四川黑茶的高效液相色譜指紋圖譜研究

胡 燕，齊桂年

(四川農(nóng)業(yè)大學 園藝學院， 四川 雅安 625014)

四川黑茶的高效液相色譜指紋圖譜研究

胡 燕，齊桂年

(四川農(nóng)業(yè)大學 園藝學院， 四川 雅安 625014)

【目的】 應用高效液相色譜法(HPLC)研究四川黑茶的指紋圖譜，為四川黑茶的鑒別和質(zhì)量評價提供參考?！痉椒ā?以四川省11個不同生產(chǎn)廠家的22個黑茶樣品及我國其他黑茶主產(chǎn)區(qū)的13個黑茶樣品為試驗材料，采用線性梯度洗脫，以甲醇和體積分數(shù)2%乙酸水溶液為流動相，在柱溫30 ℃，檢測波長280 nm，流速1.0 mL/min條件下構(gòu)建四川黑茶HPLC指紋圖譜的共有模式，分析各樣品與該共有模式的相似度，并對35個黑茶樣品進行聚類分析。【結(jié)果】 確定了14個色譜峰為四川黑茶的共有峰；精密度、重現(xiàn)性、穩(wěn)定性試驗中各共有峰的相對峰面積、相對保留時間的相對標準偏差(RSD)均小于3.00%；22個四川黑茶樣品與共有模式的相似度為0.825～0.978；對相對峰面積的聚類分析結(jié)果表明，當臨界值為10時，35個來自全國不同產(chǎn)地的黑茶樣品可聚為4類，來自四川的22個黑茶樣品可聚為一大類。【結(jié)論】 根據(jù)構(gòu)建的四川黑茶的HPLC指紋圖譜，可以鑒定和評價除方包茶之外的四川黑茶。

四川黑茶；高效液相色譜法；化學指紋圖譜；聚類分析

黑茶是我國六大茶類之一，屬于后發(fā)酵茶，以邊銷為主，主產(chǎn)區(qū)為湖南、四川、云南、湖北、廣西等省[1]。黑茶因產(chǎn)地、原料拼配比例和加工工藝等方面的差別，其內(nèi)含物質(zhì)如多酚類、咖啡堿、茶色素等的種類和含量均存在差異。四川黑茶是我國黑茶類的一個重要組成部分，其生產(chǎn)歷史悠久，品種主要為南路邊茶康磚、金尖和西路邊茶茯磚、方包等。目前對四川黑茶的研究主要集中在品質(zhì)化學成分[2-5]、加工過程中微生物種群的分離鑒定[6-7]和降氟技術(shù)[8]等方面；現(xiàn)有國家標準對四川黑茶品質(zhì)的評價主要是測定水分、總灰分、水浸出物等理化指標并結(jié)合感官審評[9-11]，但難以全面反映其品質(zhì)。

化學指紋圖譜是指在固定的試驗條件下，將待測物經(jīng)適當處理后得到的能標示其化學特征的譜圖[12]，可分為光譜指紋、色譜指紋、波譜指紋圖譜以及采用多種現(xiàn)代分析儀器得到的多維多息特征譜等，其中高效液相色譜(HPLC)指紋圖譜適用于分析茶葉中的非揮發(fā)性成分[13]。化學指紋圖譜技術(shù)目前已廣泛應用于中藥的真?zhèn)舞b別、質(zhì)量控制、新藥開發(fā)等領(lǐng)域[14-16]，但應用于黑茶的研究較少[17-19]。因此，本試驗初步構(gòu)建了四川黑茶的HPLC指紋圖譜，綜合評價四川黑茶中非揮發(fā)性成分的化學特征，以期為四川黑茶的鑒別和質(zhì)量的客觀評價提供一種新的思路。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

22個(S1～S22)四川黑茶樣品源自四川省的11個不同生產(chǎn)廠家，13個(S23～S35)對照樣品分別采自云南、廣西、湖北、湖南、陜西等黑茶的其他主產(chǎn)區(qū)，所有茶葉樣品的生產(chǎn)年份均為2012年，詳見表1。

1.2 儀器與試劑

主要儀器有：島津LC-20A高效液相色譜儀(配有在線真空脫氣裝置、四元泵、自動進樣器、二極管陣列檢測器)，LCsolution色譜工作站(日本島津)，超聲波清洗器(上海冠特超聲波儀器有限公司)，電子天平(德國賽多利斯股份公司)，臺式高速離心機(上海安亭科學儀器廠)，電熱恒溫水浴鍋(北京中興偉業(yè)儀器有限公司)和微型植物實驗粉碎機(天津市泰斯特儀器有限公司)。

主要試劑有：色譜純甲醇(美國Fisher公司)，二次蒸餾水，分析純乙酸(天津科密歐化學試劑開發(fā)中心)，咖啡堿(CAF)、沒食子酸(GA)、兒茶素(C)標準品(中國標準物質(zhì)中心)。

1.3 樣品前處理

稱取2.00 g粉碎茶樣(過40目篩, 篩孔孔徑為0.425 mm)于250 mL具塞錐形瓶中，加入140 mL 90 ℃的蒸餾水，立即移入90 ℃水浴中浸提15 min，每隔5 min搖動1次。浸提完畢后，冷卻至室溫，離心15 min(轉(zhuǎn)速4 000 r/min)，取上清液，用0.45 μm水相濾膜過濾后上機分析；同時，采用相同的色譜條件取CAF、GA、C標準品溶液上機分析。

1.4 色譜條件

流動相A為體積分數(shù)2%乙酸水溶液，流動相B為甲醇；色譜柱為漢邦科技Lichrospher C18色譜柱(5 μm×250 mm×4.6 mm)。檢測波長280 nm，柱溫30 ℃，流速1.0 mL/min。分析時間65 min。

梯度洗脫程序：0～8 min，3%～10%B；8～15 min，10%～17%B；15～20 min，17%～21%B；20～28 min，21%～24%B；28～33 min，24%～40%B；33～48 min，40%～70%B；48～60 min，70%～30%B；60～65 min，30%～3%B。系統(tǒng)平衡色譜柱時間為15 min。

1.5 方法學考察

取同一黑茶樣品按1.3中的條件制備，在1.4中的色譜條件下連續(xù)進樣6次，以7號峰為參照峰，考察儀器的精密度。

取同一黑茶樣品5份，按1.3中的條件平行制備，在1.4中的色譜條件下分別進樣檢測，以7號峰為參照峰，考察試驗方法的重現(xiàn)性。

取同一黑茶樣品按1.3中的條件制備，分別放置0，2，4，8，12，16，20和24 h，然后按1.4中的色譜條件進樣檢測，以7號峰為參照峰，考察黑茶樣品提取液的穩(wěn)定性。

1.6 數(shù)據(jù)分析

將四川黑茶樣品的HPLC圖譜通過LCsolution色譜工作站以AIA格式導出，然后分別導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》(2004 A版)軟件中，生成四川黑茶的HPLC指紋圖譜共有模式，計算四川黑茶樣品及對照樣品與四川黑茶共有模式的相似度；將22個四川黑茶樣品及13個對照樣品中各共有峰的相對峰面積與樣品編號建立矩陣，采用SPSS 19.0軟件，選擇組間聯(lián)接及連續(xù)變量的歐氏距離平方對供試黑茶樣品進行聚類分析[20]。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑茶HPLC指紋圖譜方法的考察

在精密度試驗中，HPLC圖譜中各共有峰的相對保留時間和相對峰面積的相對標準偏差(RSD)分別為0.31%～1.28%和0.75%～1.96%，表明儀器的精密度良好。在重現(xiàn)性試驗中，HPLC圖譜中各共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD分別為0.22%～1.42%和0.75%～2.06%，表明試驗方法的重現(xiàn)性良好。在穩(wěn)定性試驗中，HPLC圖譜中各共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD分別為0.98%～2.04%和1.16%～2.29%，表明黑茶樣品提取液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2 四川黑茶HPLC指紋圖譜的構(gòu)建

四川省11個不同廠家22個黑茶樣品的HPLC指紋圖譜見圖1，其HPLC指紋圖譜共有模式見圖2。選擇出峰時間適中、峰面積在色譜圖中所占比例較大,且在各個四川黑茶樣品中均穩(wěn)定存在的7號峰作為參照峰，分別計算各樣品組分峰的相對保留時間，各組分峰按相對保留時間一一匹配后共確定14個共有峰。經(jīng)與標準品比較，峰3、6、7分別鑒定為GA、C和CAF；22個四川黑茶樣品各共有峰的平均相對保留時間見表2；分別計算13個對照茶樣中各組分峰的相對保留時間并與四川黑茶比較，發(fā)現(xiàn)四川黑茶中的14個共有峰在對照茶樣中均穩(wěn)定存在，各色譜圖中共有峰面積占總峰面積的比例均在90%以上。因此，僅通過四川黑茶共有峰不能將四川黑茶與我國其他產(chǎn)區(qū)的黑茶樣品進行有效區(qū)分。

圖1 22個四川黑茶樣品的HPLC指紋圖譜S1～S22.所示樣品同表1
Fig.1 HPLC fingerprinting of 22 Sichuan dark tea samples S1-S22.Same as table 1

2.3 不同產(chǎn)地黑茶樣品HPLC指紋圖譜的相似度評價

從表3可以看出，22個四川黑茶樣品與四川黑茶共有模式的相似度在0.825～0.978，除2個方包茶樣品與共有模式的相似度較低外，其余20個樣品的相似度均大于0.900，說明它們所含的化學成分相似，質(zhì)量較穩(wěn)定；其他省份的黑茶樣品與四川黑茶共有模式的相似度在0.709～0.928，相似度的差異說明，不同產(chǎn)地、不同品種的黑茶樣品由于加工工藝和原料的品種、嫩度等有別，其內(nèi)含化學成分及含量可能存在一定的差異。

注：S1～S35.所示樣品同表1。

Note:S1-S35.Same as table 1.

2.4 不同產(chǎn)地黑茶樣品的聚類分析

從圖3可以看出，當臨界值為10時，35個來自不同產(chǎn)地的黑茶樣品可聚為4類：來自四川的22個黑茶樣品可聚為一大類，在這一大類中，加工工藝相同的10個康磚茶樣品、8個金尖茶樣品、2個方包茶樣品分別聚為一小類，來自陜西咸陽的涇渭七子茯茶與四川茯磚茶聚為一小類，這與相似度的分析結(jié)果一致；來自湖南的6個黑茶樣品聚為一大類；來自云南和湖北的4個黑茶樣品聚為一大類；來自廣西的2個六堡茶樣品單獨聚為一大類。不同黑茶樣品中各共有峰相對峰面積的聚類分析結(jié)果表明，不同原料產(chǎn)地對黑茶內(nèi)含化學成分的影響較大，可利用聚類分析對我國不同產(chǎn)地和加工工藝的黑茶樣品進行初步區(qū)分。

3 討 論

目前，對黑茶HPLC指紋圖譜的研究主要集中于普洱茶，而對四川黑茶的HPLC指紋圖譜研究尚未見報道。本試驗初步構(gòu)建了四川黑茶的HPLC指紋圖譜，結(jié)果顯示，22個四川黑茶樣品均有14個共有峰，但峰面積存在差異，說明不同廠家、不同品種的四川黑茶樣品，由于原料和生產(chǎn)工藝略有差異，造成其內(nèi)含化學成分含量的不同；相似度分析結(jié)果表明，其他省份的黑茶樣品與四川黑茶HPLC指紋圖譜共有模式的相似度在0.709～0.928，因此僅通過四川黑茶中的共有峰及相似度評價，不能將四川黑茶與我國其他產(chǎn)區(qū)的黑茶樣品進行準確區(qū)分，而將各共有峰的相對峰面積與樣品編號建立矩陣后進行聚類分析能初步區(qū)分我國不同產(chǎn)地的黑茶樣品。方包茶是四川西路邊茶中的一個主要花色品種。本研究結(jié)果表明，2個方包茶樣品與四川黑茶HPLC指紋圖譜共有模式的相似度較低，這可能與原料及加工工藝不同有關(guān)，生產(chǎn)方包茶的鮮葉原料比南路邊茶更為成熟，是采割1～2年生的成熟枝梢直接曬干制成，含梗量達60%。本試驗采用HPLC指紋圖譜分析技術(shù)，得到了有關(guān)四川黑茶質(zhì)量的綜合信息，比通過單一成分測定得到的結(jié)果更為豐富和全面；但與中藥材相似，黑茶作為后發(fā)酵茶，其大多數(shù)活性成分都是次生代謝產(chǎn)物，本身就存在內(nèi)在的不穩(wěn)定性，這也是黑茶指紋圖譜研究的難點，這就需要實施茶葉的規(guī)范化種植，并運用聯(lián)用技術(shù)獲得黑茶的多維多息特征譜，以更好地對黑茶物質(zhì)基礎(chǔ)進行研究。

4 結(jié) 論

本研究初步構(gòu)建了四川黑茶的HPLC指紋圖譜，22個四川黑茶樣品中有20個樣品與共有模式的相似度在0.902～0.978，而其他省份的黑茶樣品與四川黑茶共有模式的相似度均較低；聚類分析也證實，來自四川的22個黑茶樣品可聚為一大類。本研究結(jié)果在一定程度上為四川黑茶的鑒別和質(zhì)量的客觀評價提供了理論參考。

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High performance liquid chromatographic fingerprinting of Sichuan dark tea

HU Yan,QI Gui-nian

(CollegeofHorticulture,SichuanAgriculturalUniversity,Ya’an,Sichuan625014,China)

【Objective】 The fingerprinting of Sichuan dark tea was studied using HPLC to improve its identification and quality assessment.【Method】 22 Sichuan dark tea samples from 11 different manufacturers and 13 dark tea samples from other regions of China were selected as experimental materials.A suitable chromatographic system was established using a linear gradient elution with methanol and water containing 2% acetic acid as the mobile phase,a detection wavelength of 280 nm and the flow speed of 1.0 mL/min.The common pattern of HPLC fingerprinting of Sichuan dark tea was established,and the similarity index between dark tea samples and the common pattern of Sichuan dark tea were analyzed.The methodology was inspected and cluster analysis of the 35 dark tea samples was conducted.【Result】 There were 14 peaks in chromatograms were determined.The RSD of the relative peak area and the relative retention time of common peaks in test of precision,repeatability,and stability were all less than 3.00%.The similarity index between 22 Sichuan dark tea samples and the common pattern of Sichuan dark tea ranged from 0.825 to 0.978.The cluster analysis on the relative peak area showed that the 35 dark tea samples from different origins could be divided into four types,and the 22 Sichuan dark tea samples belonged one same category.【Conclusion】 The established HPLC fingerprinting can be used to identify and evaluate Sichuan dark teas except Fangbao tea.

Sichuan dark tea;HPLC;chemical fingerprinting;cluster analysis

2013-09-18 [作者簡介] 胡 燕(1982-),女，四川雅安人，工程師，在讀博士，主要從事園藝植物資源開發(fā)與利用研究。

齊桂年(1956-)，男，重慶永川人，教授，博士，主要從事茶葉加工及植物資源開發(fā)與利用研究。

時間:2014-12-12 09:30

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.01.012

TS272.7

A

1671-9387(2015)01-0134-07

網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20141212.0930.012.html