馬建山
(遼寧省動物疫病預(yù)防與控制中心,遼寧沈陽 110000)
豬丹毒的實驗室診斷方法
馬建山
(遼寧省動物疫病預(yù)防與控制中心,遼寧沈陽 110000)
豬丹毒是由豬丹毒桿菌引起的急性敗血型,或在皮膚發(fā)生特異性紅疹的熱性傳染性疾病,是豬的主要疫病之一。該病可根據(jù)流行病學(xué)資料、癥狀和病理解剖進行判斷,但因急性豬丹毒往往不易與其他急性的豬病區(qū)別,所以較為可靠的診斷方法是細菌檢查和動物接種,至于血清學(xué)的檢驗也有一定的診斷意義。
細菌檢查是診斷豬丹毒較為可靠的方法,可用于病豬生前和死后的檢查。
1.1 顯微鏡檢查在診斷豬病時,可從耳靜脈采血或切開疹塊擠出血液和滲出液作涂片。對急性病例的尸體,可從血液、脾、肝、腎及淋巴結(jié)采取材料作涂片,用革蘭氏或瑞氏法染色后作顯微鏡檢查。豬丹毒菌多是散在于紅細胞之間,也有成堆地存在,并常發(fā)現(xiàn)許多菌被白細胞吞噬的現(xiàn)象。慢性豬丹毒容易從心內(nèi)膜炎的瓣膜增生的纖維組織中找到細菌,并可見由長絲狀菌體構(gòu)成的叢狀物。此外,在顯微鏡檢查時,因豬丹毒桿菌在血液中數(shù)目較少,至少要看10個以上的視野再作判斷。
1.2 細菌培養(yǎng)如經(jīng)顯微鏡檢查找不到細菌或不能確定判定時,就要采用培養(yǎng)檢查法。即以無菌手續(xù)采取病豬的耳血或劃破疹塊部的皮膚取組織液,死豬尸體則從心血或肝、脾、腎及淋巴結(jié)中采取材料,接種于pH7.6~7.8的血液瓊脂斜面及馬丁肉湯中,置35℃培養(yǎng)24h后,按照豬丹毒桿菌的培養(yǎng)特性進行觀察,判斷結(jié)果。慢性病例應(yīng)從心瓣膜的纖維性增生組織中或有病變的關(guān)節(jié)囊內(nèi)采取材料作培養(yǎng)。
1.3 對死亡后時間已久的尸體作細菌培養(yǎng)由于這種材料容易被腐生菌污染,所以培養(yǎng)方法時用含有10%血清的馬丁瓊脂平面劃線接種,或者取管狀的骨髓作培養(yǎng)。但有的學(xué)者認為用骨髓不如用腎臟培養(yǎng)準確。但在交通不便的地區(qū)運送材料或遇尸體已經(jīng)腐敗時,應(yīng)采用骨髓作培養(yǎng)。被檢的材料可放在30%~40%的甘油或食鹽溶液內(nèi),以防腐敗。
此外,用細菌培養(yǎng)法診斷豬丹毒時,常會遇到混感情況,除丹毒菌外,還可分離出大腸桿菌、巴氏桿菌等,因此應(yīng)注意觀察,分清主次。
當被檢材料中含菌量極少,或已被污染,僅做細菌分離診斷有困難的,可以接種小動物作為補助診斷。接種材料可取疹塊部組織或血液,或脾、肝、腎等臟器,加少量生理鹽水作成乳劑直接注射,也可用病豬材料的24h肉湯培養(yǎng)物注射,劑量一般為小鼠皮下注射0.2mL,同時還注射豚鼠。如被檢材料是豬丹毒,則小鼠在接種后3~5d死亡,并可以從死亡動物的心血及脾、肝、腎等臟器內(nèi)分離到豬丹毒桿菌。
3.1 凝集反應(yīng)主要檢測慢性豬丹毒病豬血清中的凝集點。有顯微鏡下檢查法、試管凝集反應(yīng)與全血平板凝集反應(yīng)三種,其中以全血平板凝集反應(yīng)檢查方法最簡便。
(1)全血平板凝集反應(yīng)法:將選出的豬丹毒桿菌接種于10%馬血清的馬丁肉湯中,在37℃培養(yǎng)24h,加0.4%福爾馬林殺菌24h,再離心沉淀洗出菌體,懸浮于1%福爾馬林生理鹽水中,作為本試驗的抗原。為便于觀察反應(yīng),可在抗原中加入20%甘油及0.001%結(jié)晶紫。取被檢豬的血液1滴放于清潔的玻片上,加抗原1滴混合后在1min左右出現(xiàn)凝集的為陽性反應(yīng)?;技毙载i丹毒的病例在發(fā)病2~5d檢查,即可得出陽性結(jié)果,但應(yīng)注意凡經(jīng)豬丹毒菌苗免疫的或注射抗丹毒血清的豬,在一定時期內(nèi)亦呈現(xiàn)陽性反應(yīng),健康豬有時也有輕度凝集或可凝反應(yīng),不過出現(xiàn)反應(yīng)的時間多在1.5~2.0min以后。
(2)顯微鏡下凝集反應(yīng)法:此法與全血平板凝集反應(yīng)檢查相似,只是將血清與抗原各一滴混合于蓋玻片,作成懸滴標本,在鏡下檢查。細菌凝集成團塊的為陽性,而細菌仍均勻分布為陰性。
3.2 試管凝集反應(yīng)法取被檢血清以生理鹽水作不同倍數(shù)的稀釋,加入抗原混合后置于37℃溫箱4h,取出用低速離心沉淀數(shù)分鐘,陽性反應(yīng)時上液透明,陰性的仍為混濁狀。按照這種方法檢查,陽性反應(yīng)豬的凝集價,有的可達1:200以上。有人曾用血清生長凝集試驗診斷急性豬丹毒獲得成功。方法是將病豬耳部或死亡豬只實質(zhì)性臟器接種于馬丁肉湯中,內(nèi)含1:40抗豬丹毒高免血清與1mL有1000U的卡那霉素,36℃培養(yǎng)12h觀察結(jié)果觀察結(jié)果,如系豬丹毒病豬,在試驗管底部可見明顯的凝集反應(yīng)。
3.3 沉淀反應(yīng)這種反應(yīng)用于死豬尸體診斷,其方法與診斷炭疽的沉淀反應(yīng)方法相同。沉淀素血清用兔制造的比一般抗丹毒血清的效力好??乖捎貌∷镭i的疹塊部組織,或肝、脾、腎等臟器加5倍生理鹽水磨成乳劑,煮沸5~10min后用石棉濾過至透明即可。檢驗時,取適量沉淀素血清,裝入小試管中,斜持試管,沿管壁加入抗原,重迭于血清上,經(jīng)15~30min后,如在兩液接觸面上有白環(huán)出現(xiàn)的為陽性反應(yīng)。
3.4 熒光抗體法也可以直接的熒光抗體法鑒別豬丹毒培養(yǎng)物和病理組織切片標本,均能在1~2h內(nèi)做出判定。
10.3969/J.ISSN.1671-6027.2015.12.064