細(xì)胞接種3孔，置37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)2~3周，直至肉眼可見(jiàn)細(xì)胞克隆，終止培養(yǎng)；棄去上清液，用PBS小心浸洗2次；加甲醇5 mL固定15 min，棄去固定液；加Giemsa液室溫染色10~30 min，用清水緩慢洗去染色液，空氣中干燥，將平皿倒置并疊加一張帶網(wǎng)格的透明膠片，用肉眼直接計(jì)數(shù)克隆數(shù)，并計(jì)算克隆形成率(克隆形成率=克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)×100%)。重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

1.9細(xì)胞凋亡率的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的上述3組細(xì)胞各3瓶，按照Annexin V-FITC凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明分別檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡,計(jì)算凋亡指數(shù)(apoptosis index,AI)，AI=凋亡細(xì)胞數(shù)/觀察細(xì)胞數(shù)×100%。重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

1.10統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 17.0處理數(shù)據(jù)，應(yīng)用單因素方差分析比較3組細(xì)胞Survivin蛋白的表達(dá)水平、克隆形成率及AI的差異，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2結(jié)果

2.13組細(xì)胞Survivin蛋白的表達(dá)見(jiàn)圖1?？瞻讓?duì)照組、陰性對(duì)照組及干擾組Survivin蛋白的表達(dá)水平分別為(46.20±2.62)、(44.17±3.15)和(18.75±3.12)，3組間相比，F(xiàn)=79.397，P<0.001；與兩對(duì)照組相比，干擾組Survivin蛋白的表達(dá)水平降低(P<0.05)。

圖1　3組細(xì)胞中Survivin蛋白的表達(dá)

2.23組細(xì)胞增殖的變化見(jiàn)圖2、3，表1。由圖2可知，從第4天開(kāi)始，干擾組Eca-109細(xì)胞的生長(zhǎng)活力比陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組降低，而后兩者的細(xì)胞生長(zhǎng)活力無(wú)明顯變化。由圖3、表1可知，與兩對(duì)照組相比，干擾組的細(xì)胞克隆生長(zhǎng)速度較慢，形成的克隆較小，克隆數(shù)較少；干擾組克隆形成率較陰性對(duì)照組及空白對(duì)照組低。

圖2　3組細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線

圖3　3組細(xì)胞的平板克隆形成情況

2.33組細(xì)胞AI的比較見(jiàn)表1。由表1可知，與兩對(duì)照組相比，干擾組細(xì)胞的AI升高。

表1　3組細(xì)胞平均克隆形成率和AI的比較　%

*：與兩對(duì)照組相比，P<0.05。

3討論

survivin作為一種抗凋亡基因，與腫瘤的生長(zhǎng)、腫瘤血管生成、腫瘤細(xì)胞對(duì)放化療藥物的敏感性以及腫瘤的診斷、治療、預(yù)后及復(fù)發(fā)等密切相關(guān)；抑制survivin基因的表達(dá)能夠在一定程度上誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，進(jìn)而提高細(xì)胞對(duì)放化療藥物的敏感性[7]。同時(shí)survivin基因具有高度保守性，幾乎高表達(dá)于人類所有的腫瘤組織中，與惡性腫瘤的關(guān)系尤為密切，而在分化成熟的成年組織及癌旁正常組織中均無(wú)表達(dá)[8]。針對(duì)該特點(diǎn)，研究者[9-11]開(kāi)展了大量有關(guān)食管癌與survivin的研究，結(jié)果均表明survivin在食管癌組織中高表達(dá)，可能作為癌基因參與食管癌的發(fā)生、發(fā)展與形成，而在正常食管組織中基本不表達(dá)。因此，survivin有望成為食管癌基因治療的特異性靶點(diǎn)，進(jìn)而更好地實(shí)現(xiàn)包括手術(shù)、放化療及基因治療等在內(nèi)的理想的綜合治療措施。

RNA干擾技術(shù)作為近年來(lái)研究哺乳動(dòng)物細(xì)胞功能基因組學(xué)的一個(gè)新工具，具有高度序列專一性，可以特異地產(chǎn)生由雙鏈DNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后特定基因沉默的效果[12]；依據(jù)該原理，針對(duì)siRNA的RNA干擾技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于生物學(xué)、醫(yī)學(xué)及藥物研究等眾多研究領(lǐng)域中，同時(shí)也為臨床眾多惡性腫瘤尤其是中晚期腫瘤患者開(kāi)辟了基因治療的新路徑。

該研究中作者利用RNA干擾和重組體技術(shù)構(gòu)建靶向survivin基因的siRNA表達(dá)質(zhì)粒pRNAT-siRNA-survivin，并穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Eca-109細(xì)胞，結(jié)果顯示干擾后Survivin蛋白的表達(dá)水平較轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照質(zhì)粒的陰性對(duì)照組及未轉(zhuǎn)染的空白對(duì)照組下調(diào)，亦證實(shí)了構(gòu)建的pRNAT-siRNA-survivin表達(dá)質(zhì)粒具有高度特異性；MTT和平板克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明干擾后Eca-109細(xì)胞較兩對(duì)照組的細(xì)胞活力明顯下降，生長(zhǎng)緩慢，其克隆形成較小，數(shù)量較少，證實(shí)沉默survivin基因的表達(dá)能夠抑制Eca-109細(xì)胞的增殖；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果同時(shí)證實(shí)了抑制survivin基因的表達(dá)也可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

總之，該研究主要通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)了沉默survivin基因可抑制Eca-109細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；為了更好地指導(dǎo)臨床實(shí)踐，作者擬進(jìn)一步探索沉默survivin基因?qū)κ彻馨┘?xì)胞重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響，以及通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)更直觀地觀察靶向survivin的siRNA與食管癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。

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*國(guó)家留學(xué)基金委河南省地方合作項(xiàng)目201308410293；河南省教育廳科學(xué)技術(shù)研究重點(diǎn)項(xiàng)目(基礎(chǔ)研究計(jì)劃)13A320436；河南省科技廳基礎(chǔ)與前沿科技研究項(xiàng)目132300410464；河南省衛(wèi)生廳及鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院共建項(xiàng)目；河南省衛(wèi)生科技創(chuàng)新型人才工程中青年科技創(chuàng)新人才項(xiàng)目4099；河南省醫(yī)學(xué)科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目2011020038

Effects of silencing survivin gene by RNA interference on proliferation and apoptosis of Eca-109 cells

NIUZhaoxia,LINingning,CHENJie,LIYipei,PENGRuirui,QINZifang

DepartmentofPathophysiology,HenanMedicalCollege，Zhengzhou451191

Key wordsRNA interference;survivin;cell proliferation;cell apoptosis;Eca-109 cell

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2015.06.003

中圖分類號(hào)R735.1