硫化氫對高脂誘導(dǎo)的非酒精性脂肪性肝炎大鼠肝臟炎性反應(yīng)的作用

王 麗，王蘭輝，孟翠巧，李立萍，宋廣昊，任路平，李國風(fēng)

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·論著·

硫化氫對高脂誘導(dǎo)的非酒精性脂肪性肝炎大鼠肝臟炎性反應(yīng)的作用

王 麗，王蘭輝，孟翠巧，李立萍，宋廣昊，任路平，李國風(fēng)

目的 觀察硫化氫(H2S)對非酒精性脂肪性肝炎(NASH)大鼠炎性因子水平的影響，探討H2S防治NASH的可能機(jī)制。方法 2013年1月—2014年7月選用SPF級雄性SD大鼠60只，按照隨機(jī)數(shù)字表法分為對照組、NASH模型組、硫氫化鈉(NaHS)干預(yù)組，各20只。對照組給予普通飼料，NASH模型組給予高脂飼料，NaHS干預(yù)組給予高脂飼料的同時腹腔注射H2S供體NaHS(56 mg·kg-1·d-1)，對照組和NASH模型組每日腹腔注射等量0.9%氯化鈉溶液。8周后處死所有大鼠，留取靜脈血及肝臟組織。檢測血清及肝臟生化指標(biāo)〔血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)﹑天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)及肝臟組織TG、TC〕﹑血漿及肝臟組織H2S水平、肝臟組織氧化應(yīng)激指標(biāo)〔丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)〕；HE染色觀察肝臟組織病理學(xué)變化；檢測肝臟組織腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白介素6(IL-6) mRNA表達(dá)水平及肝臟組織TNF-α、IL-6、核因子κB抑制因子α(IκBα)、核因子κB p65(NF-κB p65)表達(dá)水平。結(jié)果 NASH模型組和NaHS干預(yù)組血清ALT、AST、TG、TC水平及肝臟組織TG、TC水平均高于對照組，且NaHS干預(yù)組以上指標(biāo)均低于NASH模型組(P<0.05)。NASH模型組血漿H2S水平和肝臟組織H2S水平均低于對照組及NaHS干預(yù)組(P<0.05)。與對照組比較，NASH模型組和NaHS干預(yù)組肝臟組織MDA水平升高，SOD水平降低(P<0.05)；與NASH模型組比較，NaHS干預(yù)組MDA水平降低，SOD水平升高(P<0.05)。與對照組比較，NASH模型組肝臟組織結(jié)構(gòu)紊亂，呈彌漫性脂肪變性、肝細(xì)胞灶性壞死，并可見淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞浸潤；NaHS干預(yù)組肝臟組織脂肪變性、壞死及炎性反應(yīng)程度較NASH模型組明顯減輕。NASH模型組和NaHS干預(yù)組肝臟組織TNF-α、IL-6 mRNA表達(dá)水平和TNF-α、IL-6表達(dá)水平均高于對照組，且NASH模型組以上指標(biāo)均高于NaHS干預(yù)組(P<0.05)。與對照組比較，NASH模型組和NaHS干預(yù)組細(xì)胞質(zhì)IκBα表達(dá)水平均降低，細(xì)胞核NF-κB p65表達(dá)水平均升高(P<0.05)；與NASH模型組比較，NaHS干預(yù)組細(xì)胞質(zhì)IκBα表達(dá)水平升高，細(xì)胞核NF-κB p65表達(dá)水平降低(P<0.05)。結(jié)論 H2S能夠有效改善NASH大鼠肝臟組織病理變化，并抑制炎性反應(yīng)，這可能是H2S發(fā)揮治療作用的機(jī)制之一。

硫化氫；肝炎；炎性反應(yīng)；大鼠

王麗，王蘭輝，孟翠巧，等.硫化氫對高脂誘導(dǎo)的非酒精性脂肪性肝炎大鼠肝臟炎性反應(yīng)的作用[J].中國全科醫(yī)學(xué)，2015，18(21)：2542-2547.[www.chinagp.net]

Wang L,Wang LH,Meng CQ,et al.Impacts of hydrogen sulfide on inflammatory reaction in high-fat diet-induced nonalcoholic steatosishepatitis rats[J].Chinese General Practice，2015，18(21)：2542-2547.

非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatosishepatitis，NASH)是由非酒精性單純性脂肪肝演變而來的以彌漫性肝細(xì)胞變性、壞死及纖維化為病理特征的代謝應(yīng)激性疾病，是非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)的一種病理類型[1]。隨著生活、飲食習(xí)慣的改變以及高脂血癥、肥胖、2型糖尿病發(fā)病率的升高，我國NASH患病人數(shù)逐年增多，NASH已經(jīng)成為危害人類健康的第二大肝病，易發(fā)展為肝硬化和肝癌，預(yù)后不良[2]。目前認(rèn)為NASH的發(fā)病機(jī)制與胰島素抵抗、氧化應(yīng)激、脂質(zhì)代謝紊亂及炎性反應(yīng)等密切相關(guān)，其中炎性反應(yīng)是NASH進(jìn)展過程中的重要限速環(huán)節(jié)，有關(guān)炎性因子在NASH發(fā)病中的作用是近年來研究的熱點(diǎn)[3]。內(nèi)源性硫化氫(H2S)是一種新型氣體信號分子，在呼吸系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)等發(fā)揮重要的生理和病理作用[4-5]?；A(chǔ)和臨床研究證實(shí)，血漿及肝臟組織H2S水平與NAFLD脂肪肝程度呈負(fù)相關(guān)，提示H2S可能在NAFLD的發(fā)病過程中發(fā)揮一定作用[6]。本研究采用高脂飲食誘導(dǎo)NASH大鼠模型，通過H2S供體硫氫化鈉(NaHS)進(jìn)行干預(yù)，以腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白介素6(IL-6)為檢測

本研究背景：

已有研究表明，在肝臟缺血再灌注損傷中硫化氫(H2S)起到抗感染和細(xì)胞保護(hù)作用；在對乙酰氨基酚誘導(dǎo)的肝臟毒性損傷中H2S起到保護(hù)作用；另外還發(fā)現(xiàn)H2S可以減輕四氯化碳誘導(dǎo)的肝臟毒性損傷，緩解肝硬化和門靜脈高壓。但H2S與非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的關(guān)系尚未明確。本研究通過給予外源性H2S進(jìn)行治療，闡明H2S在大鼠NASH發(fā)病過程中的作用，同時為NASH的藥物研究提供基礎(chǔ)，并提示通過H2S來防治NASH可能是未來研究的方向。

指標(biāo)，旨在探討H2S對NASH大鼠肝臟的保護(hù)作用及其可能機(jī)制，從而為疾病治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 健康雄性SPF級SD大鼠60只，體質(zhì)量(150±10)g，由中科院上海實(shí)驗(yàn)動物中心提供。普通飼料和高脂飼料購自上海前塵生物科技有限公司。NaHS、Access RT-PCR Introductory System、M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶購自美國Promega公司。丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、三酰甘油(TG)﹑總膽固醇(TC)﹑丙二醛(MDA)﹑超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒購自南京建成生物工程研究所。BCA法蛋白定量試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司。TNF-α、IL-6、核因子κB抑制因子α(IκBα)、核因子κB p65(NF-κB p65)、β肌動蛋白(β-actin)多抗購自美國Santa Cruz公司。紫外分光光度計購自美國UNICO公司。

1.2 方法

1.2.1 分組、造模及給藥 2013年1月—2014年7月，60只SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)2周后，按照隨機(jī)數(shù)字表法分為對照組、NASH模型組、NaHS干預(yù)組，各20只。對照組給予普通飼料，NASH模型組給予高脂飼料，NaHS干預(yù)組給予高脂飼料的同時腹腔注射H2S供體NaHS(56 mg·kg-1·d-1)，對照組和NASH模型組每日腹腔注射等量0.9%氯化鈉溶液，連續(xù)8周，期間所有大鼠自由飲水。末次給藥后禁食8 h，3%戊巴比妥鈉(0.1 ml/100 g)腹腔麻醉后處死所有大鼠，留取靜脈血及肝臟組織。本研究經(jīng)河北省人民醫(yī)院倫理委員會論證通過。

1.2.2 血清及肝臟組織生化指標(biāo)檢測 大鼠處死后立即腹主動脈取血10 ml，靜置30 min，3 000 r/min離心10 min(離心半徑為13.5 cm)，分離血清凍于-80 ℃待測，并留取肝臟組織標(biāo)本。采用相應(yīng)試劑盒測定血清ALT、AST、TG、TC水平，肝臟組織TG、TC水平。

1.2.3 血漿及肝臟組織H2S水平檢測 大鼠處死后取血漿樣本100 μl，加入5%醋酸鋅100 μl，混勻后依次加入0.5 ml對氨基二甲基苯胺鹽酸鹽(20 mmol/L)和0.5 ml三氯醋酸(30 mmol/L)，最后加入2.5 ml去離子水補(bǔ)足體積至5 ml，渦旋充分混勻。4 ℃ 6 000 r/min離心5 min(離心半徑為13.5 cm)，取上清液于比色皿中，利用紫外分光光度計于670 nm處檢測吸光度。根據(jù)制定好的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算血漿H2S水平。

取100 mg液氮冰凍肝組織，加入預(yù)先配制好的反應(yīng)體系中(由100 mmol/L pH 7.4的磷酸鉀緩沖液、10 mmol/L的L-半胱氨酸、2 mmol/L的5′-磷酸吡哆醛組成)，進(jìn)行組織勻漿；置入37 ℃溫箱15 min。將反應(yīng)液移至反應(yīng)瓶，吸取5%醋酸鋅100 μl加入中央室。使用氮?dú)廨p微吹20 s左右，雙層封口，在37 ℃水浴鍋中震蕩反應(yīng)90 min，之后加入0.5 ml三氯醋酸(體積濃度50%)終止反應(yīng)。37 ℃水浴鍋中震蕩60 min使H2S完全吸收，將中央室中的液體轉(zhuǎn)移至含有3.5 ml去離子水的試管中，另設(shè)一只含3.5 ml去離子水的試管作為空白管，立即加入0.5 ml對氨基二甲基苯胺鹽酸鹽(20 mmol/L)和50 μl FeCl3(30 mmol/L)，室溫下靜置20 min，以達(dá)到充分顯色的目的。利用紫外分光光度計于670 nm處檢測吸光度。根據(jù)制定好的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算肝臟組織H2S水平。

1.2.4 肝臟組織氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測 參照說明書，采用試劑盒檢測肝臟組織MDA、SOD水平。

1.2.5 肝臟組織病理檢測 將肝臟組織病理切片進(jìn)行常規(guī)HE染色，光鏡下觀察肝細(xì)胞脂肪變性、壞死及炎性活動程度。

1.2.6 TNF-α、IL-6 mRNA表達(dá)水平檢測 采用熒光定量PCR法檢測TNF-α、IL-6 mRNA表達(dá)水平。針對GenBank中大鼠TNF-α、IL-6 mRNA序列設(shè)計引物，引物序列見表1，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。采用Trizol法提取肝臟組織總RNA，利用紫外分光光度計測定RNA的純度和濃度。利用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶將mRNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第1鏈。PCR按照Access RT-PCR Introductory System試劑盒說明書進(jìn)行操作。待儀器自動擴(kuò)增完畢后使用Opticon MonitorTM軟件分析結(jié)果，計算各樣本、各基因擴(kuò)增的Ct值(每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達(dá)所設(shè)定的閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù))。采用△△Ct法以內(nèi)參照基因β-actin mRNA的Ct值校正目的基因的Ct值，目的基因表達(dá)水平=2-△△Ct。

1.2.7 TNF-α、IL-6、IκBα、NF-κB p65表達(dá)水平檢測 提取肝臟組織總蛋白和核蛋白，采用BCA法蛋白定量試劑盒檢測TNF-α、IL-6、IκBα、NF-κB p65表達(dá)水平，設(shè)β-actin為定量內(nèi)參照基因，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳，產(chǎn)物電轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，5%脫脂奶粉封閉3 h，特異性一抗4 ℃孵育過夜，免疫球蛋白G(IgG)二抗孵育2 h，顯影。目的條帶及β-actin條帶的灰度值分析采用UVP分析軟件。

2 結(jié)果

2.1 血清及肝臟組織生化指標(biāo)比較 3組血清ALT、AST、TG、TC水平及肝臟組織TG、TC水平比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。NASH模型組和NaHS干預(yù)組血清ALT、TG、TC水平及肝臟組織TG、TC水平均高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；NASH模型組血清AST水平高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；NaHS干預(yù)組血清ALT、AST、TG、TC水平及肝臟組織TG、TC水平均低于NASH模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見表2)。

表1 引物序列及擴(kuò)增產(chǎn)物長度

注：TNF-α=腫瘤壞死因子α；IL-6=白介素6；β-actin=β肌動蛋白

表2 3組大鼠血清及肝臟組織生化指標(biāo)比較

注：a為Z值；與對照組比較，bP<0.05；與NASH模型組比較，cP<0.05；NASH=非酒精性脂肪性肝炎，NaHS=硫氫化鈉，ALT=丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶，AST=天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶，TG=三酰甘油，TC=總膽固醇

2.2 血漿及肝臟組織H2S水平比較 3組血漿H2S水平、肝臟組織H2S水平比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(F=34.15、29.57，P<0.05)。NASH模型組血漿H2S水平和肝臟組織H2S水平均低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；NaHS干預(yù)組血漿H2S水平和肝臟組織H2S水平均高于NASH模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見圖1)。

注：與對照組比較，aP<0.05；與NASH模型組比較，bP<0.05；NASH=非酒精性脂肪性肝炎，NaHS=硫氫化鈉，H2S=硫化氫

圖1 3組大鼠H2S水平比較

Figure 1 Comparison of H2S levels of rats among three groups

2.3 肝臟組織氧化應(yīng)激指標(biāo)比較 3組肝臟組織MDA、SOD水平比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與對照組比較，NASH模型組和NaHS干預(yù)組肝臟組織MDA水平升高，SOD水平降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與NASH模型組比較，NaHS干預(yù)組肝臟組織MDA水平降低，SOD水平升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見表3)。

2.4 肝臟組織病理變化比較 光鏡下對照組肝臟組織

結(jié)構(gòu)完整，邊界清晰，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)無脂滴沉積及炎性細(xì)胞浸潤。與對照組比較，NASH模型組肝臟組織結(jié)構(gòu)紊亂，呈彌漫性脂肪變性、肝細(xì)胞灶性壞死，并可見淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞浸潤。NaHS干預(yù)組肝臟組織脂肪變性、壞死及炎性反應(yīng)程度較NASH模型組明顯減輕。

2.5 肝臟組織TNF-α、IL-6表達(dá)水平比較 3組肝臟組織TNF-α、IL-6 mRNA表達(dá)水平和TNF-α、IL-6表達(dá)水平比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(F=30.34、45.28、31.06、42.15，P<0.05)。與對照組比較，NASH模型組和NaHS干預(yù)組肝臟組織TNF-α、IL-6 mRNA表達(dá)水平和TNF-α、IL-6表達(dá)水平均升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與NASH模型組比較，NaHS干預(yù)組肝臟組織TNF-α、IL-6 mRNA表達(dá)水平和TNF-α、IL-6表達(dá)水平均降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見圖 2～4)。

Table 3 Comparison of liver tissues oxidative stress indexes of rats among three groups

組別MDA(nmol/L)SOD(U/ml)對照組3.21±0.8783.35±10.23NASH模型組4.93±1.56b54.21±8.25bNaHS干預(yù)組3.89±1.03bc70.17±9.43bcF(Z)值15.38a48.83P值<0.01<0.01

注：a為Z值；與對照組比較，bP<0.05；與NASH模型組比較，cP<0.05；MDA=丙二醛，SOD=超氧化物歧化酶

注：與對照組比較，aP<0.05；與NASH模型組比較，bP<0.05；TNF-α=腫瘤壞死因子α，IL-6=白介素6

圖2 3組大鼠TNF-α、IL-6 mRNA表達(dá)水平比較

Figure 2 Comparison of mRNA expression levels of TNF-α and IL-6 of rats among three groups

注：β-actin=β肌動蛋白

圖3 TNF-α、IL-6電泳結(jié)果

Figure 3 Electrophoresis results of TNF-α and IL-6 protein

注：與對照組比較，aP<0.05；與NASH模型組比較，bP<0.05

圖4 3組大鼠TNF-α、IL-6表達(dá)水平比較

Figure 4 Comparison of expression levels of TNF-α and IL-6 of rats among three groups

2.6 肝臟組織IκBα、NF-κB p65表達(dá)水平比較 3組肝臟組織IκBα、NF-κB p65表達(dá)水平比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(F=25.45、32.23，P<0.05)。與對照組比較，NASH模型組和NaHS干預(yù)組肝臟組織IκBα表達(dá)水平均降低，NF-κB p65表達(dá)水平均升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與NASH模型組比較，NaHS干預(yù)組肝臟組織IκBα表達(dá)水平升高，NF-κB p65表達(dá)水平降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見圖5～6)。

注：IκBα=核因子κB抑制因子，NF-κB p65=核因子κB p65

圖5 IκBα、NF-κB p65電泳結(jié)果

Figure 5 Electrophoresis results of IκBα and NF-κB p65 protein

注：與對照組比較，aP<0.05；與NASH模型組比較，bP<0.05

圖6 3組大鼠IκBα、NF-κB p65表達(dá)水平比較

Figure 6 Comparison of expression levels of IκBα and NF-κB p65 of rats among three groups

3 討論

機(jī)體大多數(shù)組織均能通過含硫氨基酸的代謝過程合成內(nèi)源性H2S，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、介導(dǎo)炎性反應(yīng)等廣泛的生理和病理效應(yīng)。有研究表明，NASH患者和動物模型中H2S水平顯著降低，與NASH病變程度呈反比，提示內(nèi)源性H2S可能參與NASH發(fā)病[6]，但其具體機(jī)制尚不明確。本研究結(jié)果顯示，NASH模型組和NaHS干預(yù)組血清ALT、TG、TC水平及肝臟組織TG、TC水平均高于對照組，且NaHS干預(yù)組低于NASH模型組；NASH模型組血清AST水平高于對照組；NASH模型組血漿H2S水平和肝臟組織H2S水平均低于對照組及NaHS干預(yù)組；與對照組比較，NASH模型組肝臟組織結(jié)構(gòu)紊亂，呈彌漫性脂肪變性、肝細(xì)胞灶性壞死，并可見淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞浸潤；NaHS干預(yù)組肝臟組織脂肪變性、壞死及炎性反應(yīng)程度較NASH模型組明顯減輕。提示H2S對NASH導(dǎo)致的肝損傷具有明顯的保護(hù)作用。

NASH的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前尚未完全闡明。Bode等[7]研究顯示，長期高脂飲食導(dǎo)致血清游離脂肪酸(FFA)大量增加，從而誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激，活性氧簇(ROS)、脂質(zhì)過氧化終產(chǎn)物MDA的過量產(chǎn)生及抗氧化劑SOD的消耗對NASH病變及進(jìn)展產(chǎn)生關(guān)鍵作用，其一方面通過絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)等信號途徑誘導(dǎo)NF-κB p65的活化和核內(nèi)轉(zhuǎn)位，另一方面也促使NF-κB p65與其抑制蛋白IκBα的解離，進(jìn)一步激活NF-κB p65，介導(dǎo)炎性反應(yīng)相關(guān)的基因表達(dá)，后者又可加劇胰島素抵抗，進(jìn)而促進(jìn)NASH病變程度加重。其中TNF-α、IL-6是促炎因子中研究較多的與NASH發(fā)病密切相關(guān)的細(xì)胞因子。Endo等[8]研究顯示，腹腔內(nèi)注射TNF-α明顯加劇了肝脂肪沉積和脂肪變性。Mas等[9]研究顯示，通過基因敲除技術(shù)阻斷IL-6表達(dá)能夠明顯減輕NASH的發(fā)生及肝細(xì)胞損傷程度。以上研究提示，炎性因子是導(dǎo)致NASH發(fā)生發(fā)展的重要因素，有可能成為治療NASH的新靶點(diǎn)。本研究結(jié)果顯示，NASH模型組和NaHS干預(yù)組肝臟組織TNF-α、IL-6 mRNA表達(dá)水平和TNF-α、IL-6表達(dá)水平均高于對照組；與對照組比較，NASH模型組和NaHS干預(yù)組肝臟組織SOD水平、IκBα表達(dá)水平均降低，MDA水平、NF-κB p65表達(dá)水平均升高。與Das等[10]、方文軍等[11]報道的結(jié)果一致，表明NASH大鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激增強(qiáng)，可誘導(dǎo)NF-κB p65炎性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活及炎性因子過表達(dá)，這是導(dǎo)致NASH發(fā)生發(fā)展的重要因素。NASH模型組肝臟組織TNF-α、IL-6 mRNA表達(dá)水平和TNF-α、IL-6表達(dá)水平均高于NaHS干預(yù)組；與NASH模型組比較，NaHS干預(yù)組肝臟組織SOD水平、IκBα表達(dá)水平升高，MDA水平、NF-κB p65表達(dá)水平降低。提示外源性給予H2S對NASH 的治療作用可能與減輕氧化應(yīng)激進(jìn)而抑制炎性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān)。

本研究存在的問題：一是盡管已有研究證實(shí)H2S在不同原因?qū)е碌腘ASH中均存在不同程度的降低，但動物實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)尚有矛盾之處。Zhang等[12]報道認(rèn)為，肝臟中H2S的作用是雙向的，H2S會損傷肝細(xì)胞的糖利用，增加糖原異生，在肝損傷中給以H2S治療可能會進(jìn)一步增加損傷，提示H2S參與胰島素抵抗過程的復(fù)雜性，還需要進(jìn)一步深入研究H2S及其相關(guān)酶系在NASH發(fā)生﹑發(fā)展中的變化。二是未進(jìn)行臨床檢測，使得H2S在NASH患者發(fā)病中的作用僅限于推理。

總之，外源性給予H2S后NASH模型大鼠血漿H2S水平及肝臟組織H2S水平得以部分恢復(fù)，對NASH具有一定治療作用。尤其是現(xiàn)在糖尿病、高脂血癥的患者日益增多，導(dǎo)致NASH發(fā)病率逐年增加，急需尋找一種不良反應(yīng)小的藥物應(yīng)用于臨床，本實(shí)驗(yàn)在一定程度上證實(shí)了H2S可靠的降脂、抗感染及改善NASH進(jìn)展的作用。在調(diào)整血脂代謝、改善生活方式的基礎(chǔ)上，提供外源性H2S可能是未來NASH防治研究的方向。

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(本文編輯：崔麗紅)

Impacts of Hydrogen Sulfide on Inflammatory Reaction in High-fat Diet-induced Nonalcoholic Steatosishepatitis Rats

WANGLi,WANGLan-hui,MENGCui-qiao,etal.

ThirdDepartmentofSurgery,HebeiGeneralHospital,Shijiazhuang050051,China

Objective To observe the effect of hydrogen sulfide(H2S) on the levels of inflammatory cytokines in liver tissue of rats with nonalcoholic steatosishepatitis(NASH),and to explore the mechanisms of the anti-NASH effect of H2S.Methods 60 male SD rats at SPF level were randomly and equally divided into control group,NASH model group and NaHS intervention group.Rats in control group were fed with normal diet,rats in NASH model group were fed with high fat diet,rats in NaHS intervention group were fed with high fat diet and were injected intraperitoneally with NaHS(56 mg·kg-1·d-1),rats in control group and NASH model group were injected intraperitoneally with 0.9% sodium chloride solution.At the end of the 8th week,rats in each group were killed to obtain venous blood and liver tissue samples.The serum level of alanine aminotransferase(ALT),aspartate aminotransferase(AST),triglyceride(TG),cholesterol(TC) and H2S,the levels of TG,TC,malondialdehyde(MDA),superoxide dismutase(SOD) and H2S in liver tissues were detected by kit.The histopathological changes of the liver tissues were observed under microscope with HE staining.The mRNA and protein expression levels of TNF-α and IL-6 in liver tissues were detected.The protein expression levels of IκBα and NF-κB p65 in the liver tissues were detected.Results The serum levels of ALT,AST,TG,TC,and the levels of TG,TC in hepatic tissues in NASH model group and NaHS intervention group were significantly higher than those in control group respectively,the above indicators in NaHS intervention group were significantly lower than those in NASH model group respectively(P<0.05).The levels of H2S in blood and hepatic tissues in NASH model group were significantly lower than those in NaHS intervention group and control group respectively(P<0.05).The level of MDA in hepatic tissues in NASH model group and NaHS intervention group was significantly higher than that in control group respectively,whereas the level of SOD in hepatic tissues in NASH model group and NaHS intervention group was significantly lower than that in control group respectively(P<0.05).The MDA level in NASH model group was significantly lower than that in NaHS intervention group,and the SOD level in NASH model group was significantly higher than that in NaHS intervention group(P<0.05).Compared with the liver tissues of rats in control group,the liver tissues of rats in NASH model group showed structure disturbance,macrovesicular steatosis,localized necrosis,neutrephil and lymphocytes infiltration.The levels of macrovesicular steatosis,necrosis,and inflammatory reaction in hepatic tissues in NaHS intervention group were significantly lower than those in NASH model group respectively.The mRNA and protein expression levels of TNF-α and IL-6 in liver tissues in NASH model group and NaHS intervention group were significantly higher than those in control group respectively,and the above indicators in NaHS intervention group were significantly lower than those in NASH model group respectively(P<0.05).The protein expression level of IκBα in cytoplasm in NaHS intervention group and NASH model group was significantly lower than that in control group respectively,the protein expression level of NF-κB p65 in cell nucleus in NaHS intervention group and NASH model group was significantly higher than that in control group respectively(P<0.05).The protein expression level of IκBα in cytoplasm in NaHS intervention group was significantly higher than that in NASH model group,the protein expression level of NF-κB p65 in cell nucleus in NaHS intervention group was significantly lower than that in NASH model group(P<0.05).Conclusion H2S is effective in improving the pathological changes in hepatic tissues,and it can inhibit inflammatory reaction,which might be one of the mechanisms of the anti-NASH effect of H2S.

Hydrogen sulfide;Hepatitis;Inflammatory reaction;Rats

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81200639)；河北省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(H2014303005)

050051 河北省石家莊市，河北省人民醫(yī)院外三科(王麗，王蘭輝，孟翠巧，任路平)；河北省疾病預(yù)防控制中心藥物研究所(李立萍，李國風(fēng))；河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院(宋廣昊)

李國風(fēng)，050021 河北省石家莊市，河北省疾病預(yù)防控制中心藥物研究所；E-mail：guofengli1979@sina.com

R 575.1

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2015.21.011

2014-12-11；

2015-02-27)