遠(yuǎn)程缺血預(yù)處理對(duì)大鼠脊髓缺血再灌注損傷后腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子表達(dá)的影響

仝淞銘，曹 陽，于德水，王巖松，魏子健

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遠(yuǎn)程缺血預(yù)處理對(duì)大鼠脊髓缺血再灌注損傷后腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子表達(dá)的影響

仝淞銘，曹 陽，于德水，王巖松，魏子健

目的 研究遠(yuǎn)程缺血預(yù)處理(RIPC)對(duì)大鼠脊髓缺血再灌注損傷(SCII)后腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)表達(dá)的影響。方法 2014年5—11月，將88只雄性SD大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組(Sham組，n=8)、缺血再灌注組(I/R組，n=40)和RIPC組(n=40)。I/R組及RIPC組分別設(shè)再灌注0、6、12、24、72 h 5個(gè)觀察時(shí)間點(diǎn)(分別記為1a組～1e組、2a組～2e組)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)8只大鼠。Sham組大鼠只分離腎動(dòng)脈下腹主動(dòng)脈，但不阻斷；I/R組大鼠采用Zivin法建立SCII模型；RIPC組大鼠雙下肢用驅(qū)血帶短暫缺血10 min，放開10 min，重復(fù)2次，30 min后用Zivin法建立SCII模型。取材，蘇木素-伊紅(HE)染色觀察脊髓病理變化，免疫組化法檢測BDNF陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)，原位細(xì)胞凋亡(TUNEL)法檢測細(xì)胞凋亡情況，Western blotting法檢測BDNF表達(dá)水平，并進(jìn)行大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能(BBB)評(píng)分。結(jié)果 Sham組脊髓未見明顯病理學(xué)改變，I/R組脊髓病理學(xué)改變明顯，RIPC組各時(shí)間點(diǎn)脊髓病理學(xué)改變均較I/R組輕。1a組～1e組、2a組～2e組BDNF陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)、BDNF表達(dá)水平均高于Sham組(P<0.05)；1a組～1e組、2a組～2e組BBB評(píng)分均低于Sham組(P<0.05)；1a組～1e組、2b組～2e組TUNEL陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)均高于Sham組(P<0.05)；2b組～2e組BDNF陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)分別高于1b組～1e組(P<0.05)；2a組～2e組BDNF表達(dá)水平、BBB評(píng)分分別高于1a組～1e組(P<0.05)；2a組～2e組TUNEL陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)分別低于1a組～1e組(P<0.05)；1b組～1e組BDNF陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)、TUNEL陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)、BDNF表達(dá)水平、BBB評(píng)分均高于1a組(P<0.05)；2b組～2e組BDNF陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)、TUNEL陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)、BDNF表達(dá)水平、BBB評(píng)分均高于2a組(P<0.05)。結(jié)論 RIPC可增加大鼠SCII后BDNF的表達(dá)水平，并可能通過增加BDNF的表達(dá)水平來達(dá)到脊髓保護(hù)作用。

再灌注損傷；缺血預(yù)處理；腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子；細(xì)胞凋亡

仝淞銘，曹陽，于德水，等.遠(yuǎn)程缺血預(yù)處理對(duì)大鼠脊髓缺血再灌注損傷后腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子表達(dá)的影響[J].中國全科醫(yī)學(xué)，2015，18(21)：2548-2554.[www.chinagp.net]

Tong SM,Cao Y,Yu DS,et al.Effect of remote ischemic preconditioning on the expression of brain-derived neurotrophic factor in rats with spinal cord ischemia-reperfusion injury[J].Chinese General Practice，2015，18(21)：2548-2554.

Przyklenk等[1]最先提出遠(yuǎn)程缺血預(yù)處理(remote ischemic preconditioning，RIPC)的概念，這種預(yù)處理方法被證實(shí)可有效減輕腦、脊髓、肝臟及腎臟的缺血再灌注損傷，但RIPC減輕脊髓損傷的具體機(jī)制尚不十分明確。大量研究表明，RIPC主要通過維持和改善能量代謝、改善微循環(huán)、減少自由基產(chǎn)生、抑制炎性因子的激活、抑制細(xì)胞凋亡、增強(qiáng)自噬、誘導(dǎo)內(nèi)源性保護(hù)物質(zhì)的釋放等對(duì)遠(yuǎn)隔器官起保護(hù)作用[2-5]。腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)作為神經(jīng)營養(yǎng)因子家族成員的一種，廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中對(duì)神經(jīng)元的生長、分化和維持其正常的生理功能起關(guān)鍵作用[6]。本實(shí)驗(yàn)通過觀察RIPC對(duì)大鼠脊髓缺血再灌注損傷(spinal cord ischemia-reperfusion injury，SCII)后BDNF表達(dá)水平的影響，研究其脊髓保護(hù)的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 健康成年雄性SD大鼠88只，體質(zhì)量(250±20)g，由遼寧醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。兔抗鼠BDNF抗體購自Santa Cruze公司(美國)，山羊抗兔IgG二抗、PV9001通用型Polymer Kit試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，原位細(xì)胞凋亡(TUNEL)試劑盒購自Roche公司(美國)，電子顯微鏡購自O(shè)lympus(日本)，切片機(jī)購自Leica(德國)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 2014年5—11月，將雄性SD大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組(Sham組，n=8)、缺血再灌注組(I/R組，n=40)和RIPC組(n=40)。I/R組及RIPC組分別設(shè)再灌注0、6、12、24、72 h 5個(gè)

本研究創(chuàng)新點(diǎn)：

目前關(guān)于腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)的研究主要著重于腦組織，但其在脊髓組織內(nèi)也有表達(dá)。本文通過脊髓缺血再灌注損傷模型來觀察BDNF的變化，同時(shí)研究在遠(yuǎn)程缺血預(yù)處理情況下BDNF的表達(dá)情況。關(guān)于遠(yuǎn)程缺血預(yù)處理的保護(hù)作用機(jī)制的研究很多，但其保護(hù)作用的具體機(jī)制尚不十分明確，本文通過將BDNF表達(dá)及細(xì)胞凋亡情況聯(lián)系起來來研究其可能的具體機(jī)制。

觀察時(shí)間點(diǎn)(分別記為1a組～1e組、2a組～2e組)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)8只大鼠。本研究由遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院倫理委員會(huì)審核通過。

1.2.2 模型制備 所有大鼠術(shù)前12 h禁食水，10%水合氯醛(40 mg/kg)腹腔注射麻醉，仰臥，腹部皮膚剪毛后消毒。I/R組大鼠采用Zivin法[7]建立SCII模型：大鼠無菌條件下行腹部旁正中切口，暴露腹主動(dòng)脈，于左腎動(dòng)脈分叉下方約0.5 cm處放置動(dòng)脈夾夾閉腹主動(dòng)脈，夾閉30 min后取出動(dòng)脈夾，腹腔臟器復(fù)位，逐層縫合，分籠飼養(yǎng)。Sham組只開腹并暴露腹主動(dòng)脈，不夾閉，30 min后關(guān)腹，待大鼠清醒后處死。RIPC組大鼠用寬10 mm的橡皮驅(qū)血帶在大腿根部拉緊，采用多普勒血流探測儀監(jiān)測下肢動(dòng)脈血流中段，阻斷下肢血流10 min，恢復(fù)血流10 min，重復(fù)2次，30 min后用Zivin法[7]制作大鼠SCII模型。

1.2.3 取材 分別隨機(jī)取出各組大鼠4只，麻醉滿意后固定于手術(shù)臺(tái)上，開胸暴露心臟，經(jīng)左心室插管至升主動(dòng)脈，剪開右心耳，用灌注泵灌入4 ℃ 0.9%氯化鈉溶液250 ml，待流出液清亮后，再灌入4 ℃ 4%多聚甲醛300 ml。取出L2～L5節(jié)段脊髓組織，剝?nèi)ゼ顾枭窠?jīng)及大部脊膜，于4%多聚甲醛中固定，后進(jìn)行石蠟包埋，切片機(jī)切片，厚度5 μm。

1.2.4 蘇木素-伊紅(HE)染色 60 ℃烤片0.5 h，二甲苯、梯度乙醇脫蠟，蒸餾水沖洗，蘇木素染色5 min，流水稍洗去蘇木素后1%鹽酸乙醇浸泡3 s，流水沖洗30 min，伊紅液染色1 min，蒸餾水稍洗后梯度乙醇、二甲苯脫水，中性樹膠封固。電子顯微鏡下觀察脊髓組織學(xué)形態(tài)，并在高倍鏡下(×400)隨機(jī)選取4個(gè)節(jié)段脊髓前角不同部位進(jìn)行拍攝。

1.2.5 免疫組化法檢測BDNF陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù) 按照PV9001通用型Polymer Kit試劑盒說明書進(jìn)行免疫組化染色，兔抗鼠BDNF抗體工作濃度1∶50，DAB顯色，復(fù)染、脫水、透明、封固。采用電子顯微鏡觀察切片并在高倍鏡下(×400)隨機(jī)選取4個(gè)節(jié)段脊髓前角不同部位6個(gè)視野進(jìn)行拍攝，記錄BDNF陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)。

1.2.6 TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡情況 石蠟切片常規(guī)脫蠟，3%過氧化氫去離子水孵育，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗5 min，洗滌3次，蛋白酶K消化，PBS沖洗，加50 μl TUNEL反應(yīng)混合液(Sham組僅加50 μl 熒光素標(biāo)記的脫氧尿嘧啶核苷三磷酸液)于標(biāo)本上，在4 ℃濕盒中反應(yīng)24 h。PBS沖洗，加50 μl轉(zhuǎn)化劑過氧化物酶(POD)于標(biāo)本上，于37 ℃恒溫箱中反應(yīng)30 min；PBS沖洗，在組織處加DAB，室溫反應(yīng)10 min；PBS沖洗，蘇木素染色、梯度乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封固。在高倍鏡下(×400)隨機(jī)選取4個(gè)不同節(jié)段脊髓不同部位6個(gè)視野，用Image Pro Plus 6.0軟件記錄TUNEL陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)。

1.2.7 Western blotting法檢測BDNF表達(dá)水平 分別取出各組剩余的4只大鼠，麻醉滿意后，用同樣方法迅速取出L2～L5節(jié)段脊髓組織，-80 ℃凍存。取長約5 mm的脊髓節(jié)段，冰上裂解、勻漿，紫外分光光度儀測定BDNF表達(dá)水平，調(diào)節(jié)各組蛋白水平一致，沸水煮5 min。取等量BDNF樣品，10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離，采用半干法將蛋白條帶轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，1% 牛血清清蛋白(BSA)封閉1 h，兔抗鼠BDNF抗體(1∶1 000)搖床上4 ℃孵育過夜，三羥甲基氨基甲烷緩沖溶液(TBST)漂洗5 min，洗滌3次，山羊抗兔IgG二抗(1∶1 000)，室溫?fù)u床上孵育1 h，TBST漂洗，化學(xué)發(fā)光試劑(ECL)發(fā)光，顯影。以β-actin條帶為內(nèi)參照，用BDNF吸光度值(optical density，OD值)與β-actin OD值的比值表示相對(duì)蛋白表達(dá)水平。

1.2.8 大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能(BBB)評(píng)分 由2名不了解實(shí)驗(yàn)分組的觀察者采用Basso等[8]提出的BBB評(píng)分體系分別于再灌注0、6、12、24、72 h對(duì)所有大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分，包括0～21級(jí)，神經(jīng)功能完全缺失為0分，神經(jīng)功能完全正常為21分。

2 結(jié)果

2.1 HE染色結(jié)果 Sham組脊髓可見形態(tài)正常的神經(jīng)元，核仁居中、清晰，可見尼氏體。1a組神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞輕微增大，神經(jīng)元間隙稍增寬，脊髓呈病理學(xué)改變。1b組神經(jīng)元輕微增大，神經(jīng)元間隙增寬，部分神經(jīng)元胞核固縮。1c組神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞增大，神經(jīng)元間隙增寬，神經(jīng)元胞核固縮，部分裂解。1d組正常神經(jīng)元數(shù)量減少，神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞腫大，核固縮、偏位，部分核裂解，偶可見空泡樣變性。1e組正常神經(jīng)元數(shù)量明顯減少，神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞腫大，核固縮、偏位，部分核裂解，神經(jīng)元間隙增大，周圍有空泡形成，脊髓病理學(xué)改變加重。2b組～2e組脊髓病理改變較1b組～1e組稍輕，正常神經(jīng)元較多，偶可見神經(jīng)元胞質(zhì)空泡樣變性(見圖1)。

2.2 BDNF陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)比較 BDNF陽性表達(dá)神經(jīng)元胞質(zhì)呈棕褐色，細(xì)胞為圓形、橢圓形或三角形，分布于脊髓灰質(zhì)，陽性小膠質(zhì)細(xì)胞散在分布于脊髓灰質(zhì)和白質(zhì)。Sham組僅在脊髓前角見BDNF陽性表達(dá)細(xì)胞散在分布，稀疏且胞質(zhì)染色較淺。I/R組、RIPC組BDNF陽性表達(dá)細(xì)胞主要分布于脊髓前角和中央帶(見圖2)。各組間BDNF陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=968.456，P<0.05)。1a組～1e組、2a組～2e組BDNF陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)均高于Sham組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；2b組～2e組BDNF陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)分別高于1b組～1e組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；1b組～1e組BDNF陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)均高于1a組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；2b組～2e組BDNF陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)均高于2a組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見表1)。

2.3 細(xì)胞凋亡情況比較 TUNEL陽性表達(dá)細(xì)胞胞核呈深染棕褐色。Sham組脊髓前角偶見凋亡神經(jīng)元，脊髓灰質(zhì)、白質(zhì)散在分布凋亡神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。I/R組、RIPC組TUNEL陽性表達(dá)細(xì)胞主要分布于脊髓前角及中央帶(見圖3)。各組間TUNEL陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。1a組～1e組、2b組～2e組TUNEL陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)均高于Sham組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；2a組～2e組TUNEL陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)分別低于1a組～1e組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；1b組～1e組TUNEL陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)均高于1a組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；2b組～2e組TUNEL陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)均高于2a組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見表2)。

2.4 BDNF表達(dá)水平比較 在25 KDa、43 KDa分子量處分別可見BDNF、β-actin特異性條帶(見圖4)。各組間BDNF表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=968.456，P<0.05)。1a組～1e組、2a組～2e組BDNF表達(dá)水平均高于Sham組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；2a組～2e組BDNF表達(dá)水平分別高于1a組～1e組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；1b組～1e組BDNF表達(dá)水平均高于1a組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；2b組～2e組BDNF表達(dá)水平均高于2a組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見圖5)。

注：A為Sham組脊髓神經(jīng)元核仁居中、清晰，可見尼氏體；B為1e組脊髓神經(jīng)元腫大，核固縮、偏位，部分核裂解；C為2e組正常脊髓神經(jīng)元增多，偶可見脊髓神經(jīng)元胞質(zhì)空泡樣變性

圖1 各組大鼠脊髓切片光鏡下表現(xiàn)(HE染色，×100)

Figure 1 Manifestation of the spinal cord slice of each group under light microscope

注：箭頭為腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)陽性表達(dá)細(xì)胞；A為Sham組部分神經(jīng)元胞質(zhì)呈淺棕褐色；B為1a組出現(xiàn)BDNF陽性表達(dá)細(xì)胞增多；C為1e組 BDNF陽性表達(dá)細(xì)胞顯著增多，胞質(zhì)著色深；D為2e組 BDNF陽性表達(dá)細(xì)胞較1e組多，且胞質(zhì)著色更深

圖2 各組大鼠脊髓組織BDNF陽性表達(dá)細(xì)胞(免疫組化法，×400)

Figure 2 BDNF positive cells of rat spinal cord of each group

注：A為Sham組偶可見原位細(xì)胞凋亡(TUNEL)陽性表達(dá)細(xì)胞；B為1e組細(xì)胞核固縮、深染，呈棕褐色，TUNEL陽性表達(dá)細(xì)胞顯著增多，達(dá)高峰；C為2e組TUNEL陽性表達(dá)細(xì)胞較1e組少

圖3 各組大鼠脊髓組織TUNEL陽性表達(dá)細(xì)胞(TUNEL染色，×400)

Figure 3 TUNEL positive cells of rat spinal cord of each groups

Table 1 Comparison of the number of BDNF positive cells among all the groups

組別BDNF陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)Sham組4.3±0.61a組6.1±0.6a1b組7.2±0.8ac1c組9.1±1.0ac1d組10.7±1.3ac1e組13.5±1.6ac2a組6.7±0.8a2b組9.1±1.1abd2c組10.4±1.5abd2d組13.6±1.5abd2e組14.9±1.6abdF值303.579P值<0.001

注：Sham組=假手術(shù)組，1a組～1e組=缺血再灌注組再灌注0、6、12、24、72 h 5個(gè)觀察時(shí)間點(diǎn)，2a組～2e組=遠(yuǎn)程缺血預(yù)處理組再灌注0、6、12、24、72 h 5個(gè)觀察時(shí)間點(diǎn),BDNF=腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子；與Sham組比較，aP<0.05；與同一時(shí)間點(diǎn)I/R組比較，bP<0.05；與1a組比較，cP<0.05;與2a組比較，dP<0.05

Table 2 Comparison of the number of TUNEL positive cells among all the groups

組別TUNEL陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)Sham組9.1±1.51a組12.0±2.3a1b組13.7±1.5ac1c組15.5±1.6ac1d組19.3±2.1ac1e組22.3±2.1ac2a組9.5±1.6b2b組11.3±1.7abd2c組13.1±2.0abd2d組14.9±1.9abd2e組16.7±1.9abdF值97.322P值<0.001

注：TUNEL=原位細(xì)胞凋亡；與Sham組比較，aP<0.05；與同一時(shí)間點(diǎn)I/R組比較，bP<0.05；與1a組比較，cP<0.05;2a組比較，dP<0.05

2.5 各組BBB評(píng)分比較 各組間BBB評(píng)分比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1 978.093，P<0.001)。1a組～1e組、2a組～2e組BBB評(píng)分均低于Sham組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；2a組～2e組BBB評(píng)分分別高于1a組～1e組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；1b組～

1e組BBB評(píng)分均高于1a組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；2b組～2e組BBB評(píng)分均高于2a組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見圖6)。

注：BDNF=腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子

圖4 Western blotting法檢測BDNF表達(dá)水平

Figure 4 BDNF expression level detected by Western blotting method

注：與Sham組比較，aP<0.05；與同一時(shí)間點(diǎn)I/R組比較，bP<0.05；與1a組比較，cP<0.05;2a組比較，dP<0.05

圖5 各組大鼠BDNF表達(dá)水平比較

Figure 5 Comparison of BDNF expression level among all the groups

注：BBB=后肢運(yùn)動(dòng)功能；與Sham組比較，aP<0.05；與同一時(shí)間點(diǎn)I/R組比較，bP<0.05；與1a組比較，cP<0.05;與2a組比較，dP<0.05

圖6 各組大鼠BBB評(píng)分比較

Figure 6 Comparison of BBB score among all the groups

3 討論

SCII是指損傷脊髓在恢復(fù)血流供應(yīng)后，原有損傷進(jìn)行性加重，造成神經(jīng)元損傷、脊髓神經(jīng)功能喪失的現(xiàn)象。提高脊髓缺血耐受能力的方法主要有：體外轉(zhuǎn)流或分流術(shù)、腦脊液引流術(shù)、藥物治療及亞低溫處理等[9-12]，RIPC同樣對(duì)SCII有保護(hù)作用[13]。有文獻(xiàn)指出，RIPC時(shí)間小于5 min或者超過15 min均不能對(duì)遠(yuǎn)隔器官起保護(hù)作用[14-15]，本實(shí)驗(yàn)在RIPC組選用文獻(xiàn)中較常用的方法[16]，雙下肢用驅(qū)血帶扎緊，采用多普勒血流探測儀監(jiān)測下肢動(dòng)脈血流中段，阻斷下肢血流10 min，恢復(fù)血流10 min，重復(fù)操作2次，30 min后再行缺血再灌注實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)采用HE染色方法觀察脊髓病理學(xué)變化情況，結(jié)果顯示，RIPC組脊髓損傷程度較I/R組輕，說明RIPC可減輕SCII后脊髓的病理變化過程。

BDNF廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，是脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元一個(gè)重要的生存因子[17-18]。在腦缺血中，其通過穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度、減輕自由基損傷、抗細(xì)胞凋亡、增強(qiáng)蛋白激酶活性等作用延緩神經(jīng)元壞死和凋亡，從而對(duì)神經(jīng)元起保護(hù)作用[19]。Ziemlińska等[20]在脊髓橫斷大鼠中發(fā)現(xiàn)，BDNF的過表達(dá)可通過增加谷氨酸能和氨基丁酸能的神經(jīng)傳遞而增強(qiáng)早期運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)。Ikeda等[21]發(fā)現(xiàn)，鞘內(nèi)注射BDNF可通過提高脊髓損傷后銅/鋅超氧化物歧化酶和髓鞘堿性蛋白在神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中的活性從而對(duì)神經(jīng)功能恢復(fù)起積極作用。本研究免疫組化結(jié)果顯示，Sham組僅在脊髓前角見BDNF陽性表達(dá)細(xì)胞散在分布，稀疏且胞質(zhì)染色較淺；I/R組、RIPC組BDNF陽性表達(dá)細(xì)胞主要分布于脊髓前角和中央帶；1a組～1e組、2a組～2e組BDNF陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)均高于Sham組；2b組～2e組BDNF陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)分別高于1b組～1e組；1b組～1e組BDNF陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)均高于1a組；2b組～2e組BDNF陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)均高于2a組。說明RIPC可誘導(dǎo)神經(jīng)元釋放內(nèi)源性BDNF。有文獻(xiàn)報(bào)道，BDNF主要通過與受體酪氨酸激酶B(TrkB)結(jié)合，激活Ras蛋白-有絲分裂原激活蛋白激酶(Ras-MAPK)通路，增加BDNF基因及抗凋亡蛋白基因B淋巴細(xì)胞瘤2(BCL-2)基因的表達(dá)，促進(jìn)神經(jīng)元存活及神經(jīng)生長，增加突觸可塑性[22]。楊成偉等[23]認(rèn)為，RIPC可抑制兔SCII過程中凋亡信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1(ASK1)介導(dǎo)的脊髓神經(jīng)元凋亡。本研究結(jié)果顯示，1a組～1e組、2b組～2e組TUNEL陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)均高于Sham組；2a組～2e組TUNEL陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)分別低于1a組～1e組；1b組～1e組TUNEL陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)均高于1a組；2b組～2e組TUNEL陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)均高于2a組。表明細(xì)胞凋亡在SCII后神經(jīng)元丟失過程中發(fā)揮重要作用，RIPC可減輕SCII后神經(jīng)元凋亡，從而起到一定程度的保護(hù)作用。本研究采用Western blotting法檢測BDNF表達(dá)情況，結(jié)果顯示，在25 KDa分子量處見BDNF特異性條帶，1a組～1e組、2a組～2e組BDNF表達(dá)水平均高于Sham組；2a組～2e組BDNF表達(dá)水平分別高于1a組～1e組；1b組～1e組BDNF表達(dá)水平均高于1a組；2b組～2e組BDNF表達(dá)水平均高于2a組，提示RIPC可誘導(dǎo)SCII后BDNF表達(dá)水平增高。本研究結(jié)果顯示，1a組～1e組、2a組～2e組BBB評(píng)分均低于Sham組，2a組～2e組BBB評(píng)分分別高于1a組～1e組，說明大鼠SCII后發(fā)生了比較明顯的神經(jīng)功能障礙，而且RIPC可減輕SCII后神經(jīng)功能障礙，有利于運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)。

總之，RIPC可使SCII后BDNF表達(dá)水平升高，且RIPC對(duì)SCII具有保護(hù)作用，其可能通過激活內(nèi)源性BDNF表達(dá)水平增加從而抑制神經(jīng)元凋亡來發(fā)揮保護(hù)作用。本研究主要在動(dòng)物模型上對(duì)BDNF進(jìn)行研究，BDNF基因的表達(dá)變化有待進(jìn)一步研究，同時(shí)本實(shí)驗(yàn)可為SCII的治療提供新的治療思路，然而BDNF在其中發(fā)揮作用的具體靶點(diǎn)及作用通路尚不十分明確，還需要進(jìn)一步深入研究。

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(本文編輯：崔麗紅)

Effect of Remote Ischemic Preconditioning on the Expression of Brain-derived Neurotrophic Factor in Rats With Spinal Cord Ischemia-reperfusion Injury

TONGSong-ming,CAOYang,YUDe-shui,etal.

DepartmentofOrthopedics,theFirstAffiliatedHospitalofLiaoningMedicalUniversity,Jinzhou121001,China

Objective To investigate the effect of remote ischemic preconditioning(RIPC) on the expression of brain-derived neurotrophic factor(BDNF) in rats with spinal cord ischemia-reperfusion injury(SCII).Methods From May to November in 2014,using random number table,88 male Sprague Dawleys rats were randomly divided into three groups:the Sham group(n=8),the ischemia-reperfusion group(I/R group,n=40) and the remote ischemic preconditioning group(RIPC group,n=40).For I/R group and RIPC group,5 observation time points were set,including 0,6,12,24 and 72 hours after reperfusion(designated as group 1a -1e for I/R group and group 2a-2e for RIPC group),8 rats at each time point.For the rats in Sham group,only abdominal aorta below renal artery was isolated but without blocking;SCII model was built for the rats in I/R group by using Zivin method;for the rats in RIPC group,the lower limb blood flow was blocked with a tourniquet for 10 min and then was loosen for 10 min for reperfusion,which was done twice,and then SCII model was built using Zivin method 30 minutes later.Spinal cord was sampled from the rats.HE staining was used to observe pathological changes,the number of BDNF positive cells were detected by immunohistochemistry test,the cell apoptosis were assessed by TUNEL staining,Western blotting method was employed to detect the protein expression level of BDNF,and the BBB scores of the rats were evaluated.Results No evident pathological changes were noted in Sham group,while pathological changes were evident in I/R group,and the pathological changes in RIPC group were slighter than I/R group at five time points.Group 1a-1e and group 2a-2e were higher(P<0.05) than Sham group in the number of BDNF positive cells,the protein expression level of BDNF;group 1a-1e and group 2a-2e were lower(P<0.05) than Sham group in BBB score;group 1a-1e and group 2b-2e were higher(P<0.05) than Sham group in the number of TUNEL positive cells;group 2b-2e were higher(P<0.05) than group 1b-1e in the number of BDNF positive cells;group 2a-2e were higher(P<0.05) than group 1a-1e in the protein expression level of BDNF and BBB score;group 2a-2e were lower(P<0.05) than group 1a-1e in the number of TUNEL positive cells,group 1b-1e were higher(P<0.05) than group 1a in the number of BDNF positive cells,the number of TUNEL positive cells,the protein expression level of BDNF and BBB score;group 2b-2e were higher(P<0.05) than group 2a in the number of BDNF positive cells,the number of TUNEL positive cells,the protein expression level of BDNF and BBB score.Conclusion Remote ischemic preconditioning can increase the expression of BDNF in rats with spinal cord ischemia-reperfusion injury,and it may play a protective role through increasing the expression of BDNF.

Reperfusion injury;Ischemic preconditioning;Brain-derived neurotrophic factor;Apoptosis

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81471853)；遼寧省博士啟動(dòng)基金資助項(xiàng)目(20121096)；遼寧醫(yī)學(xué)院校長基金-奧鴻博澤研究生科研創(chuàng)新基金資助項(xiàng)目(AH2014019)

121001 遼寧省錦州市，遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院骨科

曹陽，121001 遼寧省錦州市，遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院骨科；E-mail：cyangfsyy@163.com

于德水，121001 遼寧省錦州市，遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院骨科；E-mail：ydsfsyy@163.com

R 651.21

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2015.21.012

2015-04-13；

2015-05-12)