黃芪多糖和氧化苦參堿協(xié)同增強(qiáng)雞新城疫疫苗免疫效果研究

陳 茜，邢玉娟，陳玉庫(kù)，胡元亮，王德云，蔡丙嚴(yán)

(1 南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京210095；2 江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，江蘇 泰州225300)

黃芪多糖和氧化苦參堿協(xié)同增強(qiáng)雞新城疫疫苗免疫效果研究

陳 茜1，邢玉娟2，陳玉庫(kù)2，胡元亮1，王德云1，蔡丙嚴(yán)2

(1 南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京210095；2 江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，江蘇 泰州225300)

【目的】 研究黃芪多糖(Astragalus polysaccharides，APS)和氧化苦參堿(Oxymatrine,OM)對(duì)新城疫疫苗免疫的影響?！痉椒ā?將14 日齡非免疫羅曼蛋公雞550 羽隨機(jī)均分為11 組，1～9組分別為OAP(以O(shè)M與APS質(zhì)量比為6∶4配成)、OM和APS的高(4 mg/mL)、中(2 mg/mL)、低(1 mg/mL)劑量組，10組為免疫對(duì)照組，11組為空白對(duì)照組。除空白對(duì)照組外，各組試驗(yàn)雞只均于14日齡首免NDV-Ⅳ系疫苗，28日齡重復(fù)免疫。在首次免疫的同時(shí)，1～9 組分別口服高、中、低劑量藥物，免疫對(duì)照組和空白對(duì)照組口服等量生理鹽水，每天1 次，連續(xù)3 d。分別于14，21，28，35和42 日齡采血，用MTT法測(cè)定T淋巴細(xì)胞增殖的變化，用β-微量法測(cè)定血清抗體效價(jià)變化。于14，21，28和35 日齡，每組隨機(jī)抽取雞4 羽，稱(chēng)體質(zhì)量，剖殺，摘取法氏囊和脾臟并稱(chēng)質(zhì)量，計(jì)算免疫器官指數(shù)?！窘Y(jié)果】 OAP、OM、APS高、中劑量在各時(shí)間點(diǎn)均能促進(jìn)T淋巴細(xì)胞增殖；OAP高、中劑量組在各時(shí)間點(diǎn)抗體效價(jià)顯著高于免疫對(duì)照組；OAP高、中、低劑量組在各時(shí)間點(diǎn)的脾指數(shù)和法氏囊指數(shù)均顯著高于免疫對(duì)照組(OAP低劑量組35日齡除外)?！窘Y(jié)論】 黃芪多糖和氧化苦參堿能協(xié)同增強(qiáng)雞新城疫疫苗的免疫效果。

中藥成分復(fù)方；T淋巴細(xì)胞增殖；抗體效價(jià)；免疫器官指數(shù)

研究證明，中藥及其主要成分作為一種免疫增強(qiáng)劑，具有來(lái)源廣泛、效果顯著、無(wú)毒副作用等優(yōu)勢(shì)，不僅能克服油乳類(lèi)、鋁膠類(lèi)化學(xué)佐劑副作用大，局部刺激重、致癌、制備和使用麻煩或不足以提高弱抗原的免疫原性等弊病[1-4]，而且能顯著增強(qiáng)機(jī)體的細(xì)胞免疫和體液免疫功能，促進(jìn)免疫器官的發(fā)育和細(xì)胞因子的分泌[5-6]。

在前期研究中，筆者所在研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)，黃芪多糖(Astragalus polysaccharides，APS)與氧化苦參堿(Oxymatrine,OM)等中藥成分具有顯著抑制新城疫病毒(Newsastle disease virus,NDV)增殖的作用[7]；中藥成分復(fù)方在攻毒前、與攻毒同時(shí)和攻毒后給藥均能顯著降低受試雞的死亡率，提高血清NDV抗體效價(jià)，減輕死亡雞的器官出血[8]，但對(duì)于其增強(qiáng)免疫作用機(jī)理的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。

本試驗(yàn)在前期研究基礎(chǔ)上，進(jìn)一步測(cè)定了中藥成分及其復(fù)方對(duì)新城疫苗免疫后雛雞外周血T淋巴細(xì)胞增殖、血清抗體效價(jià)、法氏囊指數(shù)和脾指數(shù)的影響，進(jìn)一步探討中藥成分復(fù)方增強(qiáng)免疫的作用機(jī)理，以期為研制中藥成分免疫增強(qiáng)劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 藥物準(zhǔn)備 根據(jù)以前的試驗(yàn)結(jié)果[5-6]，分別用雙蒸水將OM、APS和OM-APS(OAP，以O(shè)M與APS質(zhì)量比為6∶4配成)配制成高(4 mg/mL)、中(2 mg/mL)、低(1 mg/mL) 3 種質(zhì)量濃度的溶液，常規(guī)消毒后備用。

1.1.2 疫苗和病毒 新城疫Ⅳ系(Newcastle disease virus Ⅳ strain，NDV-Ⅳ)疫苗，中牧股份南京藥械廠生產(chǎn)，批號(hào)753-3。新城疫檢測(cè)抗原，由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院中獸醫(yī)研究室提供。新城疫強(qiáng)毒E01株，由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所禽病研究室提供。將病毒按常規(guī)方法接種9 日齡SPF雞胚，恒溫培養(yǎng)72 h，收獲尿囊液，按Reed-Muench法[9]測(cè)定雞胚半數(shù)感染量(Egg infectious dose,EID50)為10-8.83。

1.1.3 主要試劑 RPMI1640培養(yǎng)液，Gibco公司產(chǎn)品，按說(shuō)明書(shū)用三蒸水配制后過(guò)濾除菌，分裝，4 ℃保存，臨用前加入犢牛血清達(dá)體積分?jǐn)?shù)5%，同時(shí)加青霉素、鏈霉素各100 IU/mL；植物血凝素(PHA)，上海伊華科技有限公司產(chǎn)品，用RPMI1640培養(yǎng)液配制成0.1 mg/mL，0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾除菌，分裝后-20 ℃保存；四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)溶液，Amresco公司產(chǎn)品，用pH值為7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)溶解，使最終質(zhì)量濃度為5 mg/mL，0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾除菌，分裝后4 ℃冰箱避光保存；淋巴細(xì)胞分離液，上海恒信化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；淋巴細(xì)胞裂解液二甲基亞砜(DMSO)，分析純，蘇州正興化工研究院產(chǎn)品。

1.1.4 試驗(yàn)動(dòng)物 1 日齡非免疫健康羅曼蛋公雞600羽，購(gòu)自湯泉農(nóng)墾種雞場(chǎng)。試驗(yàn)期間采用籠養(yǎng)，全價(jià)飼料，自由采食和飲水，1～14 日齡采用紅外燈保溫，全日制光照。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

雛雞飼養(yǎng)至14 日齡(平均體質(zhì)量95 g/只)，平均母源抗體效價(jià)3.3時(shí)，隨機(jī)選取550羽均分為11 組。第1～9 組為OAP高(OAPH)、OAP中(OAPM)、OAP低(OAPL)、OM高(OMH)、OM中(OMM)、OM低(OML)、APS高(APSH)、APS中(APSM)和APS低(APSL)，第10組為疫苗對(duì)照組，第11 組為空白對(duì)照組隔離飼養(yǎng)。除空白對(duì)照組外，其他組試驗(yàn)雞于14日齡首免，用NDV-Ⅳ系疫苗滴鼻、點(diǎn)眼免疫，每羽1 羽份；28 日齡時(shí)重復(fù)免疫。在首次免疫的同時(shí)，3 個(gè)中藥復(fù)方組分別口服高、中、低劑量的OAP復(fù)方，每羽1 mL，6 個(gè)單味藥組分別口服高、中、低劑量的OM和APS，每羽1 mL，免疫對(duì)照組和空白對(duì)照組口服等量生理鹽水，每天1 次，連續(xù)3 d。分別于14，21，28，35和42 日齡，每組隨機(jī)取雞4 羽，無(wú)菌心臟采血(4.0 mL/羽)，肝素抗凝，測(cè)定外周血淋巴細(xì)胞增殖；每組隨機(jī)另取雞10 羽翼靜脈采血，分離血清，用β-微量法測(cè)定HI抗體效價(jià)。在14，21，28和35 日齡，每組隨機(jī)取雞4 羽，稱(chēng)體質(zhì)量，剖殺，摘取法氏囊和脾臟并稱(chēng)其質(zhì)量，計(jì)算免疫器官指數(shù)(免疫器官質(zhì)量/體質(zhì)量×100%)。

1.3 淋巴細(xì)胞增殖的測(cè)定

采用MTT法[10]，將抗凝血樣用Hank’s液稀釋1 倍，小心加在淋巴細(xì)胞分離液上層，2 000 r/min離心20 min，吸取中間云霧狀白細(xì)胞層，用無(wú)血清RPMI1640培養(yǎng)液洗2 遍，1 500 r/min離心15 min。臺(tái)盼藍(lán)染色，細(xì)胞計(jì)數(shù)活細(xì)胞大于90%后，用RPMI1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度為2.5×106個(gè)/mL，加入到96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板(德國(guó)Nunclon公司生產(chǎn))中，80 μL/孔，每孔再加20 μL PHA，每個(gè)樣品重復(fù)4 孔，然后置于39.5 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2條件下(CO2培養(yǎng)箱，美國(guó)Revco公司產(chǎn)品)培養(yǎng)44 h，然后每孔加入MTT溶液20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，每孔加裂解液100 μL，將細(xì)胞板置于微量振蕩器(75-2A型，上海醫(yī)用分析儀器廠生產(chǎn))上振蕩5 min使沉淀完全溶解，在酶聯(lián)免疫儀(DG-3022型，中國(guó)華東電子管廠生產(chǎn))上于570 nm處檢測(cè)吸光值(A570)作為T(mén)淋巴細(xì)胞增殖的指標(biāo)。

1.4 抗體效價(jià)的測(cè)定

在96孔微量血凝板上，從左到右每孔各加50 μL PBS液，再向每排的第1 孔加入50 μL待檢血清，依次向后倍比稀釋直至第12 孔，然后向每孔加入50 μL 4 單位抗原，在微量振蕩器上振蕩混勻后置于溫箱中感作20 min。取出血凝板向每孔加入50 μL 雞紅細(xì)胞懸液，同時(shí)設(shè)陽(yáng)性血清、陰性血清及空白對(duì)照孔。振蕩混勻后置于37 ℃溫箱中感作30 min，待對(duì)照孔紅細(xì)胞已經(jīng)沉淀時(shí)觀察結(jié)果[9]。

1.5 數(shù)據(jù)處理

淋巴細(xì)胞A570值、HI效價(jià)和免疫器官指數(shù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。用SPSS 11.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，比較各時(shí)間點(diǎn)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化、抗體效價(jià)和免疫器官指數(shù)的差異性。

2 結(jié)果與分析

2.1 OM、ASP和OAP對(duì)雞淋巴細(xì)胞增殖的影響

OM、ASP、OAP不同劑量和免疫對(duì)照組各時(shí)間點(diǎn)A570值均顯著高于空白對(duì)照組(P<0.05)；與免疫對(duì)照組相比較，OAPH、OAPM、OMH、OMM、APSH、APSM在各時(shí)間點(diǎn)，OAPL、APSL在21，28，35和42日齡，OML在21，28和42日齡的A570值顯著升高(表1)。

OAPH在各時(shí)間點(diǎn)A570值均顯著高于OMH和APSH(P<0.05)；OAPM在28日齡A570值高于APSM，但差異不顯著，其余各時(shí)間點(diǎn)其A570值均顯著高于OMM和APSM(P<0.05)；不同劑量復(fù)方組和OMH、APSH在21 日齡A570值達(dá)到高峰，其余各單味藥及對(duì)照組在28 日齡達(dá)到高峰(表1)。

注：同列數(shù)據(jù)后標(biāo)不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。

Note:Different lowercase letters in each column indicate significant difference (P<0.05).The same below.

2.2 OM、ASP和OAP對(duì)雞抗體效價(jià)的影響

由表2可知，OM、ASP、OAP各劑量組和免疫對(duì)照組試驗(yàn)雞各時(shí)間點(diǎn)抗體效價(jià)均顯著高于空白對(duì)照組(P<0.05)；OAPH和OAPM在14～42日齡，APSM和OMM在21～42日齡，APSH在21,35，42日齡,OAPL在21，28，35日齡，APSL、OMH在21日齡抗體效價(jià)顯著高于免疫對(duì)照組(P<0.05)。

OAPH的抗體效價(jià)在各時(shí)間點(diǎn)均顯著高于OMH和APSH(P<0.05)；OAPM抗體效價(jià)在21，28，35和42 日齡顯著高于OMM，在21，28和35 日齡顯著高于APSM(P<0.05)；OAPL抗體效價(jià)在28 日齡顯著高于OML(P<0.05)(表2)。

2.3 OM、ASP和OAP對(duì)雞免疫器官指數(shù)的影響

2.3.1 法氏囊指數(shù)的變化 由表3可知，OAPL、OMH、OML、免疫對(duì)照組和空白對(duì)照組的法氏囊指數(shù)在21 日齡達(dá)到峰值，其他各組在28 日齡達(dá)到峰值；各藥物組及免疫對(duì)照組法氏囊指數(shù)均顯著高于空白對(duì)照(P<0.05)；OAPH、OAPM、OMM、OML、APSH、APSM、APSL在各時(shí)間點(diǎn)，OMH在21和28日齡及OAPL在14，21和28日齡法氏囊指數(shù)顯著高于免疫對(duì)照組(P<0.05)。OAPH的法氏囊指數(shù)在各時(shí)間點(diǎn)均顯著高于OMH，在28和35 日齡顯著高于APSH，OAPM的法氏囊指數(shù)在35 日齡顯著高于OMM和APSM(P<0.05)。

2.3.2 脾指數(shù)的變化 由表4可知，OAP各劑量組、OMM、APSH、APSM在各時(shí)間點(diǎn)、OMH在14和35日齡、OML和APSL在14，21和35日齡脾指數(shù)顯著高于空白對(duì)照組(P<0.05)；OAP各劑量組、OMM、APSH、APSM在各時(shí)間點(diǎn)及OML在21日齡和APSL在14，21 日齡的脾指數(shù)均顯著高于免疫對(duì)照組(P<0.05)。

OAPH在各時(shí)間點(diǎn)的脾指數(shù)均顯著高于OMH；OAPM在21，28和35 日齡的脾指數(shù)顯著高于OMM，在28 日齡顯著高于APSM；OAPL在14和28 日齡脾指數(shù)顯著高于OML(表4)。

3 討 論

3.1 中藥成分復(fù)方及其組分藥對(duì)淋巴細(xì)胞增殖的影響

淋巴細(xì)胞增殖是反映機(jī)體細(xì)胞免疫水平的一個(gè)重要指標(biāo)[11]。細(xì)胞免疫是通過(guò)致敏淋巴細(xì)胞與相應(yīng)抗原作用而發(fā)揮抗病原體感染、抗腫瘤、幫助B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗體等作用。本試驗(yàn)結(jié)果表明，9 個(gè)試驗(yàn)藥物組中，除OAPL、OML、APSL在14 日齡，OML在35 日齡A570與免疫對(duì)照組無(wú)顯著差異外，其余各組在各時(shí)間點(diǎn)的A570值均顯著高于免疫對(duì)照組。提示OAP、APS和OM在合適的劑量均能刺激淋巴細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞免疫，且以O(shè)APM、OAPH的效果最好。

3.2 中藥成分復(fù)方及其組分藥對(duì)新城疫苗免疫應(yīng)答的影響

血清抗體效價(jià)反映機(jī)體體液免疫狀態(tài)[12]，體液免疫是機(jī)體抗御感染的主要因素之一，通過(guò)抗原-抗體結(jié)合反應(yīng)而起到抗菌、抗病毒、抗外毒素等多種作用。本試驗(yàn)結(jié)果表明，OAPH、OAPM在5個(gè)時(shí)間點(diǎn)、OMM和APSM在4 個(gè)時(shí)間點(diǎn)、OAPL和APSH在3 個(gè)時(shí)間點(diǎn)、OMH和APSL在1 個(gè)時(shí)間點(diǎn)的抗體效價(jià)均顯著高于免疫對(duì)照組。表明OAP、APS和OM在合適的劑量均能刺激抗體產(chǎn)生，提高機(jī)體體液免疫水平，其中以O(shè)APH、OAPM和APSM的作用較強(qiáng)。

3.3 中藥成分復(fù)方及其組分藥對(duì)免疫器官指數(shù)的影響

一般認(rèn)為，免疫器官指數(shù)降低為免疫抑制所致，而免疫器官指數(shù)增加則為免疫增強(qiáng)的表現(xiàn)[13]。本試驗(yàn)中，OAPH、OAPM在各時(shí)間點(diǎn)的法氏囊指數(shù)、脾指數(shù)均顯著高于免疫對(duì)照和空白對(duì)照組，OAPL在14，21和28 日齡的法氏囊指數(shù)和各時(shí)間點(diǎn)的脾指數(shù)顯著高于免疫對(duì)照組。除OMH在14和35 日齡以及OAPL在35 日齡的法氏囊指數(shù)高于免疫對(duì)照組但差異不顯著外，其余各藥物組法氏囊指數(shù)均顯著高于免疫對(duì)照組。在脾指數(shù)方面，OMH在各時(shí)間點(diǎn)，OML在14，28和35 日齡，APSL在28和35 日齡與免疫對(duì)照組無(wú)顯著差異，其余各組、各時(shí)間點(diǎn)均顯著高于免疫對(duì)照組。表明中藥成分復(fù)方及其組分藥能增加免疫器官質(zhì)量，從而增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能。

3.4 中藥成分復(fù)方及其組分藥增強(qiáng)免疫作用的量效關(guān)系

本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，OAP增強(qiáng)免疫作用有一定的量效關(guān)系。在促進(jìn)T淋巴細(xì)胞增殖方面，OAPH、OAPM在各時(shí)間點(diǎn)均顯著高于免疫對(duì)照組，而OAPL在14 日齡與免疫對(duì)照組無(wú)顯著差異。OM和APS的高、中劑量組各時(shí)間點(diǎn)的A570值與免疫對(duì)照組相比較差異顯著，而低劑量組在14 日齡與免疫對(duì)照組無(wú)顯著差異，這可能是因?yàn)閯┝窟^(guò)小，不足以刺激機(jī)體產(chǎn)生致敏淋巴細(xì)胞所致，具體原因還有待于進(jìn)一步研究；在提高血清抗體效價(jià)方面，OAPH、OAPM在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均顯著高于免疫對(duì)照組；OAPL在21，28和35 日齡顯著高于免疫對(duì)照組。在提高法氏囊指數(shù)方面，OAPH、OAPM各時(shí)間點(diǎn)的法氏囊指數(shù)顯著高于免疫對(duì)照組；OAPL在14，21和28 日齡顯著高于免疫對(duì)照組，在35 日齡與免疫對(duì)照組相比較差異不顯著。Kong等[14]在觀察9種中藥成分對(duì)新城疫Ⅳ系疫苗免疫雛雞血清中血凝抑制抗體水平影響的研究中，也得到了類(lèi)似結(jié)果。

3.5 中藥成分復(fù)方與其單味組分藥增強(qiáng)免疫作用的比較

在促進(jìn)T淋巴細(xì)胞增殖方面，OAPH的A570值顯著高于OMH和APSH；在提高血清抗體效價(jià)方面，OAPH抗體效價(jià)顯著高于OMH和APSH；在提高免疫器官指數(shù)方面，OAPH的法氏囊指數(shù)顯著高于OMH。OAP是由OM和APS組成的復(fù)方，其增強(qiáng)免疫作用優(yōu)于單味組分藥，表明兩種組分藥有協(xié)同作用。王德云等[15-16]在研究當(dāng)歸多糖、黃芪多糖、淫羊藿多糖、蜂膠黃酮等提高免疫調(diào)節(jié)作用時(shí)亦發(fā)現(xiàn)，中藥成分復(fù)方的免疫活性優(yōu)于其單味組分。

綜合以上結(jié)果可見(jiàn)，OAP能顯著增強(qiáng)雛雞對(duì)新城疫疫苗的免疫應(yīng)答，且中、高劑量的效果較好，顯著優(yōu)于單味組分，可作為新型免疫增強(qiáng)劑的候選方。

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Increasing immune efficacy of Newcastle disease vaccine in chicken by astragalus polysaccharide and oxymatrine

CHEN Xi1,XING Yu-juan2,CHEN Yu-ku2,HU Yuan-liang1,WANG De-yun1,CAI Bing-yan2

(1CollegeofVeterinaryMedicine,NanjingAgriculturalUniversity,Nanjing,Jiangsu210095,China;2JiangsuAgri-animalHusbandryVocationalCollege,Taizhou,Jiangsu225300,China)

【Objective】 This paper aimed to study the immune effect of astragalus polysaccharide (APS) and oxymatrine (OM) on Newcastle disease vaccine.【Method】 Five hundred and fifty 14-day-old non-immunized Roman cocks were randomly divided into 11 groups.Groups 1 to 9 were OAP (OM and APS quality ratio of 6∶4),OM and APS at high (4 mg/mL),medium (2 mg/mL) and low (1 mg/mL) doses,respectively.Group 10 was vaccine control and group 11 was blank control.Groups 1 to 10 were vaccinated with NDV-Ⅳ at the ages of 14 and 28 days,respectively.At the same time of the first vaccination,the chickens in groups 1 to 9 were given compounds at high,medium and low doses and chickens in vaccination and blank control groups were given physiological saline by oral administration,once a day for three days. On days 14,21,28,35 and 42,peripheral T lymphocyte proliferations and serum antibody titers were determined with MTT method and β-microscopic method,respectively.On 14,21,28 and 35 days,the organ indexes of spleen and bursa were determined by killing 4 chickens in each group.【Result】 T lymphocyte proliferations were promoted by OAP,OM and APS at high and medium doses and serum antibody titers of OAP at high and medium doses were significantly higher than those of vaccine control group.At any time,spleen and bursa indexes of OAP at all doses were significantly higher than those of vaccine control group (except the OAP low dose group for 35-day old chicken).【Conclusion】 APS and OM could synergistically improve the immune efficacy of Newcastle disease vaccine in chicken.

Chinese herbal medicinal ingredients compounds;T lymphocyte proliferation;antibody titer;immune organ index

2014-05-27

國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2008BADB4B06)；國(guó)家大學(xué)生創(chuàng)新性實(shí)驗(yàn)計(jì)劃項(xiàng)目(2013110307038)

陳 茜(1992-)，女，內(nèi)蒙古通遼人，本科在讀，主要從事中獸藥藥理學(xué)研究。E-mail：1903048596@qq.com

胡元亮(1953-)，男，江蘇邳州人，教授，博士，博士生導(dǎo)師，主要從事中獸醫(yī)學(xué)研究。E-mail：ylhu@njau.edu.cn

時(shí)間:2015-05-11 15:03

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.06.028

S853.7

A

1671-9387(2015)06-0041-06

網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20150511.1503.028.html