苯二酚內(nèi)酯合成途徑中的聚酮合酶組合表達(dá)研究

白 凈, 陸 偉, 徐玉泉, 陳 明

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所, 北京 100081

研究論文

苯二酚內(nèi)酯合成途徑中的聚酮合酶組合表達(dá)研究

白 凈, 陸 偉, 徐玉泉, 陳 明*

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所, 北京 100081

由真菌聚酮合酶合成的苯二酚內(nèi)酯類次生代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)和功能多樣，在醫(yī)藥和農(nóng)業(yè)上具有廣泛的用途。苯二酚內(nèi)酯由一對還原型聚酮合酶和非還原型聚酮合酶協(xié)同生物催化合成。還原型聚酮合酶和非還原型聚酮合酶由多功能結(jié)構(gòu)域組成，每個(gè)結(jié)構(gòu)域在生物合成的過程中程序化地執(zhí)行特定的功能。通過交換不同真菌苯二酚內(nèi)酯合成途徑中非還原型聚酮合酶的起始物?；D(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域，在釀酒酵母中與相應(yīng)的還原型聚酮合酶組合表達(dá)，合成了“非天然”的苯二酚內(nèi)酯聚酮產(chǎn)物，并初步討論了起始物?；D(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域的識(shí)別規(guī)律。

聚酮合酶;真菌;苯二酚內(nèi)酯;生物合成

真菌苯二酚內(nèi)酯聚酮化合物是一類結(jié)構(gòu)和生物活性多樣的次級(jí)代謝產(chǎn)物，對真菌自身生長、發(fā)育等產(chǎn)生重要影響。該類化合物在醫(yī)藥和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中具有廣泛的應(yīng)用，例如，脫氫彎孢霉素(dehydrocurvularin)具有免疫抑制劑的活性[1]，根赤殼菌素(radicicol)能夠抑制Hsp90分子伴侶蛋白的合成，具有抗腫瘤的活性[2]。

大多數(shù)真菌聚酮類化合物是由多結(jié)構(gòu)域的聚酮合酶(polyketide synthase，PKSs)通過克萊森(Claisen)縮合反應(yīng)將小分子羧基酸單體催化合成長鏈化合物。聚酮合酶的催化結(jié)構(gòu)域共價(jià)相連,其中的3個(gè)基本功能結(jié)構(gòu)域分別為：酮縮酶結(jié)構(gòu)域(KS)、?；D(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域(AT)和?；d體蛋白結(jié)構(gòu)域(ACP)[3]。2001年，Nicholson等[4,5]根據(jù)基因中編碼的結(jié)構(gòu)域?qū)⒄婢鶳KSs進(jìn)一步分為3種不同類型：不能還原β酮基的非還原型聚酮合酶(non-reduced PKS，NR PKS)，部分還原型聚酮合酶(parcially reduced PKS，PR PKS)和完全還原型聚酮合酶(highly reduced PKS，HR PKS)。非還原型聚酮合酶含有起始物?；D(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域(SAT)、產(chǎn)物模板結(jié)構(gòu)域(PT)和硫酯酶結(jié)構(gòu)域(TE)。在某些情況下，還包含轉(zhuǎn)甲基酶結(jié)構(gòu)域(CM)和還原酶結(jié)構(gòu)域(R)。部分或完全還原β酮基的還原型聚酮合酶，不含有SAT、PT、TE結(jié)構(gòu)域，但含有β酮脂酰還原酶結(jié)構(gòu)域(KR)、脫水酶結(jié)構(gòu)域(DH)和烯酰還原酶結(jié)構(gòu)域(ER)。

近幾年對真菌聚酮合酶各個(gè)結(jié)構(gòu)域功能的研究為天然聚酮類化合物的程序化合成機(jī)制奠定了重要理論基礎(chǔ)。研究發(fā)現(xiàn)KS結(jié)構(gòu)域控制了最終聚酮化合物的鏈長，并不是延伸次數(shù)。KS結(jié)構(gòu)域與產(chǎn)物甲基化也有著一定的關(guān)系[6]。丙二酰AT結(jié)構(gòu)域在轉(zhuǎn)移丙二酰輔酶A基團(tuán)時(shí)對底物有特異性[7]。硫酯酶結(jié)構(gòu)域(TE)不僅影響聚酮產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)，而且還影響聚酮產(chǎn)物的產(chǎn)量[8]，并決定了產(chǎn)物最后的釋放。PT結(jié)構(gòu)域在聚酮化合物的產(chǎn)生中是必不可少的，并且它控制了產(chǎn)物的F和S環(huán)化模式[6，9]。PT結(jié)構(gòu)域通過特定醛的環(huán)化和芳構(gòu)化將可變的前體轉(zhuǎn)變?yōu)榉€(wěn)定的形式，因而增強(qiáng)了產(chǎn)物的穩(wěn)定性[10]。最近對PksA PT結(jié)構(gòu)域單體的晶體學(xué)研究表明PT催化活性中心由3部分構(gòu)成：入口端的磷酸泛酰巰基乙胺(PPT)結(jié)合區(qū)域、催化口袋底端的疏水乙基結(jié)合結(jié)構(gòu)域和兩者之間的環(huán)化腔。從而在結(jié)構(gòu)上解釋了分子環(huán)化的機(jī)制。SAT結(jié)構(gòu)域特異地選擇起始單元，通過轉(zhuǎn)移起始單元到ACP結(jié)構(gòu)域來起始聚酮化合物的合成[11]。

利用基因敲除和異源表達(dá)等方法，已證明真菌苯二酚內(nèi)酯聚酮代謝物的生物合成是由一對還原型和非還原型的聚酮合酶共同催化完成。還原型聚酮合酶合成聚酮鏈(最終形成苯二酚內(nèi)酯的大環(huán)部分)作為起始單元被轉(zhuǎn)移到非還原型聚酮合酶上，通過非還原型聚酮合酶得到延伸，延伸的聚酮鏈部分不再被進(jìn)一步還原。隨后，非還原型聚酮合酶逐步催化形成苯二酚環(huán)和大環(huán)內(nèi)酯環(huán)。在苯二酚內(nèi)酯中，二羥基苯甲酸內(nèi)酯(RALs)在C2～C7形成苯環(huán)，而二羥基苯乙酸內(nèi)酯(DALs)則在C3～C8形成苯環(huán)[12]。天然RALs內(nèi)酯環(huán)一般為12或14環(huán)(RAL12或RAL14)，例如Monocillin Ⅱ。而DALs內(nèi)酯環(huán)為10或12環(huán)(DAL10或DAL12)。但對于聚酮鏈?zhǔn)侨绾纹鹗?、延長、折疊以及環(huán)化仍有待進(jìn)一步研究。

通過將不同真菌來源的還原型聚酮合酶和非還原型聚酮合酶隨機(jī)重組能夠?qū)崿F(xiàn)一系列“非天然”苯二酚內(nèi)酯類聚酮產(chǎn)物的一步合成[3]。本研究將通過交換不同真菌苯二酚內(nèi)酯合成途徑中非還原型聚酮合酶的起始物?；D(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域(SAT)，并在酵母中與相應(yīng)的還原型聚酮合酶組合表達(dá)，以期合成新的聚酮化合物和發(fā)現(xiàn)起始物酰基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域的識(shí)別規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 菌株與載體

高頻轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10B和釀酒酵母BJ5464為本實(shí)驗(yàn)室保存。大腸桿菌-釀酒酵母兼容性表達(dá)載體YEpADH2-Trp-FLAGLink和YEpADH2-Ura-FLAGLink為本實(shí)驗(yàn)室保存。pJET1.2/blunt高拷貝克隆質(zhì)粒購買于Fermentas公司，具有Amp抗性。

1.2 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

LB培養(yǎng)基：酵母提取物5 g/L、NaCl 10 g/L、胰蛋白胨10 g/L，固體培養(yǎng)基配制時(shí)加入瓊脂15 g/L。

YPD培養(yǎng)基：酵母膏10 g/L、蛋白胨20 g/L、D-葡萄糖20 g/L。

SC二缺培養(yǎng)基：不含氨基酸的酵母基本氮源6.7 g/L，Trp-Ura缺失氨基酸混合物0.72 g/L，D-葡萄糖20 g/L。固體培養(yǎng)基配制時(shí)加入瓊脂20 g/L。

大腸桿菌在LB培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)。釀酒酵母在YPD培養(yǎng)基30℃培養(yǎng)。酵母發(fā)酵使用含1%葡萄糖的YPD培養(yǎng)基；酵母篩選選用合成缺陷型培養(yǎng)基SC基本培養(yǎng)基(Trp-Ura二缺培養(yǎng)基)。

1.3 主要試劑與儀器

DNA聚合酶Phusion Hot Start ⅡHigh-Fidelity DNA Polymerase Kit購自Finnzymes公司；質(zhì)粒提取試劑盒EZ-10 Spin Column plasmid DNA miniPreps Kit購自BIO BASIC INC. 公司；DNA膠回收試劑盒GeneJETTM Gel Extraction Kit、DNA連接試劑盒CloneJETTM PCR Cloning Kit購自Thermo公司，限制性內(nèi)切酶購于NEB公司和Thermo公司。酵母感受態(tài)細(xì)胞制備及酵母轉(zhuǎn)化試劑盒Frozen EZ Yeast Transformation Ⅱ(TZ001) 購自ZYMO RESEARCH公司。引物由Bioneer公司合成。高壓液相色譜儀(Hp Hewlett-Packard Series 1050)為Agilent/Hewlett-Packard公司產(chǎn)品。

1.4 基因克隆

以Genbank中已注釋信息的真菌聚酮合酶基因?yàn)閰⒄?，利用生物信息學(xué)軟件FGENESH和手工相結(jié)合的方法預(yù)測選定基因的內(nèi)含子和外顯子區(qū)域。每個(gè)基因都被設(shè)計(jì)為翻譯起始位點(diǎn)含有NdeⅠ(或AseⅠ)酶切位點(diǎn)，終止子后含有PmeⅠ酶切位點(diǎn)，利用融合PCR的方法將預(yù)測的外顯子組裝在一起合成完整的無內(nèi)含子的基因。融合PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?8℃預(yù)變性30 s；98℃變性10 s，62℃退火20 s，72℃延伸，延伸時(shí)間依產(chǎn)物而定，2 kb/min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。

1.5 酵母表達(dá)載體構(gòu)建

YEpADH2-Trp-FLAGLink和YEpADH2-Ura-FLAGLink為兼容性釀酒酵母表達(dá)載體，其啟動(dòng)子為乙醇脫氫酶誘導(dǎo)啟動(dòng)子，可以起始真菌聚酮合酶基因的表達(dá)。將獲得的選定基因連接到pJET1.2/blunt大腸桿菌高拷貝克隆質(zhì)粒上，測序正確后，使用NdeⅠ(或AseⅠ)和PmeⅠ雙酶切pJET1.2/blunt質(zhì)粒及釀酒酵母表達(dá)載體，將切膠回收的非還原型聚酮合酶基因片段與YEpADH2-Trp-FLAGLink使用T4 DNA連接酶連接，還原型聚酮合酶基因片段與YEpADH2-Ura-FLAGLink載體連接。經(jīng)酶切驗(yàn)證連接正確后用于釀酒酵母的轉(zhuǎn)化。

1.6 SAT結(jié)構(gòu)域的交換

通過融合PCR的方法，將乙醇脫氫酶誘導(dǎo)型啟動(dòng)子ADH2p和終止子ADH2t分別克隆到pXW06和pXK30F上，還原型聚酮合酶基因和非還原型聚酮合酶基因的載體分別命名為pXK30F-nr PKS和pXW06-Red PKS。在實(shí)驗(yàn)室已成功構(gòu)建好的聚酮化合物10，11-dehydrocurvularin和resorcylide 非還原型聚酮合酶AtCurS2和AzResS2表達(dá)質(zhì)粒的基礎(chǔ)上，通過融合PCR的方法將asperfuranone非還原型聚酮合酶AfoE與AtCurS2和AzResS2的SAT結(jié)構(gòu)域進(jìn)行交換。融合PCR擴(kuò)增程序見1.2.1。

1.7 酵母轉(zhuǎn)化

使用Frozen EZ Yeast Transformation Ⅱ(TZ001)試劑盒將構(gòu)建的載體轉(zhuǎn)入到釀酒酵母中，該酵母的染色體上整合有構(gòu)巢曲霉磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶，使其表達(dá)的聚酮合酶具有活性。在Trp和Ura二缺SC培養(yǎng)基上篩選雙質(zhì)粒酵母轉(zhuǎn)化菌落。

1.8 發(fā)酵及產(chǎn)物萃取

分別挑取Trp和Ura二缺SC培養(yǎng)基平板上的2個(gè)菌落，接種到SC二缺液體培養(yǎng)基中至OD600nm=0.8，加入等體積的酵母豐富培養(yǎng)基1%葡萄糖的YPD，發(fā)酵72 h，調(diào)節(jié)菌液的pH至5.0，用等體積的乙酸乙酯萃取發(fā)酵產(chǎn)物，真空低溫蒸餾，用少量的甲醇溶解，14 000 r/min離心10 min，取20 μL用于HPLC分析。

1.9 產(chǎn)物鑒定

采用高效液相色譜法(HPLC)測定發(fā)酵產(chǎn)物。采用Kromasil C18色譜柱(250 mm×4.6 mm， 5 μm，SUPELCO Inc.)。HPLC條件為：采用水(0.1%TFA)/乙腈(0.1%TFA)為流動(dòng)相。0 min：水-乙腈(95∶5)；5 min：水-乙腈(95∶5)；15 min：水-乙腈(5∶95)；20 min：水-乙腈(5∶95)；25 min：水-乙腈(95∶5)。柱溫為室溫；進(jìn)樣量為15 μL；檢測波長300 nm；流速0.8 mL/min。

2 結(jié)果與分析

2.1 真菌苯二酚內(nèi)酯聚酮合酶相似性分析

真菌苯二酚內(nèi)酯由一對多功能結(jié)構(gòu)域組成的模塊化還原型聚酮合酶(HR PKS)和非還原型聚酮合酶 (NR PKS)協(xié)同催化合成。在組成上還原型聚酮合酶各結(jié)構(gòu)域的排列方式為KS-AT-DH-KR-ER-ACP，非還原型聚酮合酶各結(jié)構(gòu)域的排列方式為SAT-KS-AT-PT-ACP-TE(圖1)。不同真菌的HR PKS和NR PKS具有較高的直向同源關(guān)系。以合成苯二酚內(nèi)酯radicicol、dehydro-curvularin、lasiodiplodin和resorcylide的聚酮合酶為例，還原型聚酮合酶氨基酸的一致性為54%～59%，非還原型聚酮合酶氨基酸的一致性為60%～68%。

圖1 苯二酚內(nèi)酯聚酮合酶的結(jié)構(gòu)Fig.1 The structure of fungal benzenediol lactones polyketide synthase.

在構(gòu)巢曲霉Aspergillusnidulans中，聚酮asperfuranone和苯二酚內(nèi)酯具有相似的生物合成途徑，其核心骨架由還原型聚酮合酶AfoG和非還原型聚酮合酶AfoE協(xié)同合成。 AfoE由8 285個(gè)氨基酸組成，疏水性氨基酸占20.64%。將AfoE與參與合成上述苯二酚內(nèi)酯的4個(gè)非還原型聚酮合酶(CcRadS2、AtCurS2、LtLasS2、AzResS2)進(jìn)行序列比對。結(jié)果表明：AfoE與上述4種苯二酚內(nèi)酯非還原型聚酮合酶的序列相似性為50%～51%，其他4個(gè)聚酮合酶之間的序列相似性都達(dá)到60%以上(表1)。AfoE與上述四種苯二酚內(nèi)酯聚酮合酶的差異，有可能通過合成途徑或結(jié)構(gòu)域的重組合成新的聚酮化合物。

2.2 AfoE SAT結(jié)構(gòu)域的互換研究

在苯二酚內(nèi)酯聚酮的生物合成中，利用不同來源的還原型聚酮合酶和非還原型的聚酮合酶重組，或者替換非還原型聚酮合酶的起始物?；D(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域SAT可合成“非天然”的聚酮化合物。

本研究采取了體外克隆絲狀真菌構(gòu)巢曲霉asperfuranone非還原型聚酮合酶afoE基因，并對AfoE的SAT結(jié)構(gòu)域與10，11-dehydrocurvularin和resorcylide 非還原型聚酮合酶AtCurS2和AzResS2的SAT結(jié)構(gòu)域在體外進(jìn)行了交換，形成了新的雜合非還原型聚酮合酶AfoE-SATAtCurS2、AfoE-SATAzResS2、AtCurS2-SATAfoE和AzResS2-SATAfoE。通過重組酵母，分離發(fā)酵產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)土曲霉AtCurS2及AzResS2的SAT結(jié)構(gòu)域不能識(shí)別asperfuranone還原型聚酮合酶AfoG合成的產(chǎn)物，因此沒有新的產(chǎn)物合成。而構(gòu)巢曲霉非還原型聚酮合酶的SAT結(jié)構(gòu)域卻可以識(shí)別10，11-dehydrocurvularin和resorcylide還原型聚酮合酶AtCurS1和AzResS1合成的產(chǎn)物，異源合成新的化合物1～5(圖2)。

表1 真菌苯二酚內(nèi)酯聚酮合酶相似性分析Table 1 Similarity analysis of fungal benzenediol lactones polyketide synthase.

圖2 重組發(fā)酵代謝產(chǎn)物變化Fig.2 Biosynthetic products of S.cerevisiae BJ5464-NpgA coexpressing nrPKS and hrPKS.

這些產(chǎn)物具有苯二酚內(nèi)酯類聚酮典型的紫外吸收光譜。以上結(jié)果表明，除了SAT結(jié)構(gòu)域，非還原型聚酮合酶的其他結(jié)構(gòu)域也對還原型聚酮合酶的產(chǎn)物有選擇利用的能力。鑒于真菌聚酮合酶基因的多結(jié)構(gòu)域的復(fù)雜特性，對于其程序化合成機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

3 討論

在基因組中，合成苯二酚內(nèi)酯的聚酮合酶HR PKS和NR PKS 編碼基因位于同一基因簇上。在構(gòu)巢曲霉中，有一對符合苯二酚內(nèi)酯聚酮合酶特征的基因，非還原型聚酮合酶基因afoE及還原型聚酮合酶基因afoG，但在不同的培養(yǎng)條件下均分離不到聚酮類次生代謝產(chǎn)物，將afoE缺失突變，代謝譜也沒有變化，說明這對基因在培養(yǎng)條件下是沉默的。將這對基因上游轉(zhuǎn)錄因子的啟動(dòng)子更換為可誘導(dǎo)的乙醇脫氫酶啟動(dòng)子alcA(P)后，在誘導(dǎo)條件下可以激活整個(gè)基因簇的表達(dá)，而且能夠檢測到新的聚酮類化合物，命名為asperfuranone[9]，結(jié)構(gòu)鑒定表明其結(jié)構(gòu)中含有一個(gè)高度還原的側(cè)鏈[7]。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明更換基因啟動(dòng)子可以用于激活沉默基因的表達(dá)，并且體外構(gòu)建表達(dá)質(zhì)?？梢钥s短產(chǎn)物生產(chǎn)周期，用于大量次級(jí)代謝產(chǎn)物的組合生物合成中。

非還原型聚酮合酶SAT結(jié)構(gòu)域特異識(shí)別底物，開啟鏈的延伸。研究表明SAT結(jié)構(gòu)域可以識(shí)別與天然底物不同的起始單元。Xu等[1]通過交換不同真菌苯二酚內(nèi)酯非還原型聚酮合酶的SAT結(jié)構(gòu)域，能夠產(chǎn)生新的聚酮化合物或提高產(chǎn)物的產(chǎn)量。Wang等[2]也使用相同策略通過交換絲狀真菌構(gòu)巢曲霉非還原型聚酮合酶AfoE(asperfuranone biosynthesis)和雜色曲霉素聚酮合酶(sterigmatocystin biosynthesis，StcA)的SAT結(jié)構(gòu)域得到一個(gè)StcA-AfoE雜合聚酮合酶，能夠催化產(chǎn)生一種新的主要次級(jí)代謝產(chǎn)物。產(chǎn)物結(jié)構(gòu)鑒定表明非還原型聚酮合酶(NR-PKSs)的SAT結(jié)構(gòu)域可以識(shí)別長度與天然底物不同的起始單元。本研究中，土曲霉AtCurS2及AzResS2的SAT結(jié)構(gòu)域不能識(shí)別asperfuranone還原型聚酮合酶AfoG合成的產(chǎn)物，這可能是由于起始單元太短，不能識(shí)別新的SAT結(jié)構(gòu)域，因此不能產(chǎn)生代謝產(chǎn)物，或者是由于這些次級(jí)代謝產(chǎn)物雖然能夠產(chǎn)生，但由于產(chǎn)量太低，不易檢測到。另一種可能是結(jié)構(gòu)域之間不兼容，因而形成的嵌合體沒有活性。同時(shí)在構(gòu)巢曲霉中，聚酮化合物中間體的甲基化作用也會(huì)影響分子的空間結(jié)構(gòu)。具體原因仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。通過苯二酚內(nèi)酯基因的人工合成、異源表達(dá)以及結(jié)構(gòu)域的交換為人工合成“非天然”次級(jí)代謝產(chǎn)物提供了一種新的方法。這種“即插即用”模塊化方法可應(yīng)用于結(jié)構(gòu)多樣的全新化學(xué)物質(zhì)的組合生物合成，為揭示天然聚酮類化合物的合成機(jī)制奠定了重要的理論基礎(chǔ)。本研究對進(jìn)一步開發(fā)新型聚酮類生物活性物質(zhì)、預(yù)測真菌聚酮合酶基因的功能和提高真菌基因組注釋精度具有重要的參考價(jià)值。

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Combinatorial Biosynthesis of Benzenediol Lactones with Domain Swaps

BAI Jing, LU Wei, XU Yu-quan, CHEN Ming*

BiotechnologyResearchInstitute,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Beijing100081,China

Fungal benzenediol lactones, biosynthesized by a pair of highly reduced polyketide synthases and non-reduced polyketide synthases, have diverse structures and varied biological activities. Fungal polyketide synthases contain multiple functional domains which catalyze the specific structure of final products. We found that unnatural polyketides could be synthesized in the yeastSaccharomycescerevisiaeco-expressing different reduced fungal polyketide synthases and non-reduced polyketide synthases with functional domain swaps. Furthermore, identification pattern of acyltransferase domain was studied and discussed.

polyketide synthases; fungi; benzenediol lactones; biosynthesis

2014-12-16; 接受日期：2014-12-30

轉(zhuǎn)基因生物新品種培育科技重大專項(xiàng)(2014ZX08003-001)；國家863計(jì)劃項(xiàng)目(2012AA02A703)；農(nóng)業(yè)部公益性行業(yè)科研專項(xiàng)(201103007)資助。

白凈，碩士研究生，主要從事次生代謝產(chǎn)物的組合生物合成研究。E-mail：baijing19901028@163.com。*通信作者：陳明，研究員，博士，主要分子微生物生物學(xué)研究。E-mail：chenming01@caas.cn

10.3969/j.issn.2095-2341.2015.01.08