Cellic CTec2水解常壓甘油自催化預處理麥草的特性探討

譚 玲，王 亮，燕 紅，戴一凡，周邦煒，林巧文，鄭志永，張震宇，孫付保，*

(1.江南大學生物工程學院，糖化學與生物技術教育部重點實驗室，江蘇無錫214122; 2.山東大學微生物技術國家重點實驗室，山東濟南250100; 3.哈爾濱理工大學化學與環(huán)境工程學院，黑龍江哈爾濱150040)

纖維素酶的應用非常廣泛，可用于輔助處理淀粉質原料來生產(chǎn)飼料、酒精、果蔬汁和啤酒等。在果蔬汁的提取純化方面，纖維素酶能夠破壞植物細胞壁，增加果汁的產(chǎn)率，縮短生產(chǎn)時間，并且壓榨之后能使果漿部分或是完全液化。在啤酒釀造方面，能增加過濾速度，減少截留時間，降低粘度，達到節(jié)約能源的效果［1-2］。

另一方面，纖維素酶水解木質纖維素生產(chǎn)生物燃料或者其它產(chǎn)物一直是生物領域研究的熱點。木質纖維素的利用主要包括預處理和酶解兩個步驟，其中預處理方法包括:稀硫酸、稀堿、熱水、汽爆、液氨、生石灰、有機溶劑和離子液等［3-4］。在前期工作中，本實驗室建立了一種高沸點有機溶劑預處理—常溫甘油自催化預處理，該方法能通過解離纖維質復雜的組成結構而提高酶解效率［5］。在酶解方面，纖維素酶是影響該過程成本的關鍵因素之一［6-7］，于是國內外許多研究者開展纖維素酶制劑應用酶解的工作。江新德等［8］和劉?。?］分別探討了Celluclast 1.5L水解園藝廢棄物和舊紙板紙漿的特性。趙鵬飛等發(fā)現(xiàn)CTec2能夠高效酶解乳酸預浸漬和蒸汽爆破預處理的小麥秸稈，以及磷酸預浸蒸汽爆破玉米秸稈［10-11］，并提高基質同步糖化發(fā)酵的產(chǎn)量［12-13］，該研究顯示CTec2能夠水解不同來源的木質纖維素，具有較好的基質適應性。然而，這些研究都屬于CTec2的直接利用，有待開展該酶以及與其它纖維素酶相比較的系統(tǒng)研究。因此，本文以常壓甘油自催化預處理麥草作為基質，通過與其它三種商業(yè)纖維素酶相比較，考察CTec2水解效果、酶活特征和高濃水解以及添加劑對CTec2高濃度基質酶解的影響，詳細研究CTec2對天然木質纖維素基質的水解特性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

風干小麥秸稈 來自河南南陽，剪成2cm左右的小段，60℃烘干到恒重，儲存于實驗塑料袋中備用;工業(yè)甘油 購自河北省衡水京華化工有限公司，濃度為95%，用于預處理時稀釋到70%;纖維素酶Cellic CTec2、Celluclast 1.5 L由諾維信(中國)投資有限公司饋贈，纖維素酶GC220和Spezyme-CP 購自無錫杰能科生物工程有限公司。

加熱套 上海勒頓實業(yè)ZNHW(500m L)加熱套;酶標儀 美國，美谷分子SpectraMax Plus384。

1.2 實驗方法

1.2.1 常壓甘油自催化預處理 取10g烘干的麥草于圓底燒瓶中，加入200g濃度為70%的甘油水溶液，用加熱套加熱到220℃后保持3h。自然冷卻到120～130℃，緩緩加入150m L去離子水并不斷攪拌。1號砂芯漏斗趁熱過濾，用40%的熱甘油水溶液洗兩次后再用去離子水洗兩次。處理后的麥草分為兩部分，一部分60℃烘干到恒重用來測量含水量，另一部分冷凍保藏用于后續(xù)酶解［14］。

1.2.2 預處理麥草的酶解 基質濃度為2%時，稱取相當于0.3g干重的常壓甘油自催化預處理麥草濕基于150mL三角瓶中，分別按每克纖維多糖添加15mg酶蛋白(12.5FPU)加入纖維素酶 CTec2、Celluclast 1.5L、GC220和Spezyme-CP，然后補加緩沖溶液到15g，放置溫度50℃和轉速120r/min水浴搖床上進行酶解。在24、48和72h時分別取樣，測量酶解率。當基質濃度為15%時，稱取相當于2.25g干重的基質和相應酶載量的CTec2，其余操作同上。本實驗均為2個重復。

1.2.3 纖維素酶之間的協(xié)同作用 四種纖維素酶CTec2、GC220、Celluclast 1.5L和Spezyme-CP按酶蛋白用量1∶1兩兩復合，按總酶載量為15mg/g纖維多糖以2%常壓甘油自催化預處理麥草進行酶解，考察四種纖維素酶之間的協(xié)同作用。

1.2.4 添加劑對酶解的影響 添加劑種類的選擇:配成底物濃度為15%，酶載量為8mg/g的酶解體系，然后按0.05g/g基質分別加入PEG系列(PEG1000，PEG2000，PEG4000，PEG6000，PEG10000)、吐溫系列(吐溫20、吐溫40、吐溫60、吐溫80)和BSA。在選擇添加劑濃度時，在上述酶解體系中分別加入不同濃度(0.001，0.025，0.05，0.1g/g)PEG10000、吐溫20和BSA進行酶解以選擇適宜的添加劑濃度。

1.3 測定方法

1.3.1 麥草組分測定方法 麥草的纖維素、半纖維素以及木質素的含量參照國際能源部實驗室［15-16］和華南理工大學［17-18］的方法進行測定。

表1 常壓甘油自催化預處理前后麥草的主要組成變化Table1 Main composition ofwheat straw before and after atmospheric glycerol pretreatment

1.3.2 纖維素酶蛋白含量 根據(jù)李紅武［20］和蔡紅［21］所用的茚三酮比色法測定酶蛋白質含量。

1.3.3 還原糖測定方法 還原糖測定用DNS法［22］，根據(jù)姚明靜的方法［23］加以改進。具體為:吸光值的測定改用酶標儀，保持同批次測量結果一致性的同時大大節(jié)省了工作量。

1.3.4 酶活測定方法 濾紙酶活(FPA)根據(jù)國際理論應用化學協(xié)會推薦的國際標準方法進行測定［23］。β-葡萄糖苷酶酶活(BG)和CMC酶活的測定根據(jù)Nieves方法進行測定［24］。酶活定義:酶于 50℃和pH4.8條件下，每分鐘水解0.5000g標準基質生成1μmol葡萄糖所需的酶量定義為一個酶活單位［25］。

1.3.5 數(shù)據(jù)分析方法 酶解率=［(15 W酶解后)/ρ上清］C測/［C總2.25 ×1.111］

式中:W酶解后:酶解液中的基質干重，ρ上清:酶解液上清的密度，C測:酶解液中還原糖濃度，C總:預處理麥草中的纖維多糖濃度(0.8014g纖維多糖/g基質)。

實驗數(shù)據(jù)均用Excel軟件處理。

2 結果與分析

2.1 幾種代表性商業(yè)纖維素酶制劑的比較

為了比較 CTec2和其它三種商業(yè)纖維素酶(Celluclast 1.5L、GC220和Spezyme-CP)水解常溫甘油自催化預處理麥草的酶解率，本實驗在相同濾紙酶活(12.5U/g纖維多糖)和相同蛋白載量(15mg/g纖維多糖)情況下，用四種商業(yè)纖維素酶分別酶解了2%預處理麥草。如圖1所示，四種商業(yè)纖維素酶水解預處理麥草產(chǎn)糖量在48h之前隨著時間的延長而增長，48h之后水解率沒有明顯變化。由圖1a可知相同濾紙酶活條件下，CTec2的水解率明顯高于其它三種纖維素酶，在48h達到78.4%，為最高水解率，繼續(xù)往后水解，基質水解率沒有提高。CP的水解效果次之，1.5L和GC220的水解率較差，水解48h在54%左右。圖1b顯示，在相同酶蛋白載量情況下，CTec2在48h時酶解效果明顯好于其它三種纖維素酶，高達71.5%，但其它三種纖維素酶比較低，在48h時不到40%。這些數(shù)據(jù)表明，纖維素酶制劑Ctec2更適用于常壓甘油自催化預處理麥草的酶解，在相同濾紙酶活時該酶水解常壓甘油自催化預處理麥草的酶解率高，可能是該酶制劑中存在一些非纖維素酶蛋白，它們在該酶水解時起著積極作用，也可能是該酶的纖維素酶蛋白之間存在較好的協(xié)同作用。

圖1 四種商業(yè)纖維素酶水解常壓甘油自催化預處理麥草的比較Fig.1 Comparison of four cellluase preparations acting on atmospheric glycerol pretreated wheat straw at an equal loading

2.2 商業(yè)纖維素酶制劑的酶活分析

上面實驗數(shù)據(jù)顯示，在相同濾紙酶活或蛋白含量條件下CTec2酶解效果遠高于其它三種商業(yè)纖維素酶。為了探究其原因，我們對這四種商業(yè)纖維素酶一些酶活進行了測定。表2為四種商業(yè)纖維素酶CTec2、GC220、Celluclast 1.5 L和 Spezyme-CP的CMC酶活、β-葡萄糖苷酶活力、濾紙酶活、蛋白含量以及比活力。由表2可知，四種商業(yè)纖維素酶中，單位體積的CTec2蛋白含量最高，達到197.08 mg/m L。單位CTec2蛋白的濾紙酶活和β-葡萄糖苷酶酶活和CMC酶活分別為0.62、0.73、11.02U/mg，其中濾紙比酶活和BG比酶活是四種商業(yè)纖維素酶中最高的。值得關注的是Ctec2的CMC比酶活力不高，結合前面這些酶對天然木質纖維素基質水解來看，合理纖維素酶蛋白種類和比例才可能是木質纖維素基質高效水解的關鍵，這些酶蛋白之間通過協(xié)同作用實現(xiàn)了整個纖維素酶制劑對纖維基質的高效水解，這可能是上面Ctec2在甘油預處理纖維基質上表現(xiàn)出優(yōu)于其它三種酶制劑水解性能的重要原因。

表2 各種商業(yè)纖維素酶的酶活分析Table2 Specific activity and protein loading of four commercial celluclases

2.3 商業(yè)纖維素酶之間的協(xié)同性

圖2 四種商業(yè)纖維素酶兩兩之間的協(xié)同作用Fig.2 Synergy of four different commercial cellulases

據(jù)報道，不同商業(yè)纖維素酶按照1∶1比例復合后能夠提高酶水解基質的效率［26］，為此本實驗把這四種商業(yè)纖維素酶兩兩復合，考察復合酶水解甘油預處理基質的酶解率。圖2為CTec2、GC220、Celluclast 1.5LSpezyme-CP在總酶載量為15mg/g葡聚糖的條件下按酶蛋白量1∶1兩兩復合酶解2%基質濃度的酶解。三組含有CTec2的纖維素酶組合，其水解率明顯高于其它三組，但是都低于相同蛋白含量的CTec2酶解率。說明CTec2酶解率比另外三個纖維素酶好，而且與其它三種纖維素酶制劑沒有協(xié)同性，這可能是因為CTec2中各種單酶的比例已經(jīng)是四種商業(yè)纖維素酶中最佳的，再與其它纖維素酶混合打亂了其中各種單酶的比例，從而不能更好的協(xié)同酶解木質纖維素。另外，實驗結果還顯示在相同酶載量時，GC220、CP和1.5L兩兩之間復合水解的酶解率也低于它們單一的酶解率，這表明商業(yè)纖維素酶在制備時可能已考慮到了關鍵纖維素酶蛋白組分間的協(xié)同性，早期商業(yè)纖維素酶制劑的酶解能力不如Ctec2，這些酶制劑組分的合理配比可能不是重要因素，主要可能是由于這些酶制劑中與木質纖維素水解密切相關的關鍵酶蛋白含量(EG、CBH和BG;EX和BX)不夠，提高這些關鍵性酶蛋白組分在整個纖維素酶制劑中比例可能是提高酶制劑水解潛能的關鍵途徑［27］。

2.4 CTec2酶解高濃基質的特性

圖3 酶載量對高濃基質水解的影響Fig.3 Effect of enzyme loading on high consistency hydrolysis of lignocellulose

纖維素酶在髙基質濃度條件下的酶解(高濃酶解)具有以下優(yōu)點:獲得更高的糖濃度從而增加產(chǎn)物含量;減少工業(yè)生產(chǎn)中能量和水的消耗;降低后續(xù)水解液中產(chǎn)品濃縮和提純的運行成本［28］。前面實驗結果顯示，CTec2在低基質濃度(2%)的條件下能高效水解常壓甘油自催化預處理麥草，48h酶解率達到71.5%。為此，本實驗探究了CTec2對10%、15%和20%高基質濃度常壓甘油預處理麥草酶解特性。從圖3可以看出:相同的酶載量時，基質液化時間隨著濃度增加而延長，酶解率隨著基質濃度的增加而減少;相同基質濃度時，酶解率隨著酶載量的增加而增加。圖3a顯示，在10%濃度基質上酶載量為10、15、20mg/g纖維多糖時對應的72h酶解率分別達到58.9%、61.7%和62.9%，相對應地，其它三種酶表現(xiàn)為未液化或僅部分液化(數(shù)據(jù)未顯示)。當基質濃度為20%時預處理麥草水解率明顯降低，酶載量20mg/g纖維多糖時的72h酶解率僅為44.80%，比10%時低18.11%。這可能是因為在過高的基質濃度導致基質粘度增加，產(chǎn)生流體力學問題，導致酶和底物的接觸(吸附解吸)變得困難，從而影響了纖維素酶的水解效率［29］。由于在基質濃度為10%時，基質很容易液化(24h內液化)，而基質濃度為20%時，基質很難液化(48h都不液化)，故本實驗在15%基質濃度下增加了幾個酶載量的探索。實驗表明，在15%基質濃度水平，隨著酶載量從5mg/g纖維多糖增加到20mg/g纖維多糖，72h預處理麥草的酶解率從34.8%增加到了64.5%。酶載量為8mg/g纖維多糖時，72h酶解率達到39.06%，且36h時基質已經(jīng)完全液化，有利于后續(xù)時間中CTec2和纖維素的接觸。考慮高基質濃度和低酶載量的問題，我們選取基質濃度15%、酶載量8mg/g作為后面了解CTec2水解高濃基質特性的條件。

2.5 添加劑對CTec2酶解的影響

已有文獻報道，高分子聚合物、表面活性劑和非催化作用的蛋白質等能夠極大提高木質纖維素基質酶解的水解率，降低纖維素酶的載量［30-31］。其中吐溫系列和聚乙二醇系列是實驗室最常用的非離子型表面活性劑。因此，本實驗探究了吐溫系列、PEG系列和BSA對CTec2酶解高濃基質的影響。

2.5.1 添加劑種類的影響 圖4為不同種類的添加劑對CTec2在酶載量8mg/g葡聚糖時水解15%基質濃度常壓甘油自催化麥草的影響。從圖中可以看出，PEG的添加影響最大，比不添加任何添加劑時提高了50%以上，但PEG的不同分子量對酶解影響沒有明顯差異。Kristensen用不同分子量PEG作添加劑，發(fā)現(xiàn)隨著分子量的增加，纖維素轉化率稍有提高［32-33］，也和本實驗結果是一致的。PEG的作用機制主要是依靠疏水作用結合在木質纖維素中木質素上，減少木質素對纖維素酶的無效吸附，從而提高了纖維素酶的有效吸附，最終提高了酶解率［34］。

圖4 各種添加劑對酶解的影響Fig.4 Effect of various additives on enzymatic hydrolysis ofwheat straw

同時，通過添加吐溫系列于水解體系中發(fā)現(xiàn)，Tween20在添加量0.05g/g基質時基質的72h酶解率提高到55.6%，比不添加時提高了42.5%。W illiam也指出，吐溫在高基質濃度(玉米秸稈)下更能提高基質的酶解率，其機制是吐溫可以防止酶的熱失活、破壞木質纖維素的結構［35］。Eriksson研究認為Tween20能夠降低酶在木質纖維表面的吸附，大約從90%降低為80%，而且其還能夠提高纖維素酶的穩(wěn)定性［36］。

按0.05g/g基質添加BSA使得基質72h水解率達到54.0%，比未添加的提高了38.3%，相似的結果也被其他研究者報道。王新明在用纖維素酶(40U/g秸稈)水解稀硫酸和氫氧化鈉處理的麥秸時，發(fā)現(xiàn)添加牛血清蛋白0.04g反應48h時，還原糖得率分別提高30%和22%［37］。Brethauer發(fā)現(xiàn)添加BSA使稀酸預處理玉米秸稈72h水解率增加了26%，認為BSA有助于纖維素酶水解的機制是減少纖維素酶失活、降低纖維素結晶度和基質顆粒大?。?8］。還有些研究者也認為，BSA通過吸附在木質素上阻止了木質素在這些位點上對纖維素酶的無效吸附［39］，BSA也能激活和協(xié)調纖維素酶復合酶系，加速酶在基質上的吸附和解吸［37］。

圖5 添加劑濃度(g/g基質)對CTec2酶解的影響Fig.5 Effect of additive concentration(g/g substrate) on hydrolysis of glycerol pretreated wheat straw with Ctec2

2.5.2 添加劑濃度的影響 既然PEG10000、吐溫20和BSA均能提高纖維素酶酶解，本實驗就對這些添加劑使用濃度進行了初步選擇。由圖5所示，三種添加劑濃度低于0.05g/g基質時，酶解率隨著添加劑濃度的增加而升高，超過0.05g/g基質之后，酶解率變化不明顯，所以本實驗中選取0.05g/g基質為三種添加劑的適宜添加量，72h的酶解率分別提高了55.3%(PEG10000)、42.5%(吐溫 20)和 38.3% (BSA)。初步分析認為三種添加劑通過吸附到木質素表面防止了酶與木質素結合引起失活，提高了纖維素酶有效利用率;但是當添加劑濃度進一步增大時木質素表面的結合位點基本被飽和，故進一步增加添加劑也不會提高酶解的糖化率［40］。

3 結論

3.1 與早期的商業(yè)纖維素酶制劑GC220、CP和1.5L相比，Ctec2更適用于常壓甘油自催化預處理木質纖維素基質水解。像其它三種酶制劑一樣，該酶制劑組成及其比例是相對合適的，不但它的蛋白含量高，而且酶蛋白比活力很高，這可能是它優(yōu)于其它三種酶的根本原因。

3.2 與其它三種商業(yè)酶制劑相比，Ctec2的顯著優(yōu)勢是酶載量低于10mg/g(纖維多糖)時48h內能使10%～15%濃度基質液化，15%基質濃度(酶載量8mg/g纖維多糖)時72h酶解率將近40%，而相同條件下的其它三種酶幾乎不能使基質液化。Ctec2適用于木質纖維素基質的高濃水解，是一款可以應用于纖維素乙醇工業(yè)的新型酶制劑。

3.3 Ctec2像其它纖維素酶制劑一樣，添加一些輔助因子，如吐溫、PEG和BSA，能顯著提高其木質纖維素基質水解率。這些添加劑價格相對便宜，建議在CTec2的工業(yè)應用中適當添加相應的添加劑。

［1］祖彩霞.里氏木霉Trichoderma reesei生產(chǎn)纖維素酶的研究［D］.上海:華東理工大學，2010.

［2］Galante Y M，De Conti A，Monteverdi R.APPlieation of Triehoderma enzymes in food and feed industries［J］.Biological Control and Commercial Applications，1998，2:327-342.

［3］Eggeman T，Elander R.Process and economic analysis of pretreatment technologies［J］.Bioresource Technology，2005，96 (18):2019-2025.

［4］雪金勇，馬曉建，李肖斌，等.利用纖維素作物生產(chǎn)乙醇預處理技術［J］.食品工業(yè)科技，2008，8:310-312.

［5］Sun F B，Chen H Z.Enhanced enzymatic hydrolysis of wheat straw by aqueous glycerol pretreatment［J］.Bioresource Technology，2008，99:6156-6161.

［6］馮月，蔣建新，朱莉偉，等.表面活性劑Tween 80及皂莢皂素對纖維素酶活力促進作用的研究［J］.林產(chǎn)化學與工業(yè)，2009，29:154-158.

［7］王曉輝，王文雅，袁齊朋，等.H2O2催化預處理對玉米芯酶解的影響［J］.食品工業(yè)科技，2011，10:268-272.

［8］江新德，信豐學，葉俊余，等.綠色木霉EU2-77纖維素酶對園藝廢棄物的酶解特性分析［J］.廈門大學學報，2011，50 (5):890-895.

［9］劉俊.生物酶處理提高舊箱紙板紙漿及其成紙性能［J］.造紙化學品，2011，30(3):29-34.

［10］趙鵬翔，吳毅，趙正凱.乳酸預浸漬對小麥秸稈蒸汽爆破預處理效果的影［J］.可再生能源，2013，31(12):93-96.

［11］趙鵬翔，趙正凱.磷酸預浸蒸汽爆破玉米秸稈生產(chǎn)纖維素乙醇［J］.釀酒科技，2013，10:34-37.

［12］趙鵬翔，吳毅，趙正凱.稀硫酸預浸漬對玉米秸稈蒸汽爆破預處理的影響［J］.化學與生物工程，2013，30(5):67-71.

［13］趙鵬翔，吳毅，趙承宇，等.乙酸預浸漬用于小麥秸稈蒸汽預處理生產(chǎn)纖維素乙醇［J］.中國釀造，2013，32(3):70-75.

［14］Sun FB，Chen HZ.Enhanced enzymatic hydrolysis of wheat straw by aqueous glycerol pretreatment［J］.Bioresource technology，2008，99(14):6156-6161.

［15］Sluiter A，Hames B，Ruiz R，etal.Determination of structural carbohydrates and lignin in biomass［J］.LAP-002 NREL Analytical Procedure，National Renewable Energy Laboratory Golden.2008.

［16］賈飛，恤海艷，關轉飛，等.無機金屬鹽和過氧化物對酸處理玉米秸稈纖維素和半纖維素降解的影響［J］.食品工業(yè)科技，2011，32(10):349-357.

［17］姚明靜.非離子表面活性劑對纖維素酶促糖化的影響［D］.廣東:華南理工大學，2012.

［18］劉沙沙，李靜梅，吳穎，等.酶法降解小麥秸稈堿預處理濃度的選擇及酶解產(chǎn)物的檢測［J］.食品工業(yè)科技，2013，4: 180-183.

［19］Sun FB，Chen HZ.Comparison of atmospheric aqueous glycerol and steam explosion pretreatments of wheat straw for enhanced enzymatic hydrolysis［J］.Journal of Chemical Technology＆Biotechnology，2008，83(5):707-714.

［20］李紅武，王璐，周桂園，等.用茚三酮顯色反應測定煙草中氨基酸含量［J］.安徽農業(yè)科學，2010，38(27):14926-14928.

［21］蔡紅，沈仁芳.改良茚三酮比色法測定土壤蛋白酶活性的研究［J］.土壤學報，2005，2:306-313.

［22］徐忠，楊汪姜.大豆秸稈纖維素酶水解條件的研究［J］.食品工業(yè)科技，2004，3:58-59.

［23］Ghose T K.Measurement of cellulase activities［J］，Pure and Applied Chemistry，1987，59:257-268.

［24］Nieves RA，Ehrman CI，AdneyWS，etal.Survey and analysis of commercial cellulase preparations suitable for biomass conversion to ethanol［J］.World Journal of Microbiology and Biotechnology，1997，14(2):301-304.

［25］程旺開，闞清華.高溫預處理稻草秸稈條件的優(yōu)化［J］.食品工業(yè)科技，2013，14:212-215.

［26］馮月，蔣建新，朱莉偉，等.纖維素酶活力及混合纖維素酶協(xié)同作用的研［J］.北京林業(yè)大學學報，2009，31:169-173.

［27］馮月.木霉菌株產(chǎn)酶培養(yǎng)及其待定底物酶解過程研究［D］.北京:北京林業(yè)大學，2012.

［28］Modenbach AA，Nokes SE.Enzymatic hydrolysis of biomassat high-solids loadings-A review［J］.Biomass and Bioenergy，2013，56:526-544.

［29］J?rgensen H，Vibe-Pedersen J，Larsen J，et al.Liquefaction of lignocellulose at high-Solids concentrations［J］.Biotechnology and bioengineering，2007，96(5):862-870.

［30］Kumar R，Wyman CE.Effect of additives on the digestibility of corn stover solids following pretreatmentby leading technologies［J］.Biotechnology and bioengineering，2009，102(6):1544-1547.

［31］孫付保，婁秀平，洪嘉鵬，等.非離子表面活性劑對木質纖維素酶解的促進作用［J］.化工進展，2011，30(12):2719-2723.

［32］Kristensen JB，B?rjesson J，Bruun MH，et al.Use of surface active additives in enzymatic hydrolysis of wheat straw lignocellulose［J］.Enzyme and Microbial Technology，2007，40 (4):888-895.

［33］B?rjesson J，Peterson R，Tjerneld F.Enhanced enzymatic conversion of softwood lignocellulose by poly(ethylene glycol) addition［J］.Enzyme and Microbial Technology，2007，40(4): 754-762.

［34］B?rjesson J，Engqvist M，Sipos B，et al.Effect of poly (ethylene glycol)on enzymatic hydrolysis and adsorption of cellulase enzymes to pretreated lignocellulose［J］.Enzyme and Microbial Technology，2007，41(1-2):186-195.

［35］Kaar WE，Holtzapple MT.Benefits from Tween during enzymic hydrolysis of corn stover［J］.Biotechnology and bioengineering，2000，59(4):419-427.

［36］Eriksson T，B?rjesson J，Tjerneld F.Mechanism of surfactant effect in enzymatic hydrolysis of lignocellulose［J］.Enzyme and Microbial Technology，2002，31(3):353-364.

［37］王新明，王聯(lián)結，于猛.牛血清蛋白對纖維素酶水解小麥秸稈的影響［J］.食品工業(yè)科技，2012，19:194-200.

［38］Brethauer S，Studer MH，Yang B，et al.The effect of bovine serum albumin on batch and continuous enzymatic cellulose hydrolysis mixed by stirring or shaking［J］.Bioresource technology，2011，102(10):6295-6298.

［39］Palonen H，Tjerneld F，Zacchi G，et al.Adsorption of Trichoderma reesei CBH I and EG II and their catalytic domains on steam pretreated softwood and isolated lignin［J］.Journal of biotechnology，2004，107(1):65-72.

［40］付二紅.表面活性劑對生物催化木質纖維素影響及機制的研究［D］.天津:天津大學，2008.