喉鱗狀細胞癌患者癌組織中AHNAK基因轉錄表達情況及其臨床意義研究

張軍華

·論著·

喉鱗狀細胞癌患者癌組織中AHNAK基因轉錄表達情況及其臨床意義研究

張軍華

目的 研究喉鱗狀細胞癌(LSCC)患者癌組織中AHNAK基因轉錄表達情況及其臨床意義。方法 采集荊州市腫瘤醫(yī)院耳鼻喉科手術切除的LSCC癌組織標本62例，27例癌旁正常組織標本也取自62例LSCC患者。提取組織RNA，反轉錄為cDNA，采用實時熒光定量PCR法分析癌組織與癌旁正常組織中AHNAK基因mRNA表達情況。結果 癌組織中AHNAK基因mRNA相對表達量為(3.23±1.53)，高于癌旁正常組織的(1.35±0.59)(P<0.05)。不同性別、分型及組織病理分級的LSCC患者癌組織中AHNAK基因mRNA相對表達量比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。年齡≥65歲及41～64歲患者癌組織中AHNAK基因mRNA相對表達量高于≤40歲患者，臨床分期Ⅲ/Ⅳ期患者癌組織中AHNAK基因mRNA相對表達量高于Ⅰ/Ⅱ期患者，淋巴結轉移陽性患者癌組織中AHNAK基因mRNA相對表達量高于淋巴結轉移陰性患者(P<0.05)。結論 LSCC患者癌組織中AHNAK基因轉錄表達與年齡、臨床分期、淋巴結轉移有關，AHNAK可以成為預測、評價LSCC惡性程度的一個重要標志物。

喉腫瘤；癌，鱗狀細胞；AHNAK

喉鱗狀細胞癌(laryngeal squamous cell cancer，LSCC)發(fā)病率占全身惡性腫瘤的5.7%～7.6%，在耳鼻喉科領域中僅次于鼻咽癌和鼻腔鼻竇癌而位居第3位。盡管臨床上對喉癌的治療已進行了大量研究，但患者5年生存率仍未得到明顯改善。而喉癌的進一步研究熱點集中在能進行精確診斷、評估治療效果和預后的臨床病理學因子方面，鈣調(diào)蛋白AHNAK亦稱橋粒聯(lián)結蛋白(desmoyokin)，廣泛表達于各類型細胞，且參與多種細胞的生理過程，包括鈣離子調(diào)節(jié)及肌動蛋白細胞骨架的成形[1-2]。AHNAK與腫瘤細胞偽足形成有關，會影響腫瘤細胞的遷移和侵襲。本研究采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)法檢測LSCC患者癌組織及其癌旁組織中AHNAK基因mRNA表達情況，并探討其與LSCC臨床病理特征的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 采集荊州市腫瘤醫(yī)院耳鼻喉科手術切除的LSCC癌組織標本62例，均為首治患者，經(jīng)臨床和病理檢查確診。其中男48 例， 女14例；年齡35～82歲，平均(58±2)歲。按2002年國際抗癌聯(lián)盟(UICC)修訂標準分為聲門上型14例、聲門型32例和聲門下型16例；臨床分期：Ⅰ/Ⅱ期30例，Ⅲ/Ⅳ期32例；組織病理分級：低分化鱗癌9例、中分化鱗癌28例和高分化鱗癌25例；其中淋巴結轉移陽性21例。27例癌旁正常組織標本也取自62例LSCC患者，癌旁正常組織切取時距腫瘤邊緣1 cm以上。標本采集后立即投入液氮中速凍并保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑與設備 反轉錄試劑盒(PrimerScriptTMRT reagent Kit)和RT-PCR試劑盒(SYBR Premix Ex Taq)購自日本Takara公司；Trizol試劑購自美國Invitrogen公司；Tris-NH4Cl緩沖液配制方案：NH4Cl 1.03 g，三羥甲基氨基甲烷 3.735 g，加雙蒸水至500 ml，用HCl調(diào)整pH值至7.2；RT-PCR引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成(見表1)。PCR擴增儀(PERKIN ELMER-2231型)購自美國PE公司，RT-PCR儀StepOneTM購自美國Applied Biosystems公司。

表1 RT-PCR引物序列

1.3 實驗方法

1.3.1 提取組織RNA 組織樣本加入1 ml Trizol試劑后用研磨器研磨，勻漿徹底反復吹打混勻，冰上靜置15 min，加入200 μl三氯甲烷，顛倒振蕩15 s，冰上靜置10 min，4 ℃ 12 000 r/min離心；取上層液0.4～0.5 ml于新的EP管，加入等體積異丙醇顛倒混勻，冰上靜置5 min，4 ℃ 13 000 r/min離心10 min，棄上清液，加入4 ℃ 75%乙醇1 ml〔二乙基焦碳酸酯(DEPC)水配制〕，顛倒混勻，4 ℃ 10 000 r/min離心5 min，棄上清液真空干燥30 min，用DEPC水30 μl使RNA完全溶解、混勻。取制備的總RNA樣品3 μl，加Nuclease-Free水至1 ml，以紫外分光光度計測定RNA純度。

1.3.2 反轉錄 采用Takara公司的PrimerScriptTMRT reagent Kit 反轉錄試劑盒進行：取0.5 μg RNA模板，反應體系10 μl。反轉錄反應條件為37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。反應結束后補加30 μl雙蒸水進行稀釋即可作為PCR反應模板，放置于-20 ℃冰箱保存。

1.3.3 聚合酶聯(lián)反應(PCR) 采用SYBR Premix Ex Taq RT-PCR試劑盒進行：擴增產(chǎn)物長度為162 bp。PCR反應體系為20 μl，含DNA模版2 μl，循環(huán)參數(shù)：預變性95 ℃ 30 s，變性95 ℃ 5 s，退火57 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 45 s，循環(huán)40次。

1.3.4 mRNA相對表達量 選擇GAPDH管家基因作為內(nèi)參照，AHNAK基因mRNA相對表達量的計算采用2-ΔΔCt法，即：2-(ΔCtAHNAK-ΔCtGAPDH)。

2 結果

2.1 基因cDNA PCR倍增全過程 本研究所采用的RT-PCR法是實時記錄電腦監(jiān)控下每個樣本基因cDNA PCR倍增全過程(見圖1)。以每次PCR循環(huán)結束后熒光強度代表基因數(shù)量，在指數(shù)期采集各個樣本數(shù)據(jù)，經(jīng)內(nèi)參數(shù)校正后顯示癌組織及癌旁組織相對定量AHNAK基因mRNA表達水平。

圖1 cDNA PCR倍增全過程

2.2 不同臨床病理特征LSCC患者AHNAK基因mRNA表達情況 癌組織中AHNAK基因mRNA相對表達量為(3.23±1.53)，高于癌旁正常組織的(1.35±0.59)，差異有統(tǒng)計學意義(t=6.27，P<0.05)；不同性別、分型及組織病理分級的LSCC患者癌組織中AHNAK基因mRNA相對表達量比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；不同年齡、臨床分期及淋巴結是否轉移的LSCC患者癌組織中AHNAK基因mRNA相對表達量比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。其中年齡≥65歲及41～64歲患者癌組織中AHNAK基因mRNA相對表達量高于≤40歲患者，臨床分期Ⅲ/Ⅳ期和淋巴結轉移陽性患者癌組織中AHNAK基因mRNA相對表達量分別高于Ⅰ/Ⅱ期、淋巴結轉移陰性患者，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見表2)。

Table 2 Comparison of AHNAK gene mRNA relative expression in carcinoma tissue of different clinical characteristics of LSCC patients

臨床病理特征例數(shù)AHNAK基因mRNA相對表達量t(F)值P值年齡(歲)6 45?<0 05 ≤40182 22±1 47 41～64273 20±1 71 ≥65173 21±1 49性別0 66>0 05 男482 99±1 53 女143 21±1 51分型0 54?>0 05 聲門上型142 52±1 46 聲門型323 82±1 49 聲門下型163 48±1 44組織病理分級0 76?>0 05 低分化93 29±1 48 中分化282 53±1 41 高分化252 49±1 38臨床分期9 61<0 05 Ⅰ/Ⅱ期303 02±1 52 Ⅲ/Ⅳ期3212 52±5 21淋巴結轉移7 90<0 05 陽性219 81±4 32 陰性413 78±1 67

注：*為F值

3 討論

LSCC是一種發(fā)病率高、病情復雜、預后較差的耳鼻喉科疾病，其癌細胞轉移是影響患者預后的主要因素。AHNAK是一個分子質量為700 kDa的巨大蛋白質，廣泛分布于多種類型細胞[3]，其可能參與結腸上皮細胞的誘變、轉型過程，因此認為AHNAK具有致癌作用[4]；也有學者發(fā)現(xiàn)，AHNAK基因在結直腸癌等多種人類惡性腫瘤中的表達水平較高，AHNAK的異常表達可能與腫瘤細胞的浸潤、轉移相關[5]。Shankar等[6]認為，AHNAK影響腫瘤細胞偽足的形成和遷移/侵襲過程，是腫瘤細胞偽足形成和遷移/侵襲過程中必不可少的因素之一。

Dumitru等[7]研究發(fā)現(xiàn)，AHNAK可以作為評價LSCC患者生存期的一個比較新的獨立預后因子，可以為LSCC的診斷、預后和針對性治療提供準確的信息。其研究結果表明，LSCC癌組織中AHNAK基因的過量表達縮短了LSCC患者的生存期，如果AHNAK與巨噬細胞移動抑制因子(MIF)、CD66b等炎性標志物同時存在于LSCC患者癌組織中，則可更明顯地縮短LSCC患者的生存期，研究還提示中性粒細胞可能通過AHNAK增強腫瘤細胞的遷移/侵襲能力。

LSCC患者癌組織中AHNAK的轉錄表達情況仍不清楚，本研究采用RT-PCR法證實62例LSCC患者癌組織中AHNAK基因mRNA相對表達量高于癌旁正常組織，且中年患者癌組織中AHNAK基因mRNA相對表達量高于青年患者，這可能與本研究中中年晚期患者較多有關。本研究結果還顯示，臨床分期Ⅲ/Ⅳ期和淋巴結轉移陽性患者癌組織中AHNAK基因mRNA相對表達量分別高于Ⅰ/Ⅱ期、淋巴結轉移陰性患者，提示AHNAK基因在LSCC患者癌組織中的表達與臨床分期和淋巴結轉移有關，但與性別無明顯關系。值得注意的是，不同分型患者癌組織中AHNAK基因mRNA相對表達量間無差異，尚需大樣本研究進一步分析。

綜上所述，LSCC患者癌組織中AHNAK基因的表達水平與年齡、臨床分期、淋巴結轉移有關，AHNAK可以成為預測、評價LSCC惡性程度的一個重要標志物，可以為LSCC的診斷、治療和預后提供準確的信息，為LSCC的臨床診療提供新的思路。

[1]Gentil BJ，Delphin C，Mbele GO，et al.The giant protein AHNAK is a specific target for the calcium-and zinc-binding S100B protein: potential implications for Ca2+homeostasis regulation by S100B[J].J Biol Chem， 276(2001)：23253-23261.

[2]Haase H，Podzuweit T，Lutsch G，et al.Signaling from beta-adrenoceptor to L-type calcium channel: identification of a novel cardiac protein kinase A target possessing similarities to AHNAK[J].Faseb J，1999，13(15)：2161-2172.

[3]Shtivelman E，Cohen FE， Bishop JM.A human gene(AHNAK) encoding an unusually large protein with a 1.2-microns polyionic rod structure[J].Proc Natl Acad Sci USA，1992，89(12)：5472-5476.

[4]Tanaka M，Jin G，Yamazaki Y，et al.Nakamura，Identification of candidate cooperative genes of the Apc mutation in transformation of the colon epithelial cell by retroviral insertional mutagenesis[J].Cancer Sci，2008，99(5)：979-985.

[5]Nozawa H，Chiu C，Hanahan D.Infiltrating neutrophils mediate the initial angiogenic switch in a mouse model of multistage carcinogenesis[J].Proc Natl Acad Sci USA，2006，103(33)：12493-12498.

[6]Shankar J， Messenberg A，Chan J，et al.Pseudopodial actin dynamics control epithelial-mesenchymal transition in metastatic cancer cells[J].Cancer Res，2010，70(9)：3780-3790.

[7]Dumitru CA，Bankfalvi A，Gu X，et al.AHNAK and inflammatory markers predict poor survival in laryngeal carcinoma[J].PLoS One，2013，8(2)：e56420.

(本文編輯：謝武英)

Transcriptional Expression of AHNAK Gene of Laryngeal Squamous Cell Cancer and Its Clinical Significances

ZHANGJun-hua.DepartmentofOtorhinolaryngology，theTumorHospitalofJingzhou，Jingzhou434000，China

Objective To investigate the transcriptional expression of AHNAK gene of laryngeal squamous cell cancer(LSCC)and its clinical significances.Methods A total of 62 LSCC samples and 27 normal samples adjacent to carcinoma were collected in the Department of Otorhinolaryngology，the Tumor Hospital of Jingzhou.RNA was extracted and reverse transcribed to cDNA，real-time fluorescent quantitative PCR was used to detect the transcriptional expression of AHNAK gene.Results The relative mRNA quantity of AHNAK gene of LSCC samples was(3.23±1.53)，was higher than that of normal samples adjacent to carcinoma of(1.35±0.59)(P<0.05).No statistically significant differences of relative mRNA quantity of AHNAK gene was found in patients with different gender，UICC classifications or histopathologic grading(P>0.05)；relative mRNA quantity of AHNAK gene of patients aged over or equal to 65 years old and at 41 to 64 years old was higher than that of patients aged less than or equal to 40 years old，respectively；relative mRNA quantity of AHNAK gene of patients with clinical staging at Ⅲ to Ⅳ was higher than that of patients with clinical staging at Ⅰ to Ⅱ；relative mRNA quantity of AHNAK gene of patients with lymphatic metastasis was higher than that of patients without lymphatic metastasis(P<0.05).Conclusion Transcriptional expression of AHNAK gene of LSCC is correlated with age，clinical staging and lymphatic metastasis，may be a important tumor marker for predicting or evaluating the severity of LSCC.

Laryngeal neoplasms；Carcinoma，squamous cell；AHNAK

434000 湖北省荊州市腫瘤醫(yī)院耳鼻咽喉科

張軍華.喉鱗狀細胞癌患者癌組織中AHNAK基因轉錄表達情況及其臨床意義研究[J].實用心腦肺血管病雜志，2015，23(2)：46-48.[www.syxnf.net]

R 739.65

A

10.3969/j.issn.1008-5971.2015.02.014

2014-09-12；

2015-01-26)

Zhang JH.Transcriptional expression of AHNAK gene of laryngeal squamous cell cancer and its clinical significances[J].Practical Journal of Cardiac Cerebral Pneumal and Vascular Disease，2015，23(2)：46-48.