磷脂酰肌醇3激酶和細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶信號通路對支氣管哮喘大鼠氣管平滑肌細(xì)胞增殖的協(xié)同調(diào)控作用

徐 慧，戴元榮，付玉茹，夏夢玲

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·論著·

磷脂酰肌醇3激酶和細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶信號通路對支氣管哮喘大鼠氣管平滑肌細(xì)胞增殖的協(xié)同調(diào)控作用

徐 慧，戴元榮，付玉茹，夏夢玲

目的 探討磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)和細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)信號通路對支氣管哮喘(簡稱哮喘)大鼠氣管平滑肌細(xì)胞(ASMC)增殖的協(xié)同調(diào)控作用。方法 6～8周齡SPF級雄性SD 大鼠，復(fù)制大鼠慢性哮喘模型，離體培養(yǎng)大鼠氣管ASMC，將細(xì)胞分為正常組、哮喘組、轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)組、TGF-β1+PD98059組、TGF-β1+渥曼青霉素(wortmannin)組、TGF-β1+PD98059+wortmannin組。采用CCK-8法檢測各組細(xì)胞增殖情況及Western blotting法檢測磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)和磷酸化細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2(p-ERK1/2)表達(dá)情況。結(jié)果 CCK-8法檢測各組大鼠ASMC OD 值，TGF-β1組高于正常組和哮喘組，TGF-β1+ PD98059組、TGF-β1+wortmannin組和TGF-β1+PD98059+wortmannin組低于TGF-β1組，TGF-β1+ PD98059+wortmannin組低于TGF-β1+ PD98059組和TGF-β1+wortmannin組(P<0.01)。Western blotting法檢測ASMC中p-Akt的表達(dá)，哮喘組高于正常組，TGF-β1組高于哮喘組，TGF-β1+wortmannin組低于TGF-β1組(P<0.01)。Western blotting法檢測ASMC中p-ERK1/2的表達(dá)，哮喘組高于正常組，TGF-β1組高于哮喘組，TGF-β1+ PD98059組低于TGF-β1組(P<0.01)。結(jié)論 PI3K和ERK信號通路協(xié)同調(diào)控了TGF-β1刺激哮喘大鼠ASMC增殖過程。

哮喘；信號通路；肌細(xì)胞,平滑肌；細(xì)胞增殖；磷脂酰肌醇3-激酶類；細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶

徐慧，戴元榮，付玉茹，等.磷脂酰肌醇3激酶和細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶信號通路對支氣管哮喘大鼠氣管平滑肌細(xì)胞增殖的協(xié)同調(diào)控作用[J].中國全科醫(yī)學(xué)，2015，18(9)：1032-1036.[www.chinagp.net]

Xu H,Dai YR,Fu YR,et al.Coordinated regulation of the proliferation of airway smooth muscle cells by ERK and PI3K signal pathways in asthmatic rats [J].Chinese General Practice，2015，18(9)：1032-1036.

氣管重塑是支氣管哮喘(簡稱哮喘)發(fā)病的重要環(huán)節(jié)，其中氣管平滑肌細(xì)胞(airway smooth muscle cell,ASMC)的增生和肥大在氣管重塑中發(fā)揮了重要作用[1]。轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)能刺激ASMC的分裂與增殖[2]。近年的研究表明，磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K)及細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)介導(dǎo)的信號通路在ASMC增殖中發(fā)揮著十分重要的作用[3-4]。細(xì)胞信號通路并不都是線性化的，即不都是單純由某一條信號通路級聯(lián)傳遞完成的。據(jù)此，本研究以PI3K和ERK信號通路對哮喘大鼠ASMC的調(diào)控為切入點，探討PI3K和ERK信號通路對哮喘大鼠ASMC增殖的協(xié)同調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 6～8周齡SPF級雄性SD大鼠30只，體質(zhì)量100～120 g，購自上海實驗動物中心〔合格證號：SYXK(浙)2010-0150〕。飼養(yǎng)于溫州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心SPF級實驗室，飼養(yǎng)溫度25 ℃，相對濕度70%，晝夜照明12 h/12 h。

1.1.2 主要試劑及儀器 兔多克隆抗磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)抗體購自美國CST公司，磷酸化細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2(p-ERK1/2)抗體(美國abcam公司)，TGF-β1購自美國PeproTech公司，25 cm2無菌培養(yǎng)瓶購自美國Corning公司，RPMI 1640培養(yǎng)基購自美國HyClone公司，Ⅰ型膠原酶購自美國Sigma公司，優(yōu)級胎牛血清(FBS)購自杭州四季青生物工程材料有限公司，青鏈霉素和胰酶細(xì)胞消化液購自江蘇碧云天生物工程有限公司，5%CO2培養(yǎng)箱購自美國Thermo公司，倒置顯微鏡購自日本尼康公司，ECL試劑盒購自Gene 公司，甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體、異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的山羊抗小鼠的二抗購自江蘇碧云天生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 哮喘大鼠模型的建立 將大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為哮喘組(15只)和對照組(15只)。適應(yīng)性飼養(yǎng)于溫州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心1周后，哮喘組分別于第1天和第8天大鼠腹腔注射含1 mg卵清蛋白(OVA)和100 mg氫氧化鋁〔Al(OH)3〕的混合溶液1 ml致敏，第15天開始激發(fā)，將大鼠置于自制的霧化箱內(nèi)，使用超聲霧化器噴入含1%OVA的0.9%氯化鈉溶液8 ml，30 min/次，隔天1次，共8周；對照組致敏和激發(fā)階段均使用0.9%氯化鈉溶液。各組大鼠末次激發(fā)24 h后處死，模型制備成功后行組織切片觀察氣管形態(tài)。

本研究創(chuàng)新點：

氣管重塑是支氣管哮喘(簡稱哮喘)重要的特征，找到逆轉(zhuǎn)氣管重塑的靶點將為治療哮喘開辟新的方向。然而氣管重塑的機(jī)制尚未明確，氣管平滑肌作為氣管壁的主要結(jié)構(gòu)，是哮喘氣管重塑及氣流受限的主要效應(yīng)細(xì)胞。轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)是導(dǎo)致氣管重塑的重要因子，許多實驗已證實其可促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)沉積、氣管平滑肌細(xì)胞增生、黏液分泌。既往研究也有探討哮喘發(fā)病機(jī)制中相關(guān)信號傳導(dǎo)通路，但較少同時研究兩條信號通路和探討兩者之間是否存在相互作用。本實驗以支氣管平滑肌細(xì)胞為研究靶點，探討TGF-β1導(dǎo)致氣管平滑肌細(xì)胞重塑可能的機(jī)制為重點，發(fā)現(xiàn)其導(dǎo)致氣管平滑肌細(xì)胞增殖與兩條重要的信號通路有關(guān)，且這兩條信號通路不是孤立的，而是存在交叉作用，共同調(diào)節(jié)了TGF-β1刺激引起的氣管平滑肌細(xì)胞的增殖，從而導(dǎo)致了支氣管哮喘的氣管重塑。

1.2.2 肺組織蘇木素-伊紅(HE)染色 大鼠末次激發(fā)24 h后，經(jīng)腹腔注射10%水合氯醛(500 mg/kg)麻醉大鼠，腹主動脈放血處死，迅速游離完整的心肺組織，結(jié)扎左主支氣管及右中葉支氣管，4%多聚甲醛溶液注入右肺下葉，結(jié)扎并游離右肺下葉，將其浸入4%多聚甲醛溶液中，24 h后石蠟包埋，做病理切片。將制備好的肺組織切片進(jìn)行HE染色。

1.2.3 ASMC的培養(yǎng)和鑒定 利用組織塊貼壁法進(jìn)行ASMC培養(yǎng)，待細(xì)胞長滿后用胰酶細(xì)胞消化液傳代，取3～6代細(xì)胞進(jìn)行實驗。采用細(xì)胞免疫組化和透射電鏡對培養(yǎng)的ASMC進(jìn)行鑒定。

1.2.4 CCK-8(cell counting kit-8)法檢測ASMC的增殖 取3～6代細(xì)胞，用含10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，將細(xì)胞調(diào)至濃度為4×103/ml的混懸液，接種于96孔板，待細(xì)胞融合后，換無血清RPMI 1640繼續(xù)培養(yǎng)，使細(xì)胞同步于G0期，換用含10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。采用隨機(jī)數(shù)字表法將細(xì)胞分為6組：正常組、哮喘組、TGF-β1組、TGF-β1+PD98059組、TGF-β1+渥曼青霉素(wortmannin)組、TGF-β1+PD98059+wortmannin組。TGF-β1+PD98059組、TGF-β1+wortmannin組和TGF-β1+PD98059+wortmannin組分別于TGF-β1干預(yù)前加入PD98059、wortmannin及PD98059+wortmannin預(yù)處理1 h。培養(yǎng)結(jié)束時，再于每孔中加入10 μl的CCK-8，混勻后置于5%CO2孵箱，37 ℃，培養(yǎng)2 h，采用酶聯(lián)免疫檢測儀于450 nm波長測定各孔吸光度值(OD值)。

1.2.5 Western blotting法檢測ASMC中p-Akt、p-ERK1/2的表達(dá) 培養(yǎng)結(jié)束后，提取各組細(xì)胞總蛋白質(zhì)，以BCA法進(jìn)行蛋白定量。按每孔30 μg蛋白量加樣進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，將分離的蛋白轉(zhuǎn)膜至PVDF膜后，以5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，分別加p-Akt(1∶800)、p-ERK1/2(1∶2 000)及GAPDH抗體(1∶5 000)孵育，4 ℃過夜。TBST緩沖液洗膜后加辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔二抗(1∶1 000)及山羊抗小鼠二抗(1∶2 000)，室溫孵育1 h，洗膜，ECL顯影。用AlphaEaseFC 4.0軟件分析目的蛋白p-Akt、p-ERK1/2和內(nèi)參GAPDH的OD值，以目的蛋白和內(nèi)參GAPDH OD值的比值代表目的蛋白的相對含量。

2 結(jié)果

2.1 大鼠肺組織病理學(xué)改變 大鼠肺組織HE染色觀察顯示，氣管壁及血管周圍有大量炎性細(xì)胞浸潤，平滑肌層增厚，黏膜皺褶增多，支氣管上皮水腫、脫落、結(jié)構(gòu)紊亂，黏液腺及杯狀細(xì)胞增加；對照組未見明顯炎性細(xì)胞浸潤、平滑肌層增厚等情況(見圖1)。

2.2 ASMC的鑒定 倒置顯微鏡下觀察可見，ASMC呈梭形，有較長的突起，細(xì)胞核位于細(xì)胞中央，細(xì)胞疏密相間，呈典型的“谷和峰”生長狀態(tài)。α-actin細(xì)胞免疫化學(xué)染色可見免疫反應(yīng)產(chǎn)物呈棕黃色，95%細(xì)胞α-actin染色陽性，透射電鏡下觀察可見細(xì)胞內(nèi)的縱行肌絲結(jié)構(gòu)(見圖2)。

2.3 CCK-8法檢測各組細(xì)胞增殖情況 不同組大鼠ASMC OD 值比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；其中TGF-β1組高于正常組和哮喘組，TGF-β1+ PD98059組、TGF-β1+wortmannin組和TGF-β1+PD98059+wortmannin組低于TGF-β1組，TGF-β1+ PD98059+wortmannin組低于TGF-β1+ PD98059組和TGF-β1+wortmannin組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，見表1)。

2.4 Western blotting法檢測ASMC中p-Akt和p-ERK1/2的表達(dá) 不同組大鼠ASMC中p-Akt比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；其中哮喘組高于正常組，TGF-β1組高于哮喘組，TGF-β1+wortmannin組低于TGF-β1組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，見表2、圖3)。

不同組大鼠ASMC中p-ERK1/2比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；其中哮喘組高于正常組，TGF-β1組高于哮喘組，TGF-β1+ PD98059組低于TGF-β1組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，見表3、圖4)。

表1 各組大鼠ASMC OD 值比較

注：TGF-β1=轉(zhuǎn)化生長因子β1，wortmannin=渥曼青霉素，OD值=吸光度值；與正常組比較，*P<0.01；與哮喘組比較，△P<0.01；與TGF-β1組比較，▲P<0.01；與TGF-β1+PD98059組比較，☆P<0.01；與TGF-β1+wortmannin組比較，★P<0.01

表2 各組大鼠ASMC中p-Akt比較

注：p-Akt=磷酸化蛋白激酶B；與正常組比較，*P<0.01；與哮喘組比較，△P<0.01；與TGF-β1組比較，▲P<0.01

Table 3 Comparison of p-ERK1/2 in ASMC in different groups of rats

組別p-ERK1/2正常組0.43±0.09哮喘組1.34±0.13*TGF-β1組2.18±0.15△TGF-β1+PD98059組0.28±0.06▲F值175.48P值<0.01

注：p-ERK1/2=磷酸化細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2；與正常組比較，*P<0.01；與哮喘組比較，△P<0.01；與TGF-β1組比較，▲P<0.01

注：A為對照組，B為哮喘組

圖1 大鼠肺組織病理學(xué)改變(HE染色，×400)

Figure 1 Pathological changes of lung tissues of rats

注：A透射電鏡下觀察(× 6 000),B倒置顯微鏡下觀察(×100),C特異性免疫化學(xué)染色(×200)；ASMC=氣管平滑肌細(xì)胞

圖2 ASMC的鑒定

Figure 2 Identification of ASMC

注：A為TGF-β1組，B為哮喘組，C為正常組，D為TGF-β1+wortmannin組

圖3 Western blotting法檢測ASMC中p-Akt的表達(dá)

Figure 3 Expression of p-Akt in ASMC by Western blotting

注：A為TGF-β1組，B為哮喘組，C為正常組，D為TGF-β1+ PD98059組

圖4 Western blotting法檢測ASMC中p-ERK1/2的表達(dá)

Figure 4 Expression of p-ERK1/2 in ASMC by Western blotting

3 討論

哮喘是由多種細(xì)胞及細(xì)胞組分參與的慢性氣管炎癥性疾病，該疾病具有反復(fù)性、長期性和周期性的顯著特點。氣管重塑是其重要病理特征之一，ASMC在哮喘氣管重塑的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用[5]。TGF-β是結(jié)構(gòu)相關(guān)的生長因子大家族的一員，也是人體內(nèi)的主要形式，與肺部疾病的慢性進(jìn)展關(guān)系最為密切。Cohell等[6]發(fā)現(xiàn)，哮喘患者發(fā)作期支氣管肺泡灌洗液中TGF-β1水平較控制期明顯增高；在中重度哮喘患者氣管黏膜活檢標(biāo)本中，TGF-β1mRNA和TGF-β1過度表達(dá)[7]，故其與氣管重塑有著重要的關(guān)系[8]，并且通過與受體的特異性結(jié)合來發(fā)揮作用。Ward等[9]研究指出，TGF-β1的表達(dá)水平與氣管狹窄有關(guān)，是引起哮喘氣管重塑的關(guān)鍵遞質(zhì)。本研究也發(fā)現(xiàn)，哮喘大鼠ASMC的增殖較正常大鼠明顯；同時通過TGF-β1對哮喘大鼠ASMC進(jìn)行刺激發(fā)現(xiàn)，TGF-β1組ASMC的增殖較哮喘組明顯，證實了TGF-β1可以增加ASMC的增殖，進(jìn)而引起氣管重塑。

有研究表明，TGF-β1可能是通過ERK信號途徑促進(jìn)大鼠ASMC的增殖作用[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，在TGF-β1刺激ASMC增殖的過程中，TGF-β1組p-ERK1/2表達(dá)高于哮喘組，提示ERK信號途徑在TGF-β1刺激ASMC增殖的過程中發(fā)揮了重要作用。在加入抑制劑PD98059干預(yù)后，TGFβ1+ PD98059組ASMC增殖較TGF-β1組減少，但較哮喘組表達(dá)量仍有所增加，提示TGF-β1促進(jìn)大鼠ASMC的增殖與ERK信號通路有關(guān)，PD98059能抑制上述效應(yīng)，但不能使其恢復(fù)至哮喘組水平，說明TGF-β1引起的細(xì)胞增殖過程中，ERK信號通路可能不是TGF-β1引起的ASMC增殖的唯一通路。

PI3K是介導(dǎo)生長因子、細(xì)胞因子和炎性遞質(zhì)誘導(dǎo)ASMC增殖的另一條重要通路，Akt在P信號通路中起著關(guān)鍵作用[11]。Akt的底物較多，包括BAD、環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CREB)、叉頭轉(zhuǎn)錄因子家族、IK-B激酶等，其底物的多樣性說明了Akt在細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化和細(xì)胞存活中的廣泛作用。本研究發(fā)現(xiàn)，在TGF-β1刺激ASMC增殖的過程中，TGF-β1組p-Akt表達(dá)明顯高于哮喘組，提示PI3K信號通路在TGF-β1刺激ASMC增殖的過程中發(fā)揮了重要作用。

本研究結(jié)果顯示，TGF-β1刺激哮喘ASMC增殖的過程中，分別加用這兩條通路的抑制劑PD98059、wortmannin，實驗發(fā)現(xiàn)p-ERK1/2和 p-Akt的表達(dá)量明顯減少，ASMC增殖減少。提示這兩條通路在TGF-β1刺激哮喘ASMC增殖過程中均發(fā)揮重要作用。本研究進(jìn)一步運用ERK通路抑制劑和PI3K/Akt通路抑制劑進(jìn)行聯(lián)合干預(yù)發(fā)現(xiàn)，與單獨使用ERK通路抑制劑、PI3K/Akt抑制劑比較，ASMC增殖抑制更為明顯，以上結(jié)果提示，PI3K信號通路和ERK信號通路對哮喘大鼠ASMC增殖可能具有協(xié)同效應(yīng)，其機(jī)制可能是共同調(diào)控了ASMC增殖過程。

綜上所述，TGF-β1刺激在引起的哮喘大鼠ASMC增殖過程中，PI3K和ERK信號通路均參加了對其的調(diào)控，兩者之間存在交叉對話，起到了協(xié)同調(diào)控的作用。

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(本文編輯：陳素芳)

Coordinated Regulation of the Proliferation of Airway Smooth Muscle Cells by ERK and PI3K Signal Pathways in Asthmatic Rats

XUHui,DAIYuan-rong,FUYu-ru,etal.

DepartmentofRespiratory,theSecondAffiliatedHospitalofWenzhouMedicalUniversity,Wenzhou325027,China

Objective To investigate the coordinated regulation of the proliferation of airway smooth muscle cells(ASMC) by phosphoinositide-3-kinase(PI3K)and extracellular regulated protein kinases(ERK) signal pathways in asthmatic rats.Methods SPF Sprague Dawley rats of 6 to 9 weeks old were used to establish chronic asthma model.ASMC was cultured in vitro and the cells were divided into normal group,asthma group,TGF-β1group,TGF-β1+ PD98059 group,TGF-β1+wortmannin group and TGF-β1+PD98059+wortmannin group.CCK-8 method was used to detect cell proliferation and Western blotting method was used to detect the expression of p-Akt and p-ERK1/2.Results The OD value of ASMC was determined by CCK-8 method,with the TGF-β1group and TGF-β1+PD98059+wortmannin group significantly higher than the normal and asthma group,the TGF-β1+ PD98059 group and TGF-β1+wortmannin group significantly lower than the TGF-β1group,and the TGF-β1+ PD98059+wortmannin group significantly lower than the TGF-β1+ PD98059 group and TGF-β1+wortmannin group(P<0.01).The expression level of p-Akt in ASMC was determined by Western blotting method,with the asthma group significantly higher than the normal group,the TGF-β1group significantly higher than the asthma group,and the TGF-β1+wortmannin group significantly lower than the TGF-β1group(P<0.01).The expression level of p-ERK1/2 was also determined by Western blotting method,with the asthma group significantly higher than the normal group,the TGF-β1group significantly higher than the asthma group,and the TGF-β1+ PD98059 group significantly lower than the TGF-β1group(P<0.01).Conclusion The signal pathways of PI3K and ERK may coordinately regulate the proliferation of ASMC stimulated by TGF-β1.

Asthma；Signaling pathway；Myocytes,smooth muscle；Cell proliferation；Phosphatidylinositol 3-kinase；Extracellular regulated protein kinases

浙江省自然科學(xué)基金資助項目(Y2080466)；溫州市科技局項目(Y20130351)

325027 浙江省溫州市，溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院呼吸科

戴元榮，325027 浙江省溫州市，溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院呼吸科；E-mail：daiyr@126.com

R 256.12

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2015.09.012

2014-10-27；

2015-01-16)