吳立君
(黑龍江職業(yè)學院第二校區(qū),黑龍江哈爾濱 150111)
用ELISA方法檢測豬瘟病毒抗體水平的操作步驟及注意事項
吳立君
(黑龍江職業(yè)學院第二校區(qū),黑龍江哈爾濱 150111)
當前規(guī)?;i場對豬病的診斷越來越依賴于實驗室診斷數(shù)據(jù),對基層畜牧獸醫(yī)實驗室技術(shù)而言,運用ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗)進行檢測疾病的技術(shù)推廣勢在必行。本文以檢測豬瘟抗體水平為例,詳細講解實驗操作流程及北方冬季操作的注意事項,旨在對豬場基層實驗人員有指導意義。
當前規(guī)?;B(yǎng)豬場越來越重視用實驗室診斷數(shù)據(jù)來指導防疫工作,對此實驗室人員及基層防疫人員的實驗技術(shù)直接關(guān)系到豬場的防疫工作的部署,現(xiàn)階段來看,ELISA技術(shù)在基層尚屬難操作實驗,本文就以檢測豬瘟病毒抗體水平為例,詳細講解實驗步驟及北方操作實驗的注意事項,希望對從事檢疫工作的基層實驗人員有所幫助。
檢測豬瘟血清或血漿中特異性抗體,為豬場防疫工作提供依據(jù)。
2.1 試劑愛德士(IDEXX)公司生產(chǎn)豬瘟病毒抗體檢測試劑盒(Classical Swine Fever Virus Antibody Test Kit);去離子水。
2.2 器材單道和8道微量移液器(30~300μL),槍頭,量筒,燒杯,避光蓋板,計時器,加樣槽,EP管架,PE手套、一次性乳膠手套、口罩、帽子、鞋套、防護服,吸水紙。
2.3 設(shè)備自動洗板機,酶標儀,電腦,溫箱,空調(diào)等。
3.1 接收新的豬瘟病毒抗體檢測試劑盒時,檢查內(nèi)容物組分,保質(zhì)期,用標記筆在盒子顯著地方標記開啟時間、每個組分試劑的中文名稱以及每次使用酶標板的數(shù)量。
3.2 操作前將試劑盒組分恢復(fù)室溫18~26℃2h。
3.3 待檢血清混勻,試劑盒內(nèi)組分試劑輕輕渦旋、旋轉(zhuǎn)混勻。
3.4 填寫實驗室操作規(guī)范記錄表。例如:操作人:某某某,操作時間:2015-11-11,試劑盒種類:豬瘟病毒抗體檢測試劑盒。批號:D191,效期:2016-5-31。
3.5 EP管架上留出四孔,余下待檢的血清按照順序豎排擺放。剩余的酶標板卸下,封閉放置與干燥劑一起放入原袋子中。按照血清順序,將豬血樣標號豎排填寫到記錄中。
3.6 用一次性PE手套蓋住加樣槽,將適量的樣品稀釋液倒入加樣槽中。每個孔中用加入50μL樣品稀釋液。注意槍頭勿觸到酶標板底部,加樣槽中余下的試劑切勿倒入瓶中。
3.7 開啟新槍頭盒,每孔加入血清50μL,緩慢吹打3~5次混勻,避免產(chǎn)生氣泡,每加入一孔更換一次槍頭,使之一一對應(yīng)。豎排加樣,順序為先加入陰性血清,2孔,陽性血清,2孔,待檢血清,若干孔。
3.8 用封口膜封閉酶標板,避免液體蒸發(fā),蓋上避光板,在室溫18~26℃孵育2h。(也可采用過夜孵育模式,4℃孵育12~18h)。
3.9 孵育期間,配制1倍洗滌液。計算出本次檢測所需洗滌液用量。例如所需總體積200mL,取10倍濃縮液20mL加入180mL超純水,混勻,備用。
3.10 孵育完畢后,打開避光板,揭開封口膜,握住酶標板框,避免觸到酶標板底部,垂直將液體倒入廢液桶中。采用時手動洗板,將配置好的洗滌液倒入加樣槽中,用多道移液器吸入300?l洗滌液加入每個反應(yīng)孔中,輕輕晃動混勻后,手握酶標板框,垂直棄掉洗液,反復(fù)3次。最后一次棄掉洗液后,用吸水紙上大力扣板,將剩余液體棄掉。在加入酶標抗體之前,避免孔干燥。
3.11 每孔中加入100μL辣根過氧化物酶標記的抗豬瘟病毒的酶標抗體,輕輕晃動混勻,用封口膜蓋上,扣上黑色避光板,室溫孵育30min。
3.12 重復(fù)步驟10。孵育完畢后,打開避光板,揭開封口膜,握住酶標板框,避免觸及酶標板底部,垂直將液體倒入廢液桶中。將配置好的洗滌液倒入加樣槽中,用多道移液器吸入300?l洗滌液加入每個反應(yīng)孔中,輕輕晃動混勻后,手握酶標板框,垂直棄掉洗液,反復(fù)3次。最后一次棄掉洗液后,用吸水紙上大力扣板,將剩余液體棄掉。
3.13 將底物倒入加樣槽,每孔加入100μL底物,蓋上黑色避光板,將酶標板避光放置10min。
3.14 提前開啟酶標儀預(yù)熱,設(shè)置參數(shù)。
3.15 按照加入底物的順序,每孔加入終止液100μL,終止反應(yīng)。
3.16 盡快將反應(yīng)板放入酶標儀中,讀取數(shù)值并命名保存。
3.17 血樣及試劑盒及時放回保存地點。
4.1 將所有樣品試劑視為潛在的生物污染物,操作者帶好手套、口罩、帽子及防護服。
4.2 嚴格控制孵育時間,不可擅自增加或減少。
4.3 及時更換槍頭,避免血樣之間交叉污染,避免試劑交叉污染。
4.4多余的試劑切勿倒回瓶內(nèi)。
4.5 不同批次試劑不可混用。
判定結(jié)果的數(shù)值均在毫厘之間,細節(jié)上的規(guī)范往往是成功與否的關(guān)鍵。進入秋冬季節(jié),我省北方的部分實驗室溫度均低于22℃,操作結(jié)果會出現(xiàn)假陰性或假陽性的情況,及時改善室內(nèi)溫度,打開空調(diào),取暖器等,確保結(jié)果準確。
10.3969/J.ISSN.1671-6027.2015.12.014