帕金森病癡呆患者外周血血小板β淀粉樣前體蛋白表達水平研究

許曉輝，馬聰敏，韓月珍，李 艷

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·論著·

帕金森病癡呆患者外周血血小板β淀粉樣前體蛋白表達水平研究

許曉輝，馬聰敏，韓月珍，李 艷

目的 通過觀察帕金森病癡呆(PDD)患者外周血血小板β淀粉樣前體蛋白免疫反應片段之比(βAPPr)的變化，分析βAPPr與PDD的關系，為PDD診斷提供思路。方法 收集2011年4月—2014年4月在鄭州大學附屬洛陽中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科就診的帕金森病(PD)患者124例，按是否合并癡呆分為PDD組59例和對照組65例。評價簡易智能量表(MMSE)評分、蒙特利爾認知評估量表(MoCA)評分、臨床癡呆評定量表(CDR)評分、統(tǒng)一帕金森病評定量表(UPDRS)評分；采用Western blotting法檢測外周血血小板βAPPr。結(jié)果 PDD組患者受教育年限、MMSE評分、MoCA評分低于對照組，CDR評分、UPDRSⅠ評分高于對照組(P<0.05)。PDD組患者外周血血小板βAPPr(5.43±0.92)低于對照組的(7.88±1.32)(t=6.28，P<0.001)。PDD組患者βAPPr與MoCA評分中視空間與執(zhí)行能力、命名能力、注意能力、延遲回憶能力、定向力得分均呈正相關(P<0.05)。結(jié)論 PDD患者血小板βAPPr較PD患者下降，血小板βAPPr有可能成為PDD診斷的外周血生物學指標之一，外周血血小板淀粉樣前體蛋白(βAPP)表達水平有可能為研究PDD的發(fā)病機制和治療提供線索。

帕金森?。话V呆；血小板；淀粉樣β肽類

許曉輝，馬聰敏，韓月珍，等.帕金森病癡呆患者外周血血小板β淀粉樣前體蛋白表達水平研究[J].中國全科醫(yī)學，2015，18(21)：2507-2510.[www.chinagp.net]

Xu XH,Ma CM,Han YZ,et al.β-amyloid precursor protein expression level in peripheral platelets in patients with Parkinson′s disease and dementia [J].Chinese General Practice，2015，18(21)：2507-2510.

約有80%的帕金森病(PD)患者最終會發(fā)展成為帕金森病癡呆(PDD)[1]。近年研究發(fā)現(xiàn)，阿爾茨海默病(AD)的病理改變同樣存在于PDD患者中[2]。還有研究發(fā)現(xiàn),在PDD患者中β淀粉樣蛋白負荷量會不斷變化[3]。β淀粉樣蛋白由β淀粉樣前體蛋白(βAPP)水解產(chǎn)生。βAPP除了在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中表達，在外周血細胞、上皮組織、肌肉中同樣存在[3]。在外周血細胞中，血小板包含了外周血中絕大部分的βAPP，本研究采用Western blotting法測定血小板β淀粉樣前體蛋白免疫反應片段之比(βAPPr)代表βAPP的表達水平，探討βAPPr與PDD的關系，為PDD診斷提供思路。

1 資料與方法

1.2 研究方法

1.2.1 量表評分 (1)簡易智能量表(MMSE)[6]：27～30分為參考范圍，根據(jù)患者受教育年限進行調(diào)整，以下為可能存在認知功能障礙：未受教育者MMSE評分≤20分,受教育年限小于6年者MMSE評分≤23分,受教育年限6年及以上者MMSE評分≤27分。(2)MoCA[7]：包括視空間與執(zhí)行能力、命名能力、注意能力、語言能力、抽象表達能力、延遲回憶能力、定向力?？偡?30 分?！?6 分提示認知功能正常，<26分提示可能存在認知功能障礙。(3)臨床癡呆評定量表(CDR)[8]:0～3.0分,0、0.5、1.0、2.0、3.0分分別判定為正常、可疑、輕度、中度、重度5級。(4)統(tǒng)一帕金森病評定量表(UPDRS)[9]：包含3個維度，即UPDRSⅠ～Ⅲ，其中UPDRSⅠ(第一部分) 評估患者的精神情感障礙，共4個條目，分別為智力損害、思維障礙、抑郁、主動性，0～16分。本研究評估UPDRSⅠ評分。MMSE、MoCA、CDR、UPDRSⅠ評分均由經(jīng)過統(tǒng)一培訓的醫(yī)師完成。

1.2.2 Western blotting法檢測外周血血小板βAPPr 患者于清晨抽取肘靜脈血5 ml，注入枸櫞酸鈉抗凝管，室溫，1 500 r/min離心10 min(離心半徑10 cm),移黃色上清液至無菌離心管中，3 500 r/min離心15 min(離心半徑10 cm)，將沉淀物懸浮于1 ml Tyrod′s液中，4 ℃、10 000 r/min離心10 min(離心半徑8 cm)，棄去上清液，將沉淀物懸浮于Tyrod′s液中。在血小板懸浮液中加入細胞裂解液，在60 ℃恒溫水浴箱和液氮中反復快速凍融3次，再以4 ℃、12 000 r/min離心10 min(離心半徑8 cm)，取上清液移到離心管，利用Lowry法進行蛋白定量，清洗電泳灌膠玻璃板，在每份標本中加入等量的2×十二烷基硫酸鈉(SDS)上樣緩沖液，100 ℃加熱3 min，采用Tris-Tricine系統(tǒng)進行電泳，電泳后凝膠進行轉(zhuǎn)膜，加慢轉(zhuǎn)膜緩沖液于4 ℃、80 V轉(zhuǎn)膜1 h。轉(zhuǎn)膜后分別將標記醋酸纖維素膜放入1×TBST(NaCl 500 mmol/L，Tris 20 mmol/L，pH 7.5，Tween-20 0.1%)，室溫下洗滌10 min，共2次，之后加入封閉液10 ml(5%脫脂奶加TBST)，室溫封閉1 h，加入一抗(鼠抗人單克隆抗體1∶1 000)，4 ℃孵育過夜，1×TBST洗滌2次，加二抗〔辣根過氧化物酶(HRP)標記羊抗鼠IgG 1∶1 000〕室溫孵育1 h，1×TBST室溫洗滌3次，10 min/次，之后加入0.6 ml化學發(fā)光底物液，將醋酸纖維膜包好，醫(yī)學專用膠片曝光40 s，出現(xiàn)清晰條帶后移入定影液，定影2 min，利用凝膠成像系統(tǒng)分別檢測每一樣品βAPP兩條特異性條帶灰度值，其比例即βAPPr代表βAPP的表達水平。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者受教育年限及各量表評分比較 PDD組患者受教育年限、MMSE評分、MoCA評分低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；PDD組患者CDR評分、UPDRSⅠ評分高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見表1)。

2.2 兩組患者外周血血小板βAPPr比較 對照組患者外周血血小板βAPPr(7.88±1.32)，PDD組患者外周血血小板βAPPr(5.43±0.92)，差異有統(tǒng)計學意義(t=6.28，P<0.001)。

表1 對照組與PDD組患者受教育年限及各量表評分比較

注：PDD=帕金森病癡呆，MMSE=簡易智能量表，MoCA=蒙特利爾認知評估量表，CDR=臨床癡呆評定量表，UPDRS=統(tǒng)一帕金森病評定量表

2.3 PDD組患者βAPPr與MoCA評分相關性分析 PDD組患者βAPPr與MoCA評分中視空間與執(zhí)行能力〔(1.8±1.6)分〕(r=0.064)、命名能力〔(2.6±0.8)分〕(r=0.203)、注意能力〔(4.0±1.3)分〕(r=0.198)、延遲回憶能力〔(1.1±1.0)分〕(r=0.084)、定向力〔(4.5±1.1)分〕(r=0.178)得分均呈正相關(P<0.05)；PDD組患者βAPPr與 MoCA 評分中語言能力〔(1.9±0.7)分〕(r=0.312)、抽象表達能力〔(1.0±0.5)分〕(r=0.228)得分均無直線相關關系(P>0.05)。

3 討論

近年來PDD發(fā)病率有所增高，我國于焰等[10]、邵自強等[11]調(diào)查顯示，PD是引起癡呆的重要原因之一，PD患者雖然數(shù)量不多，但PDD的發(fā)病率卻很高。國外橫斷面調(diào)查研究顯示，PDD患病率為22%～48%[12]。PDD的發(fā)病機制目前普遍認為與多巴胺能神經(jīng)元介導的額葉-紋狀體功能缺陷、上行單胺能系統(tǒng)變化、上行膽堿能通路的損害有關,其次與皮質(zhì)與皮質(zhì)下淀粉樣蛋白沉積及邊緣系統(tǒng)路易小體形成有關[13]。Compta等[14]認為，部分PDD患者合并AD的病理改變、AD所特有的病理改變同樣存在于PDD患者中,神經(jīng)纖維纏結(jié)、β淀粉樣老年斑病理改變同時出現(xiàn)或者合并路易小體、邊緣系統(tǒng)路易小體組成了PDD神經(jīng)病理學主要構(gòu)成。腦內(nèi)的βAPP通過淀粉或非淀粉源途徑代謝產(chǎn)生β淀粉樣蛋白，在腦內(nèi)沉積，外周血血小板活化時，血小板中的βAPP和β淀粉樣蛋白被釋放出來，隨同脫顆粒內(nèi)容物一起釋放到血液中，造成β淀粉樣蛋白沉積于血管壁，致使中樞神經(jīng)元外部分老年斑的產(chǎn)生。神經(jīng)元中含有的βAPP分解酶也存在于外周血血小板中，血小板包含了外周血中絕大部分的βAPP，βAPP異構(gòu)體片段(βAPP695、βAPP751、βAPP770)均在血小板中表達。檢測血小板βAPPr是一條可行的途徑。AD患者血小板βAPPr明顯降低，且病情越重其水平越低，血小板βAPPr作為早期診斷AD的指標，其靈敏度和特異度可超過80%，治療后血小板βAPPr較治療前明顯升高，因此血小板βAPPr既可以作為AD的診斷指標，又可以作為療效評價指標[15]。

AD 病理改變同樣存在于PDD患者中，因此本研究探討了βAPPr與PDD的關系。經(jīng)過比較發(fā)現(xiàn)，PDD組與對照組患者性別、年齡無差異，但是PDD組患者PD病程長于對照組，PDD組患者CDR評分、UPDRSⅠ評分高于對照組，受教育年限、MMSE評分、MoCA評分低于對照組，PDD組患者血小板βAPPr較對照組降低。與國外關于AD與βAPPr的研究結(jié)果一致[3]，其原因很可能是α突觸核蛋白加速了tau蛋白和β淀粉樣蛋白的沉積。Compta等[14]通過定量評估病理學改變方式認為，路易小體及AD 病理改變聯(lián)合作用于PDD 的發(fā)生,并且是PD認知功能障礙的主要原因。MoCA對輕度認知功能障礙較敏感，能全方位評價認知的各個領域，因此本研究分析了PDD組患者βAPPr與MoCA評分各維度的關系，除語言能力和抽象表達能力，βAPPr與視空間與執(zhí)行能力、命名能力、注意能力、延遲回憶能力、定向力呈正相關，與國外報道相似[16]。PDD患者出現(xiàn)上述認知功能障礙的原因可能有以下幾個方面：(1)基底核與額葉的皮質(zhì)及皮質(zhì)下多巴胺環(huán)路被破壞，多巴胺能神經(jīng)遞質(zhì)減少，乙酰膽堿水平降低可引起注意能力、延遲回憶能力、視空間執(zhí)行能力下降；(2)PDD患者磁共振成像顯示海馬、額葉、島葉、雙側(cè)顳葉皮質(zhì)萎縮[17]，也可導致命名能力、注意能力、延遲回憶能力、執(zhí)行能力下降；(3)神經(jīng)纖維纏結(jié)、β淀粉樣老年斑病理改變同時出現(xiàn)與蛋白相關的皮質(zhì)與皮質(zhì)下及邊緣系統(tǒng)路易小體形成有關[13]，可出現(xiàn)延遲回憶能力減退、注意能力、視空間及執(zhí)行能力下降。

PDD患者βAPPr下降的原因還不是很清楚，其機制有待進一步研究。βAPPr有可能提供PDD發(fā)生風險的有關信息，對分析PDD發(fā)生的病理機制具有一定意義，有提高早期診斷率及早期抗β淀粉樣蛋白治療的可能性。然而，需要指出的是，不是所有患者在PD早期就出現(xiàn)癡呆，癡呆常是PD晚期并發(fā)癥，另外β淀粉樣蛋白沉積是一個與年齡相關的現(xiàn)象，在年輕PDD群體中應用效果不明顯。將βAPPr作為臨床中診斷、評價病情和監(jiān)測治療效果的生物標志物時可能還需要聯(lián)合其他生物學標志物以及影像學進行判定，并且還需對PDD患者進行長期隨訪。另外其檢測技術較復雜，對實驗室條件有一定要求且檢測時間較長，不利于廣泛開展。上述結(jié)論需要進一步擴大樣本量、收集更多的證據(jù)來證明。

[1]Tachibana H.Cognitive impairment in Parkinson′s disease[J].Seishin Shinkeigaku Zasshi,2013,115(11):1142-1149.

[2]Ohta K,Takahashi K,Gotoh J,et al.Screening for impaired cognitive domains in a large Parkinson′s disease population and its application to the diagnostic procedure for Parkinson′s disease dementia[J].Dement Geriatr Cogn Dis Extra,2014,4(2):147-159.

[3]Gowert NS,Donner L,Chatterjee M,et al.Blood platelets in the progression of Alzheimer′s disease[J].PLoS One,2014,9(2):e90523.

[4]陳生弟，中華醫(yī)學會神經(jīng)病學分會運動障礙學組及帕金森病學組.中國帕金森病治療指南(第二版)[J].中華神經(jīng)科雜志,2009,42(5):352-355.

[5]中華醫(yī)學會神經(jīng)病學分會帕金森病及運動障礙學組，中華醫(yī)學會神經(jīng)病學分會神經(jīng)心理學與行為神經(jīng)病學組.帕金森病癡呆的診斷與治療指南[J].中華神經(jīng)科雜志,2011,44(9):635-637.

[6]Flostein MF,Folstein SE,McHugh PR."Mini-mental state".A practical method for grading the cognitive state of the patients for the clinician[J].J Psychiatr Res,1975,12(3):189-198.

[7]Nasreddine ZS,Phillips NA,Bédirian V,et al.The Montreal Cognitive Assessment,MoCA:a brief screening tool for mild cognitive impairment[J].J Am Geriatr Soc,2005,53(4):695-699.

[8]血管性認知功能損害專家共識組.血管性認知功能損害的專家共識[J].中華內(nèi)科雜志，2007,46(12):1052-1055.

[9]Marinus J，Visser M，Satiggelbout AM,et al.A short scale for the assessment of motor impairments and disabilities in Parkinson′s disease：the SPES/SCOPA[J].J Neurol Neurosurg Psychiatry,2004,75(3):388-385.

[10]Yu Y,Zhang N,Dong JM,et al.Prevalence of dementia among eldly and its influential factors[J].Chinese General Practice,2012,15(23):2685-2687.(in Chinese) 于焰,張娜,董佳梅,等.社區(qū)老老年人群癡呆患病率及其影響因素研究[J].中國全科醫(yī)學,2012,15(23):2685-2687.

[11] Shao ZQ,Wang RB,Xue S.Clinical analysis of Parkinson′s disease complications in 56 patients[J].Chinese General Practice,2010,13(6):649-651.(in Chinese) 邵自強,汪仁斌,薛爽.帕金森病患者56例并發(fā)癥的臨床分析[J].中國全科醫(yī)學,2010,13(6):649-651.

[12]Emre M,Aarsland D,Brown R,et al.Clinical diagnostic criteria for dementia associated with Parkinson′s disease[J].Mov Disord，2007,22(12):1689-1707.

[13]Petrou M,Bohnen NI,Müller ML,et al.Aβ-amyloid deposition in patients with Parkinson disease at risk for development of dementia[J].Neurology,2012,79(11):1161-1167.

[14]Compta Y,Parkkinen L，O′Sullivan SS,et al.Lewy-and Alzheimer-type pathologies in Parkinson′s disease dementia:which is more important? [J].Brain，2011,134(Pt 5):1493-1505.

[15]Evin G,Li QX.Platelets and Alzheimer′s disease:potential of APP as a biomarker[J].World J Psychiatry,2012,2(6):102-103.

[16]Aarsland D,Bronnick K,Fladby T.Mild cognitive impairment in Parkinson′s disease[J].Currr Neurol Neurosci Rep,2011,11(4):371-378.

[17]Song SK,Lee JE,Park HJ,et al.The pattern of cortical atrophy in patients with Parkinson′s disease according to cognitive status[J].Mov Disord,2011,26(2):289-296.

(本文編輯：陳素芳)

β-amyloid Precursor Protein Expression Level in Peripheral Platelets in Patients With Parkinson′s Disease and Dementia

XUXiao-hui,MACong-min,HANYue-zhen,etal.

DepartmentofNeurology,LuoyangCentralHospitalAffiliatedtoZhengzhouUniversity,Luoyang471009,China

Objective To investigate the relationship between Parkinson′s disease with dementia(PDD) and β-amyloid precursor protein forms ratio(βAPPr) in peripheral platelets by the observation of the changes in βAPPr in the peripheral platelets of patients with PDD,in order to provide new insights for the diagnosis of PDD.Methods 124 patients with PDD who received treatment in the Department of Neurology of Central Hospital Affiliated to Zhengzhou University from April 2011 to April 2014.According to whether dementia occurred,the subjects were divided into two groups:PDD group(n=59) and control group(n=65).All the patients were evaluated by using Mini-mental state examination(MMSE),Montreal Cognitive Assessment(MoCA),Clinical Dementia Rating(CDR) and Unified Parkinson′s Disease Rating Scale(UPDRS);βAPPr of the two groups was determined by Western blotting method.Results PDD group was lower(P<0.05) than control gorup in education years,MMSE score and MoCA score and higher(P<0.05) than control group in CDR score and UPDRSⅠscore.PDD group was lower than conrol group in βAPPr(5.43±0.92,7.88±1.32;t=6.28，P<0.001).In PDD group,βAPPr was positively correlated(P<0.05) with the scores of several MoCA items,including visuospatial ability,executive capability,naming ability,attention,delayed recall ability,and orientation ability.Conclusion PDD patients have lower βAPPr than PD patients,which means βAPPr in platelets could be used as one of the peripheral biological indicators for the diagnosis of PDD.βAPP elements in peripheral platelets may also provide new insights into the pathological mechanism and treatment of PDD.

Parkinson disease；Dementia；Blood platelets；Amyloid beta-peptides

471009河南省洛陽市，鄭州大學附屬洛陽中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科

許曉輝，471009河南省洛陽市，鄭州大學附屬洛陽中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科；E-mail：13643886310@163.com

R 745.1

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2015.21.004

2014-11-24；

2015-05-12)