響應(yīng)面優(yōu)化襄荷總黃酮提取及抗氧化研究

許 遠，魏和平，吳 彥，王天華

(安慶師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，安徽安慶246011)

襄荷(Zingiber strioatum)，又名陽荷、洋姜、蓮花姜、洋胡姜等，屬于姜科姜屬多年生草本植物，我國長江流域各省均有野生資源分布，在很多地區(qū)，民間也有種植和食用襄荷的習(xí)慣。據(jù)《中藥大辭典》和《全國蔬菜全科》記載，襄荷具有很高的食用價值和藥用成分，其富含蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素、糖類、有機酸及礦物元素等，具有活血調(diào)經(jīng)、鎮(zhèn)咳祛痰、消腫解毒等功效［1］。另外，襄荷具有特殊芳香氣味，驅(qū)蟲效果明顯，病蟲害很少，極少使用農(nóng)藥，是理想的綠色食品。因此，襄荷已成為一種新型保健蔬菜，亟待開發(fā)。

目前我國對襄荷的研究多集中在栽培［2］、組織培養(yǎng)［3］、快速繁殖［4］和食用資源［1］等方面，對其生物活性方面的研究甚少。黃酮類化合物是廣泛存在于植物中的次生代謝產(chǎn)物［5］，具有抗自由基和抗氧化作用，還有抗癌、抗腫瘤、降血脂、治療心腦血管疾病、鎮(zhèn)痛等藥用保健功能［6］，因此，總黃酮含量已成為保健蔬菜的衡量參數(shù)之一。本文通過超聲波輔助乙醇提取法對襄荷可食用的花苞部分進行了總黃酮測定，并采取響應(yīng)面分析方法對其提取工藝進行優(yōu)化，同時對其提取物的抗氧化性進行研究，旨在為提高襄荷利用價值和進一步開發(fā)這種天然保健蔬菜提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮襄荷花苞，于2013年9月采自安徽省岳西縣山區(qū)，儲存于冰箱(0～4℃)備用。

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(＞98%)，合肥博美生物科技有限責(zé)任公司;DPPH(1，1-二苯基-2-三硝基苯肼)Sigma公司;無水乙醇、鹽酸、亞硝酸鈉、氫氧化鈉、硝酸鋁、抗壞血酸、Tris、鄰苯三酚、三氯乙酸、水楊酸、硫酸亞鐵、鐵氰化鉀、三氯化鐵、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉等均為分析純。

FA2004B電子天平 上海越平科學(xué)儀器有限公司;DZ-2BCⅡ真空干燥箱 天津市泰斯特儀器有限公司;RE-2000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海洪旋實驗儀器有限公司;SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵 鄭州長城科工貿(mào)有限公司;SY-360型臺式數(shù)控超聲波提取機 昆山市超聲儀器有限公司;UV759紫外可見分光光度計 上海佑科儀器儀表有限公司;手提式多功能粉碎機 上海廣沙工貿(mào)有限公司;HHS型電熱恒溫水浴鍋 上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠; SC-3612低速離心機 安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 采用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉顯色法［7］，精密稱取105℃真空干燥至恒重的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品6mg，用70%乙醇溶解并定容至10m L，搖勻，得0.6mg/m L的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液。準(zhǔn)確吸取0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0m L上述標(biāo)準(zhǔn)液分別置于10m L的容量瓶中，加2～4m L蒸餾水，加0.4m L 5%亞硝酸鈉，搖勻，放置6m in，加入0.4m L 10%硝酸鋁，搖勻，放置6m in，加入4.0m L 4%氫氧化鈉，再加蒸餾水至刻度、搖勻，放置15min，以空白試劑作對比參照，在510nm處測定吸光度，得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程:A=3.8367C+0.3438(A為吸光度，C為蘆丁濃度)，R2=0.9978，表明了蘆丁在濃度0～0.3mg/m L之內(nèi)線性關(guān)系良好。

1.2.2 襄荷總黃酮得率測定 將新鮮襄荷花苞洗凈、切碎、烘干，以粉碎機粉碎，過60目篩，制成襄荷粉。準(zhǔn)確稱取10.0g襄荷粉，加入一定量乙醇溶液，選擇一定超聲條件處理后，置70℃水浴中回流提取2h(預(yù)實驗顯示提取溫度達到70℃和提取時間超過2h后，得率變化不大，故此二因素固定)，取出，減壓抽濾濃縮，測定濾液體積。取2m L上述濾液于10m L容量瓶中，以制備標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法，在510nm處測定其吸光度，并利用標(biāo)曲獲得的回歸方程計算襄荷總黃酮得率，重復(fù)三次，取平均值，計算公式如下:

式中:C為提取液中總黃酮濃度(mg/m L);V1為顯色時定容體積(m L);V2為顯色時取樣體積(m L); V為提取液總體積(m);m為原料質(zhì)量(g)。

1.2.3 單因素實驗 以乙醇濃度、液料比、超聲溫度、超聲時間四個因素為研究對象，以襄荷總黃酮得率為指標(biāo)，進行單因素實驗。

1.2.3.1 乙醇濃度對得率的影響 準(zhǔn)確稱取10.0g的襄荷粉5份，分別加入體積分?jǐn)?shù)為50%、60%、70%、 80%、90%的乙醇溶液，以15∶1(m L∶g)的液料比(為溶劑體積(m L):物料質(zhì)量(g)，下同)，在溫度50℃條件下，超聲處理15m in，之后在70℃水浴中回流提取2h。

1.2.3.2 液料比對得率的影響 準(zhǔn)確稱取10.0g的襄荷粉5份，分別以液料比10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1(m L∶g)加入60%乙醇溶液，在溫度50℃條件下，超聲處理15m in后置70℃水浴中回流提取2h。

1.2.3.3 超聲時間對得率的影響 準(zhǔn)確稱取10.0g的襄荷粉5份，以15∶1(m L∶g)的液料比加入體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇溶液，在溫度50℃條件下，分別超聲處理10、15、20、25、30m in后置 70℃水浴中回流提取2h。

1.2.3.4 超聲溫度對得率的影響 準(zhǔn)確稱取10.0g的襄荷粉5份，以15∶1(m L∶g)的液料比加入體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇溶液，分別在溫度40、45、50、55、60℃條件下，超聲處理15m in后置70℃水浴中回流提取2h。

1.2.4 響應(yīng)面法對提取工藝參數(shù)的優(yōu)化與驗證 為分析各影響因素間的交互作用對襄荷總黃酮得率的影響，在單因素實驗結(jié)果的基礎(chǔ)之上，根據(jù) Box-Benhnken中心組合實驗設(shè)計原理，運用 Design Expert 8.0軟件設(shè)計響應(yīng)面實驗，分別選擇乙醇濃度(A)、液料比(B)、超聲時間(C)、超聲溫度(D)作為自變量，以襄荷總黃酮的得率(R1)作為響應(yīng)值設(shè)計響應(yīng)面實驗，因素水平取值見表1。

表1 響應(yīng)面設(shè)計因素和水平Table1 Levels and factors of response surface analysis

1.2.5 襄荷總黃酮抗氧化性實驗 在響應(yīng)面實驗結(jié)果得出的最佳提取條件下獲得襄荷總黃酮提取液，進行總還原能力和對DPPH·、超氧陰離子(O2-·)、羥基自由基(·OH)三者的清除能力測定，分別將提取濃縮液配制成不同濃度梯度的待測溶液，均以抗壞血酸(VC)為對照，比較結(jié)果確定其抗氧化能力。

1.2.5.1 總還原能力的測定 測定方法參照文獻［8］，取2.5m L不同濃度待測液，加入2.5m L 0.2mol/L、pH6.6磷酸緩沖溶液及2.5m L 1%鐵氰化鉀，50℃水浴20m in后急速冷卻，加入2.5m L 10%三氯乙酸溶液，于3000 r/min離心10m in，取上清液5m L，加4m L蒸餾水，及1m L 0.1%FeCl3，混勻后10m in于700nm處測定吸光值表示樣品還原能力，以蒸餾水為空白。

1.2.5.2 DPPH·清除率的測定 測定方法參照文獻［9-10］，取4m L不同濃度待測液，加入4m L濃度為2 ×10-4mol/L的DPPH溶液，搖勻，室溫下避光反應(yīng)30m in，以無水乙醇作對照，于517nm波長處測定吸光度A。對照組以無水乙醇代替DPPH溶液，與待測液混勻，于517nm波長處測定吸光度A1，空白組以上述DPPH溶液與無水乙醇混合后于517nm波長處的吸光度A0。按下式計算其清除率:

式中:A為樣品組吸光度值;A1為對照組吸光度值;A0為空白照組吸光度值。

式中:A為樣品組吸光度值;A1為對照組吸光度值;A0為空白照組吸光度值。

1.2.5.4 羥基自由基(·OH)清除率的測定 測定方法參照文獻［12-13］，取2m L不同濃度的待測液，置于10m L離心管中，分別加入1m L 9mmol/L的FeSO4溶液，2m L 9mmol/L的水楊酸-乙醇溶液，混勻，加入1m L 0.01%的H2O2溶液啟動反應(yīng)，于室溫下反應(yīng)1h，以蒸餾水調(diào)零，于510nm處測定吸光度A。對照組以蒸餾水代替H2O2溶液，于510nm處測定吸光度A1，空白組以蒸餾水代替待測液，于510nm處測定吸光度A0。按下式計算其清除率:

式中:A為樣品組吸光度值;A1為對照組吸光度值;A0為空白照組吸光度值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel(Office 2003)軟件整理數(shù)據(jù)，Design Expert 8.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗結(jié)果

2.1.1 乙醇濃度的選擇 由圖1可以看出:隨著乙醇濃度的升高總黃酮得率上升，達到70%后呈略下降趨勢。根據(jù)相似相溶原理［14］，溶劑與提取物極性達到相似時，提取物較易從植物細胞中溢出，黃酮類物質(zhì)是弱極性化合物，易溶于弱極性溶劑，70%的乙醇溶液極性可能與襄荷黃酮的極性最為相似，故在此濃度下提取率最高。當(dāng)乙醇濃度大于70%時，提取含量略呈下降，可能是隨著乙醇濃度升高，其極性與提取物的極性相差逐漸增大，從而導(dǎo)致溶液對黃酮類化合物溶解度降低，同時一些醇溶性雜質(zhì)、色素、親脂性強的成分等溶出增多，也不利于黃酮類化合物提取，進而影響得率［15］。因此乙醇濃度選用70%為適宜。

2.1.2 液料比的選擇 由圖2可以看出:隨著液料比的增加，襄荷中總黃酮得率不斷增大，原因是隨液料比的增大，濃度差提高，有利于傳質(zhì)，提取越來越充分，但當(dāng)液料比大于20∶1時曲線略有下降并逐漸平穩(wěn)，原因可能是當(dāng)提取溶劑量太大時，黃酮的溶出已基本達到平衡，再增加溶劑量，提取效果并不能明顯提高，同時由于溶劑體積的增大，使得一些非黃酮類的化合物溶解度增大，與黃酮類化合物形成了一定的競爭關(guān)系，從而導(dǎo)致提取含量減少。因此液料比選用20∶1為適宜。

圖1 乙醇濃度對總黃酮得率的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on extraction rate of total flavonoids

圖2 液料比對總黃酮得率的影響Fig.2 Effect of liquid-solid ratio on extraction rate of total flavonoids

2.1.3 超聲時間的選擇 由圖3可以看出:隨著超聲波作用時間的增加，襄荷總黃酮的得率升高;但當(dāng)時間大于20m in后總黃酮得率趨于平穩(wěn)且略有下降?？赡苁浅晻r間太長，會破壞黃酮類化合物的有效結(jié)構(gòu)，使其降解，所以得率反而下降。所以超聲時間選用20min為宜。

圖3 超聲時間對總黃酮得率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic time on extraction rate of total flavonoids

2.1.4 超聲溫度的選擇 由圖4可以看出:隨著超聲溫度的升高總黃酮得率呈上升趨勢，達到50℃后呈下降趨勢。溫度升高到一定程度可能會破壞樣品中黃酮類物質(zhì)的結(jié)構(gòu)造成樣品中黃酮類物質(zhì)的損失，并且會導(dǎo)致提取液的大量揮發(fā)。因而超聲溫度選用50℃為宜。

圖4 超聲溫度對總黃酮得率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic temperature on extraction rate of total flavonoids

2.2 響應(yīng)面法確定襄荷總黃酮的最佳提取條件

2.2.1 響應(yīng)面法實驗設(shè)計及結(jié)果 選擇乙醇濃度(A)、液料比(B)、超聲時間(C)及超聲溫度(D)作為自變量，以襄荷總黃酮的得率(R1)作為響應(yīng)值設(shè)計響應(yīng)面實驗，結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面實驗結(jié)果Table2 Result of response surface design

利用Design Expert8.0軟件對表2的數(shù)據(jù)進行多元回歸分析，擬合后得到A、B、C、D的二次多項回歸模型為:(公式)

對上述方程進行方差分析，結(jié)果如表3所示。

結(jié)果顯示，模型顯著性檢驗p值＜0.0001，為極顯著，失擬項p值為0.3181＞0.05，不顯著，無失擬因素存在。該回歸方程相關(guān)系數(shù)R2=0.9990，校正決定系數(shù)R=0.9979，說明該模型能夠解釋99.90%的變化，因變量與所選自變量之間線性關(guān)系顯著。以上證明該模型與實驗擬合度良好，可用該回歸方程代替真實實驗對實驗結(jié)果進行預(yù)測和分析。

模型的一次項A、B、C、D為極顯著;二次項A2、B2、C2、D2為極顯著;交互項AB、AC、BD為極顯著，AD、CD為顯著，BC不顯著，由此可知，自變量與響應(yīng)值之間不是簡單的線性關(guān)系。通過F值可知，各單因素對襄荷總黃酮得率的影響程度依次為:液料比＞超聲溫度＞乙醇濃度＞超聲時間;各兩因素交互作用對襄荷總黃酮得率的影響程度依次為:液料比和乙醇濃度＞乙醇濃度和超聲時間=液料比和超聲溫度＞乙醇濃度和超聲溫度＞超聲時間和超聲溫度＞液料比和超聲時間。

2.2.2 響應(yīng)面分析 圖5是按所得數(shù)學(xué)模型繪制的響應(yīng)曲面圖，各因素的交互作用效應(yīng)可以從響應(yīng)曲面的坡度變化及其等高線得到反映。響應(yīng)面曲面的坡度直接反映了在處理條件下發(fā)生變化時襄荷總黃酮得率的響應(yīng)靈敏程度，如坡度相對平緩，響應(yīng)值不敏感;反之，如坡度相對陡峭，響應(yīng)值敏感。響應(yīng)值隨哪種因素的變化率更大，說明此因素在二者交互作用中對襄荷總黃酮得率的影響更大。等高線為橢圓形，說明兩因素交互作用顯著，若偏圓形，說明不太顯著。

例如，從圖5a可知，其等高線為橢圓形，說明乙醇濃度和液料比交互作用顯著;響應(yīng)面坡度較為陡峭，響應(yīng)值隨液料比的變化率大于乙醇濃度的變化率，說明在二者交互作用中液料比對總黃酮得率影響大于超聲時間。而從圖5d可知，其等高線偏圓形，說明液料比和超聲時間交互作用不太顯著;響應(yīng)面坡度相對平緩，響應(yīng)值隨液料比的變化率大于超聲時間的變化率，說明在二者交互作用中液料比對總黃酮得率影響大于超聲時間。綜合所有響應(yīng)面圖分析，液料比和乙醇濃度的交互作用最顯著，乙醇濃度和超聲時間、液料比和超聲溫度次之，乙醇濃度和超聲溫度、超聲時間和超聲溫度再次，液料比和超聲時間最不顯著，其中液料比和超聲溫度較之乙醇濃度和超聲時間對響應(yīng)值的影響更大，此結(jié)果與模型中F值分析結(jié)果一致。

2.2.3 條件優(yōu)化 根據(jù)響應(yīng)面分析表明:最佳提取工藝?yán)碚撝凳且掖紳舛?0.53%，液料比20.98∶1

(m L∶g)，超聲時間20.61m in，超聲溫度50.56℃?？紤]到實際操作的便利，將襄荷中總黃酮提取的最佳工藝條件修正為:乙醇濃度 71%，液料比 21∶1 (m L:g)，超聲時間21m in，超聲溫度51℃。按照修正后的條件下進行3次驗證實驗，結(jié)果如表4所示，襄荷總黃酮得率實驗值為4.50%，與預(yù)測值4.51%接近，表明實驗結(jié)果理想，實驗?zāi)Ｐ瓦x擇合理。

表3 回歸模型方差分析Table3 Variance analysis of regression model

圖5 各因素對總黃酮得率影響的響應(yīng)面分析Fig.5 Responsive surface plot for the effect of factors

表4 實驗驗證響應(yīng)面優(yōu)化條件Table4 Conformation results of the optimized extraction conditions

2.3 抗氧化實驗的結(jié)果分析

2.3.1 總還原能力實驗結(jié)果 如圖6所示，襄荷總黃酮樣品的還原能力隨濃度的增大不斷增強，且增幅逐漸增大，不斷接近VC還原能力，可見其具有非常強的還原力。

圖6 樣品與VC還原能力比較Fig.6 Comparison of reducing power on sample with Vitamin C

2.3.2 清除 DPPH·實驗結(jié)果 如圖7所示，VC清除DPPH·能力隨濃度上升而增大，當(dāng)濃度為15μg/m L時，清除率已達到94.63%，繼續(xù)增大濃度后清除率無顯著變化，襄荷總黃酮樣品對DPPH·的清除能力隨濃度的增大呈明顯增長趨勢，可見其對DPPH·有較強的清除能力。

圖7 樣品與VC清除DPPH·能力比較Fig.7 Comparison of DPPH·radical scavenging activity on sample with Vitamin C

圖8 樣品與VC清除超氧陰離子(O·)能力比較Fig.8 Comparison of superoxide radical scavenging activity on sample with Vitamin C

2.3.4 清除羥基自由基(·OH)實驗結(jié)果 如圖9所示，VC在0.3mg/m L到0.7mg/m L的濃度范圍內(nèi)，對羥基自由基(·OH)始終保持很高的清除能力，清除率幾乎達到100%，襄荷黃酮樣品在低濃度時對羥基自由基(·OH)的清除能力與VC相差較多，但隨著濃度的上升，其清除能力顯著增強，在濃度為0.7mg/m L時清除率達到92.1%，表明其對羥基自由基(·OH)有較強的清除能力。

圖9 樣品與VC清除羥基自由基(·OH)能力比較Fig.9 Comparison of hydroxyl radical scavenging activity on sample with Vitamin C

3 結(jié)論與討論

乙醇是提取黃酮的優(yōu)良有機溶劑之一［16］，超聲波的空化作用可充分破壞植物細胞，加速胞內(nèi)物質(zhì)釋放溶解，增大提取效率［17-18］。如許效群等在提取苦蕎米糠總黃酮研究中發(fā)現(xiàn)，超聲波輔助提取率較之水浴法提取率大大提高［16］，蔣少華等在洋蔥皮中類黃酮不同提取工藝的比較研究結(jié)果顯示，超聲波法較之回流法可加速和提高黃酮提取率，較之微波提取法對設(shè)備的要求更為簡單［19］。此外，利用響應(yīng)面分析方法進行最佳工藝條件優(yōu)化，可克服傳統(tǒng)正交實驗只能給出最佳因素水平組合而無法找出整個區(qū)域上因素的最佳組合和最優(yōu)值的缺陷［20］，許多學(xué)者均使用響應(yīng)面法優(yōu)化植物有效成分的提取工藝得到了較為準(zhǔn)確的工藝參數(shù)［21-23］，如常麗新等利用響應(yīng)面法優(yōu)化了玉米芯黃酮的提取工藝［22］。故本文采用超聲波輔助乙醇提取法提取襄荷總黃酮，根據(jù)中心組合設(shè)計原理，采用4因素3水平的響應(yīng)面分析，得出了襄荷總黃酮的最佳提取工藝條件:乙醇濃度為71%，液料比為21∶1(m L∶g)，超聲時間為21min，超聲溫度為51℃。在最佳提取工藝條件下測得襄荷花苞總黃酮含量為4.50%。大量研究發(fā)現(xiàn)，黃酮含量高的蔬菜，具有預(yù)防心腦血管疾病、抗衰老、抗氧化、增強細胞免疫力和預(yù)防腫瘤等功效［24］，本研究抗氧化實驗也證明，襄荷總黃酮具有很好的還原能力，對DPPH·和羥基自由基(·OH)具有較強的清除能力，對于超氧陰離子(O·)也具有一定的清除能力，抗氧化效果總體表現(xiàn)良好。因此，襄荷可作為新型保健蔬菜進行深度開發(fā)。

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