兩種黃芪多糖提取方法比較

陳玉霞， 林 峰， 莫 娟， 杜向黨

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 牧醫(yī)工程學(xué)院, 河南 鄭州 450002)

?

兩種黃芪多糖提取方法比較

陳玉霞， 林 峰， 莫 娟， 杜向黨

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 牧醫(yī)工程學(xué)院, 河南 鄭州 450002)

為了優(yōu)選黃芪多糖提取的工藝，分別用水提醇沉法、微波提取法提取黃芪多糖，比較兩種工藝提取黃芪多糖的提取率和提取時間，并采用紫外分光光度法測定黃芪多糖含量。結(jié)果：水提醇沉法的黃芪多糖提取率4.468%，含量29.40%；微波提取法的黃芪多糖提取率4.502%，含量31.25%。試驗結(jié)果表明：微波提取法具有省時、高效、節(jié)能等優(yōu)點，在提高黃芪多糖產(chǎn)率和有效縮短提取時間等方面優(yōu)于傳統(tǒng)的水提醇沉法，是獲得較高黃芪多糖提取率及含量的方法。

黃芪多糖; 水提醇沉法; 微波提取法; 紫外分光光度法

0 引 言

黃芪是一種常見的補益類中草藥，黃芪主產(chǎn)于甘肅、內(nèi)蒙、陜西、河北及東北、西藏等地[1]。黃芪多糖是黃芪中重要的天然有效成分之一, 它具有增強機體免疫功能、強心、降壓、降血糖、抗應(yīng)激、抗腫瘤、抗病毒、抗輻射、抗氧化等多種藥理功效，能促進(jìn)免疫器官功能和抗體生成，具有雙向調(diào)節(jié)血糖等作用[2-4]。自1981年黃芪多糖被提取分離以來，研究報道不斷增多[5-8]，已成為中藥提取及中草藥現(xiàn)代化研究的焦點之一。目前黃芪多糖的傳統(tǒng)提取法主要是采用蒸餾水提取工藝，該工藝簡單，操作簡便易行，但得到多糖粗品的收率低，加上提取成本很高，使得黃芪多糖的開發(fā)利用受到限制。為了進(jìn)一步開發(fā)利用該類活性成分，許多學(xué)者在研究黃芪多糖組成、結(jié)構(gòu)和產(chǎn)物活性的同時，對其提取分離工藝進(jìn)行了研究，以期找出更合理、更可行的生產(chǎn)工藝。

本試驗從以下幾個方面考慮：黃芪多糖的收率，所提粗黃芪多糖的含糖量，整個工藝流程是否經(jīng)濟，保持所提的黃芪多糖具有活性。對比水提醇沉、微波輔助水提兩種方法，來判斷黃芪多糖提取工藝的優(yōu)劣。

1 實驗部分

1.1 儀 器

電子天平(Sartorius BS224S，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)，PJ23C-AN美的微波爐(廣東美的微波爐制造有限公司)，紫外分光光度計(UV Bluestar 300424 ，北京萊伯泰科儀器有限公司)，RE-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海青浦滬西儀器廠)，超速離心機(LXJ-ⅡB型, 上海安亭科學(xué)儀器廠)，循環(huán)水式真空泵(SHZ-DⅢ，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)，HHS型電熱恒溫水浴鍋(天津市華北實驗儀器有限公司)，100 mL容量瓶。

1.2 藥品與試劑

黃芪藥材飲片(河南省藥材公司)，蒸餾水(實驗室自制),乙醇、丙酮、葡萄糖、苯酚和濃硫酸均為分析純。

1.3 實驗方法

1.3.1 黃芪多糖的提取分離

(1) 水提醇沉法。 精密稱取黃芪飲片50 g, 加80%乙醇，回流提取2 h，濾出溶液，殘渣揮干乙醇，然后加入8倍量蒸餾水加熱回流提取2 h, 濾出溶液, 藥材再加入8倍量的蒸餾水加熱回流提取2 h,棄去濾渣合并濾液,過濾，濃縮得到濃縮液50 mL,濃縮液上超速離心機,分離過濾的濾液濃縮至50 mL,調(diào)醇度為80%,室溫靜置過夜12 h, 超速離心，收集白色沉淀物(一次醇沉)，并將上清液減壓濃縮至50 mL，再次調(diào)醇度為80%，室溫靜置12 h，超速離心，棄上清液，收集白色沉淀物(二次醇沉)，合并兩次得到的白色沉淀物，用丙酮洗滌2次，過濾放入干燥器中真空干燥, 即得黃芪多糖。

(2) 微波提取法。 精密稱取黃芪飲片50 g，置于微波提取器中，加80%乙醇，調(diào)節(jié)功率為300 W，回流提取20 min，濾出溶液，殘渣揮干乙醇，將脫脂后的藥材再加入8倍量的蒸餾水，在微波爐功率300 W時加熱10 min，過濾，殘渣用相同方法再處理1次，棄去濾渣并合并濾液，濃縮得到濃縮液50 mL，濃縮液上超速離心機,分離過濾的濾液濃縮至50 mL,調(diào)醇度為80%,室溫靜置過夜12 h, 超速離心，收集白色沉淀物(一次醇沉)，并將上清液減壓濃縮至50 mL，再次調(diào)醇度為80%，室溫靜置12 h，超速離心，棄上清液，收集白色沉淀物(二次醇沉)，合并兩次得到的白色沉淀物，用丙酮洗滌2次，過濾放入干燥器中真空干燥, 即得黃芪多糖。

1.3.2 黃芪多糖的含量測定

以標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，采用苯酚-硫酸比色法測定多糖含量。苯酚-硫酸比色法是目前黃芪多糖含量測定的主要方法之一，該法是糖在濃硫酸作用下，脫水生成糠醛或羥甲基糠醛能與苯酚縮合成一種橙紅色化合物，在10～100 mg范圍內(nèi)其顏色深淺與糖的含量成正比，且在490 nm處有特征吸收峰，故可用比色法在此波長下測定[9-10]。但操作中要注意苯酚的濃度及加入量，條件選擇要適當(dāng)，操作要嚴(yán)格。

(1) 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液配制： 精密稱取充分干燥至恒重的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，加適量蒸餾水溶解，轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，加水至刻度并搖勻，配成濃度0.1 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液備用。

5%苯酚溶液的配制： 精密稱取苯酚50 g，加鋁片0.1 g和碳酸氫鈉0.05 g，加熱蒸餾，收集182 ℃餾分，冷卻，稱取5.0 g，加水稀釋至100 mL，搖勻后, 裝入棕色試劑瓶中保存?zhèn)溆谩?/p>

分別量取配制好的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.1 mg/mL)1.0, 2.0, 3.0, 4.0, 5.0, 6.0, 8.0, 10 mL于10 mL容量瓶中加蒸餾水定容，取標(biāo)準(zhǔn)液1. 0 mL于10 mL具塞試管中，加入5%的苯酚溶液l.0 mL，搖勻后迅速加入5 mL濃硫酸顯色，振蕩5 min。置于沸水浴中加熱30 min，取出后冷卻至室溫。另取1.0 mL蒸餾水同法做成空白參比溶液, 在200～700 nm范圍內(nèi)掃描，確定其最大吸收波長為490 nm。用紫外分光光度計在490 nm處測定吸光度A,以A為縱坐標(biāo), 葡萄糖濃度C為橫坐標(biāo),求出標(biāo)準(zhǔn)回歸方程。

(2) 供試品溶液的配制。 分別取兩種方法提取的黃芪多糖各10 mg，加適量蒸餾水溶解后，過濾，轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中加水稀釋至刻度，作為待測樣品液。

(3) 樣品含量測定。 精密吸取供試品溶液2.0 mL，于10 mL容量瓶中加蒸餾水定容，移取1. 0 mL于10 mL具塞試管中，加入l.0 mL 5%的苯酚溶液，搖勻后迅速加入5 mL濃硫酸顯色，振蕩5 min。置于沸水浴中加熱30 min，冷卻至室溫，采用蒸餾水同法做空白參比溶液，分別測定吸光度A，代入標(biāo)準(zhǔn)方程C=0.212 2A-0.006 37，計算樣品濃度，含量計算:

多糖含量(%) =CD/V×100

式中:C為供試液葡萄糖濃度(mg/mL )；D為試液的稀釋因素；V為供試品溶液體積(mL)。

2 結(jié)果與討論

2.1 結(jié) 果

測定結(jié)果見表1和圖1。經(jīng)計算得標(biāo)準(zhǔn)回歸方程：C=0.212 2A-0.006 37(相關(guān)系數(shù)r=0.997 1)。兩種提取工藝的提取結(jié)果見表2。兩種工藝提取的黃芪多糖均為淡黃色粉末,易溶解于水,無雜質(zhì)。

表1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液測定結(jié)果

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液的標(biāo)準(zhǔn)曲線

藥材質(zhì)量/g粗多糖提取量/g多糖提取率/%多糖含量/%水提醇沉法502.23414.46829.40微波提取法502.25104.50231.25

2.2 結(jié)果分析

本試驗比較了水提醇沉法與微波輔助提取法提取黃芪多糖，黃芪多糖粗提物含量高低是評價提取工藝的重要方法，多糖含量越高，說明提取越完全。由表2可知,水提醇沉法提取黃芪多糖的含量為29.40%，微波提取法提取黃芪多糖含量為31.25%。發(fā)現(xiàn)在黃芪多糖提取率接近的情況下，微波提取法中得到多糖含量較多且提取率高，微波輔助提取法較水提醇沉法的提取時間縮短了將近8倍，由此可以看出,微波提取法是黃芪多糖比較理想的提取工藝。

張萍等[11]試驗表明，黃芪多糖可采用水浸提、微波輔助提取，兩種方法均能有效地提取多糖。采用水浸提法提取得率可達(dá)到5.31%，但提取時間長；微波對傳質(zhì)過程有顯著強化作用，極大地縮短了黃苠多糖的提取時間；采用微波輔助提取10 min，多糖得率可達(dá)到5.96%。

微波對黃芪多糖的提取具有良好的輔助作用，能降低提取劑用量，縮短提取時間和提高多糖產(chǎn)率，具有省時高效節(jié)能等優(yōu)點從而降低提取成本，在很多方面優(yōu)于傳統(tǒng)的水提醇沉法。

2.3 討 論

(1) 水提醇沉法工藝。黃芪多糖的傳統(tǒng)提取方法包括回流法和水提醇沉法[12]，就目前研究狀況來看，水提醇沉法由于其方法簡單、設(shè)備要求低等優(yōu)點應(yīng)用更為廣泛，但該法提取率不高，水煮溫度高,對提取物的選擇性不好，會將植物細(xì)胞內(nèi)的可溶性蛋白質(zhì)一起溶出，在后續(xù)工藝中又不能把它們分離出來，故使所得多糖含雜質(zhì)較多。朱振元等[13]在不同因素水平下優(yōu)化黃芪多糖水煮醇沉法的提取條件，得出黃芪多糖最佳提取條件為提取時間2 h，提取溫度80 ℃，料液比1∶10，多糖得率為9.77%；利用醇沉、DEAE-SephadexA-25和SephadexG-100進(jìn)行分離純化，得到兩種黃芪多糖，純度和糖含量較高，效果較好。

(2) 微波輔助提取法工藝。微波是指頻率為300～300 GHz的電磁波，是無限電波中一個有限頻帶的簡稱。微波作為一種電磁波具有波粒二象性，基本性質(zhì)通常表現(xiàn)為穿透、反射、吸收3個特性。微波技術(shù)在工業(yè)、農(nóng)業(yè)、醫(yī)學(xué)和國防等方面的研究與應(yīng)用，近年來得到了很大發(fā)展。微波提取法是一種有效的新型提取方法，其具有穿透力強、選擇性高、加熱效率高等特點，微波輻射可以大大加快反應(yīng)速度。微波作用于植物細(xì)胞壁，其熱效應(yīng)使細(xì)胞壁破裂和細(xì)胞膜中的酶失去活性，細(xì)胞中多糖容易突破細(xì)胞壁和細(xì)胞膜障礙被提取出來，有效地提高收率。

現(xiàn)代提取方法包括微波輔助提取、超聲輔助提取、酶法提取等，與水提醇沉法相比，微波對黃芪多糖的提取具有很好的輔助作用，龔盛昭等[14]以水為提取劑，研究了微波輔助提取黃芪多糖的工藝，得到了微波輔助提取黃芪多糖的最佳工藝條件：液料質(zhì)量比為12∶1，用飽和石灰水調(diào)節(jié)pH 9；微波功率300 W時提取2次，每次提取10 min；提取液真空濃縮后，加入乙醇使多糖沉淀，過濾；沉淀用乙醇洗滌多次，真空干燥后即得黃芪粗多糖。此法產(chǎn)率14.6%，純度88.1%，與水提醇沉法相比，微波輔助提取能縮短提取時間，降低提取劑用量，提高黃芪多糖產(chǎn)率，具有省時、高效、節(jié)能等優(yōu)點，從而降低提取成本，在很多方面優(yōu)于水提醇沉法[15]。

(3) 紫外可見分光光度法。 苯酚-濃硫酸法的準(zhǔn)確性較好，靈敏度較高，適用面較廣泛，因此選擇苯酚-濃硫酸法作為本實驗的含量測定方法。紫外可見分光光度法測定多糖具有簡便快捷、靈敏度高、準(zhǔn)確可靠、重現(xiàn)性好的優(yōu)點。在未來發(fā)展中，可將分離性好、準(zhǔn)確度高的HPLC法或高效毛細(xì)管電泳法等新技術(shù)運用到對黃芪多糖的含量測定中來。

(4) 設(shè)計黃芪多糖的提取工藝。乙醇濃度的稍微不同將造成實驗結(jié)果的顯著差異，因此試驗中要嚴(yán)格控制乙醇濃度為80%。

3 結(jié) 語

水提醇沉法由于其方法簡單、設(shè)備要求低等優(yōu)點應(yīng)用更為廣泛，但該法提取率不高。微波提取法中得到多糖含量較多且提取率高，省時，高效，節(jié)能，是獲得較高黃芪多糖提取率及含量的理想方法。

[1] 劉瑞生.黃芪多糖提取方法研究概況[J].中國獸藥雜志,2007,41(3).35-36.

[2] 韓鳳蘭,陸 峰,陳宇紅.黃芪多糖的提取研究[J].寧夏農(nóng)林科技,2004(5):21-23.

[3] Lobner M, Walsted A, Larson R,etal. Enhancement of human adaptive immune responses by administration of a high-molecular-weight polysaccharide extract from the cyanobacterium Arthrospira platensis [J]. Med Food,2008,11 (2): 313-322.

[4] Shao B M,Xu W,Dai H.A study on the immune receptors for polysaccharides from the roots of Astragalus membranaceusm,a Chinese medicinal herb[J].Biochem Biophys Res Commun,2004,20(4):1103.

[5] 賀珍俊,那日蘇.黃芪多糖提取工藝研究綜述[R].內(nèi)蒙古石油化工,2003, 29: 5-6.

[6] 金芬芬，金錫姣，楊惠鑫,等. 不同提取方法對黃芪多糖提取率影響的實驗研究[J]. 中華中醫(yī)藥學(xué)刊,2013(10):2136-2138

[7] 李曉芳，吳 榮，葉喜德. 響應(yīng)面法優(yōu)化黃芪多糖提取工藝研究 [J]. 江西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2013(5):46-49.

[8] 董文陽，周巖民. 黃芪多糖提取方法的研究 [J].飼料研究 ,2012(7):32-34

[9 ] 翟翠云,李曉平,陶 卿.黃芪多糖含量測定方法的探討[J].廣西畜牧獸醫(yī),2007,23(1):8-9.

[10] 中國獸藥典委員會.中華人民共和國獸藥典[S]. 2010年版三部.北京:中國農(nóng)業(yè)出版社, 2011.

[11] 張 萍,梁新麗,廖正根,等.正交設(shè)計優(yōu)選黃芪多糖的微波輔助與傳統(tǒng)提取工藝研究[J].江西中醫(yī)學(xué)院報,2009,21(1):33-35.

[12] 朱虎成.黃芪多糖的提取與應(yīng)用研究[J].中國動物保健，2011(3):25-26.

[13] 朱振元,劉榮強,周 芳.黃芪多糖的分離純化和抗腫瘤活性研究[J].現(xiàn)代食品科技,2011,27(4): 376-379.

[14] 龔盛昭,楊卓如.微波輔助提取黃芪多糖的工藝研究[J].華南理工大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué) 版),2004,34(8):93-98.

[15] 楊惠鑫，李敏楊，楊潔紅,等. 微波輔助提取黃芪多糖的提取工藝優(yōu)化研究 [J].中國中醫(yī)急癥,2013(1):10-11,44.

Comparison of Two Extraction Methods of Astragalus Polysaccharide

CHENYu-xia,LINFeng,MuoJuan,DUXiang-dang

(College of Animal Husbandry and Veterinary, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China)

In order to investigate extraction methods of Astragalus polysaccharides, the methods of water extract-alcohol precipitation and microwave extraction were used to extract Astragalus polysaccharides. The two processes for the extraction rate and extraction time of Astragalus polysaccharides were compared and the content of Astragalus polysaccharides was calculated by using Uv-spectrophotometry. The results showed that the extraction rate of Astragalus polysaccharides was 4.468% with the Astragalus polysaccharides content of 29.40% by using water extract-alcohol precipitation method, and the extraction rate of Astragalus polysaccharides was 4.502% with the content of 31.25% by using microwave extraction. Compared with the water extract-alcohol precipitation method, the extraction time of the microwave extraction method reduced by nearly 8 times. The results indicated that microwave extraction had the advantages of high efficiency and energy saving, and it was superior to the traditional water extract-alcohol precipitation method in the improvement of the productivity and effectively shortening the extraction time of Astragalus polysaccharides. The microwave extraction is an ideal method for the highest content and extraction rate of Astragalus polysaccharides.

Astragalus polysaccharides; water extract-alcohol precipitation; microwave extraction; Uv-spectrophotometer

2014-05-29

“十一五”國家科技支撐計劃項目(2006BAK02A03-3);河南省青年骨干教師資助計劃

陳玉霞(1973-),女,河南鄭州人,碩士,高級實驗師,研究方向為藥物分析實驗技術(shù)與管理。

Tel.:13937170926;E-mail:cyx7304@163.com

林 峰(1972-)，男，山東棲霞人，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向為動物生殖生物技術(shù)。

Tel.:13838084121;E-mail:linfeng7207@163.com

R 932

A

1006-7167(2015)03-0020-03