胰島素通過Akt/FoxO/SVV信號通路抑制缺血再灌注損傷誘導心肌微血管內皮細胞凋亡的作用研究

葉 瑾，司 瑞，郝啟萌，付志誠，張榮慶，郭文怡

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·論著·

胰島素通過Akt/FoxO/SVV信號通路抑制缺血再灌注損傷誘導心肌微血管內皮細胞凋亡的作用研究

葉 瑾，司 瑞，郝啟萌，付志誠，張榮慶，郭文怡

目的 探討胰島素(INS)在抑制缺血再灌注損傷(IRI)誘導的心肌微血管內皮細胞(CMECs)凋亡中的作用及其分子機制。方法 分離和培養(yǎng)大鼠CMECs，建立模擬缺血再灌注(SI/R)模型，分別選用INS、磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)特異性抑制劑渥曼青霉素(Wort)和FoxO1/3a干擾RNA處理細胞。采用隨機數(shù)字表法對大鼠CMECs進行分組：SI/R組(5只大鼠的CMECs)，SI/R+INS組(5只大鼠的CMECs)，SI/R+INS+Wort組(5只大鼠的CMECs)，SI/R+INS+FoxO1siRNA組(6只大鼠的CMECs)，SI/R+INS+FoxO3asiRNA組(4只大鼠的CMECs)。采用末端轉移酶標記技術(TUNEL)檢測各組CMECs凋亡率，ELISA法檢測各組Caspase-3活性，Western blotting法檢測各組p-Akt(Ser473)、p-FoxO1(Ser256)、p-FoxO3a(Thr32)、生存素(SVV)蛋白表達水平。結果 與SI/R組比較，SI/R+INS組、SI/R+INS+FoxO1siRNA組、SI/R+INS+FoxO3asiRNA組CMECs凋亡率及Caspase-3活性均降低(P<0.01)；而SI/R+INS+Wort組CMECs凋亡率及Caspase-3活性與SI/R組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與SI/R+INS組比較，SI/R+INS+FoxO1siRNA組、SI/R+INS+FoxO3asiRNA組CMECs凋亡率及Caspase-3活性升高(P<0.01)；且SI/R+INS+FoxO1siRNA組CMECs凋亡率高于SI/R+INS+FoxO3asiRNA組(P<0.01)。Western blotting檢測結果顯示:SI/R+INS組p-Akt、p-FoxO1、p-FoxO3a、SVV蛋白表達水平均高于SI/R、SI/R+INS+Wort組、SI/R+INS+FoxO1siRNA組以及SI/R+INS+FoxO3asiRNA組(P<0.01)；且SI/R+INS+FoxO3asiRNA組SVV蛋白表達水平低于SI/R+INS+FoxO1siRNA組(P<0.01)。結論 NIS可顯著抑制IRI誘導的CMECs凋亡，其機制可能與激活Akt/FoxO/SVV信號通路相關，且主要通過FoxO3a的激活上調SVV蛋白表達水平，從而抑制CMECs凋亡。

胰島素；再灌注損傷；信號傳導；內皮細胞；細胞凋亡

葉瑾，司瑞，郝啟萌，等.胰島素通過Akt/FoxO/SVV信號通路抑制缺血再灌注損傷誘導心肌微血管內皮細胞凋亡的作用研究[J].中國全科醫(yī)學，2015，18(9)：1012-1017.[www.chinagp.net]

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缺血再灌注損傷(ischemia reperfusion injury，IRI)是急性心肌梗死患者溶栓和冠狀動脈介入治療過程中出現(xiàn)的重要臨床現(xiàn)象，其抵消了血管再通給患者帶來的臨床受益，嚴重時導致患者病情惡化甚至影響遠期預后，因此，如何有效預防并減少IRI是當前研究的熱點[1-4]。研究報道，細胞凋亡是IRI的重要機制之一，以往研究表明，胰島素(INS)可通過絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(Akt)/內皮型一氧化氮合酶(eNOS)/一氧化氮(NO)細胞生存信號機制抑制IRI誘導的心肌細胞或血管內皮細胞凋亡，發(fā)揮心臟保護作用[1-2]，然而其是否能抑制IRI誘導的心肌微血管內皮細胞(cardiac microvascular endothelial cells，CMECs)凋亡及其相關機制少有報道。FoxO1/3a是近年發(fā)現(xiàn)的FoxO家族蛋白，參與體內多種生理活動，特別是對細胞凋亡的調控發(fā)揮重要作用[3-5]。本課題組在前期研究中已證實INS可通過上調凋亡抑制蛋白生存素(survivin，SVV)表達，從而抑制CMECs凋亡[3]，但其相關分子機制是否與激活FoxO1/3a相關仍不明確。本實驗通過建立CMECs的IRI模型，觀察INS在抑制IRI誘導的CMECs凋亡中是否與激活Akt/FoxO1/FoxO3a/SVV信號通路相關。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和材料 清潔級健康雄性SD大鼠25只，體質量150～200 g，由第四軍醫(yī)大學動物實驗中心提供。胎牛血清、DMEM低糖培養(yǎng)基購自北京索萊寶科技有限公司。末端轉移酶標記技術(terminal dexynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL)試劑盒購自Roche公司。磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)抑制劑渥曼青霉素(Wort，100 nmol/L)抗體購自Abcam公司。INS、Akt、p-Akt(Ser473)、FoxO1、p-FoxO1(Ser256)、FoxO3a、p-FoxO3a(Thr32)及SVV抗體均購自Cell Signaling公司。FoxO1/3asiRNA、NC siRNA購自上海吉瑪制藥技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 大鼠CMECs的分離培養(yǎng) SD大鼠脫頸處死后在無菌環(huán)境下取出心臟，剪取心尖部，置入75%乙醇中浸泡15 s以滅活心內膜外細胞。將實驗所需心肌組織剪碎呈1 mm3，加入Ⅱ型膠原酶(0.2 g/L)3 ml，置入37 ℃水浴鍋中消化5 min，再加入胰蛋白酶(0.25 g/L)4 ml消化5 min；最后DMEM低糖培養(yǎng)基終止消化，以1 200 r/min離心15 min(離心半徑為3.5 cm)。棄上清液，DMEM(20%FBS)無糖培養(yǎng)基重懸后接種于25 cm2培養(yǎng)瓶，于37 ℃、5%CO2恒溫孵箱中培養(yǎng)，孵育6 h后第一次換液，以后每2 d換液1次。2～3 d后細胞呈鋪路石狀長滿培養(yǎng)瓶底并行細胞傳代。當細胞呈對數(shù)生長期時作為下一步實驗所需細胞。

1.2.2 模擬缺血再灌注(SI/R)模型的建立與分組 建立SI/R模型，將培養(yǎng)液更換為缺血液，置于37 ℃三氣孵箱內孵育，2 h后取出培養(yǎng)瓶。按隨機數(shù)字表法對大鼠的CMECs進行分組：(1)SI/R組(5只大鼠的CMECs)，再灌注時更換正常培養(yǎng)液；(2)SI/R+INS組(5只大鼠的CMECs)，再灌注加入含INS的培養(yǎng)液；(3)SI/R+INS+Wort組(5只大鼠的CMECs)，缺血前15 min給予PI3K抑制劑Wort(100 nmol/L)，再灌注加入含INS的培養(yǎng)液；(4)SI/R+INS+FoxO1siRNA組(6只大鼠的CMECs)，缺血48 h前給予FoxO1siRNA-脂質體復合物溶液；(5)SI/R+INS+FoxO3asiRNA組(4只大鼠的CMECs)，缺血48 h前給予FoxO3asiRNA-脂質體復合物溶液。隨后根據(jù)不同分組更換培養(yǎng)液，然后37 ℃、5%CO2孵箱內孵育4 h后檢測。

1.2.3 siRNA的合成與轉染 大鼠CMECs FoxO1siRNA mRNA上游引物為5′-GAGGAUUGAACCAGUAUAATT-3′，下游引物為5′-UUAUACUGGUUCAAUCCUCTT-3′，F(xiàn)oxO3asiRNA mRNA上游引物為5′-GCACCAUGAAUCTGACCGAUT-3′，下游引物為5′-UCGGUCACAUUCAUGGUGCGT-3′，NC siRNA mRNA上游引物為5′-UCUUCTGUCAGUGUCTCGUGT-3′，下游引物為5′-CGCUGACACTUCCGGAGUACT-3′。轉染前24 h，將CMECs接種在6孔板上，每孔約5×106個細胞，使每孔細胞飽和度在轉染前達到70%～80%，使用不含雙抗的培養(yǎng)液，按轉染試劑說明書進行瞬時轉染。將FoxO1/3asiRNA及NC siRNA分別和Lipofectamine2000按4∶100 mg/L的比例，用250 μl轉染專用液Opti-MEMI稀釋，孵育5 min后，稀釋的siRNA和Lipofectamine2000混勻，常溫孵育20 min，然后將500 μl混合物加入細胞培養(yǎng)基中，輕輕混勻，37 ℃培養(yǎng)6 h，將培養(yǎng)液吸出，加入新鮮培養(yǎng)基。

1.2.4 TUNEL染色法 成功構建SI/R模型，收集細胞并制備爬片，根據(jù)TUNEL試劑盒說明書要求進行染色操作。光學顯微鏡下觀察，每張爬片隨機選取8個視野(×200)進行計數(shù)，分別計算總的CMECs數(shù)和凋亡細胞數(shù)，計算平均值。凋亡率=凋亡細胞數(shù)/總的CMECs數(shù)×100%。

1.2.5 Caspase-3活性檢測 按試劑盒說明操作，以6孔板培養(yǎng)CMECs，待細胞貼壁達80%左右后分組實驗。碧云天BCA試劑盒測定蛋白水平，各組取150 μg CMECs與Caspase-3底物反應，以測定405 nm處的吸光度值(A)作為實驗值，同時取細胞裂解液與Caspase-3底物反應測定A405作為本底值。Caspase-3活性=實驗值A405-本底值A405。

1.2.6 Western blotting法檢測p-Akt、p-FoxO1、p-FoxO3a、SVV蛋白表達水平 分離培養(yǎng)細胞，并成功構建模型后，將各組細胞重懸至細胞裂解液中，4 ℃裂解細胞，以1 000 r/min低溫離心15 min(離心半徑為13.5 cm)。取上清液，BCA法測定蛋白水平，各組上樣60 μg，100 ml/L聚丙烯酰胺電泳分離并轉至硝酸纖維膜，含5%脫脂奶粉封閉1 h，兔抗FoxO1、FoxO3a抗體(1∶1 000)4 ℃孵育過夜，TBST溶液洗膜3次，15 min/次。室溫下加入辣根過氧化物酶標的山羊抗兔二抗(1∶500)孵育2 h，洗膜3次。以β-actin作為內參照標化FoxO1、FoxO3a表達，以GAPDH作為內參照標化SVV蛋白表達，Western blotting的結果采用Gel-pro Analyzer 4.5軟件進行灰度分析。

2 結果

2.1 各組CMECs凋亡率比較 5組CMECs凋亡率比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。組間兩兩比較：與SI/R組比較，SI/R+INS組、SI/R+INS+FoxO1siRNA組、SI/R+INS+FoxO3asiRNA組的CMECs凋亡率均降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；與SI/R+INS組比較，SI/R +INS+Wort組、SI/R+INS+FoxO1siRNA組、SI/R+INS+FoxO3asiRNA組的CMECs凋亡率均升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；且SI/R+INS+FoxO1siRNA組的CMECs凋亡率低于SI/R+INS+FoxO3asiRNA組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；SI/R組與SI/R +INS+Wort組的CMECs凋亡率比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，見圖1、表1)。

2.2 Caspase-3活性比較 5組細胞Caspase-3活性比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。組間兩兩比較：與SI/R組比較，SI/R+INS組、SI/R+INS+FoxO1siRNA組、SI/R+INS+FoxO3asiRNA組的Caspase-3活性均降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；與SI/R+INS 組比較，SI/R+INS+Wort組、SI/R+INS+FoxO1siRNA組、SI/R+INS+FoxO3asiRNA組的Caspase-3活性均升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；且SI/R+INS+FoxO1siRNA組高于SI/R+INS+FoxO3asiRNA組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；SI/R組與SI/R +INS+Wort組的Caspase-3活性比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，見表1)。

注：末端轉移酶標記技術(TUNEL)染色陽性為凋亡細胞，呈綠色熒光；4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)對所有細胞核進行染色，呈藍色熒光

圖1 TUNEL法檢測CMECs凋亡率(×200)

Figure 1 CMECs apoptosis rate detected by TUNEL

Table 1 Comparison of apoptosis rate of CMECs and activity of Caspase-3 in each group

組別例數(shù)CMECs凋亡率(%)Caspase-3活性SI/R組525.64±1.62175.00±12.46SI/R+INS組57.06±0.97*41.60±7.50*SI/R+INS+Wort組525.14±1.61△157.60±14.17△SI/R+INS+FoxO1siRNA組615.91±1.84*△127.66±20.84*△SI/R+INS+FoxO3asiRNA組417.60±7.30*△▲108.50±8.69*△▲F值133.6166.16P值<0.01<0.01

注：與SI/R組比較,*P<0.01;與SI/R+INS組比較,△P<0.01;與SI/R+INS+FoxO1siRNA組比較,▲P<0.01;CMECs=心肌微血管內皮細胞

2.3 CMECs中p-Akt、p-FoxO1、p-FoxO3a、SVV蛋白表達水平比較 Western blotting檢測結果顯示，5組細胞p-Akt水平比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)；組間兩兩比較：與SI/R組比較，SI/R+INS組、SI/R+INS+Wort組、SI/R+INS+FoxO1siRNA組、SI/R+INS+FoxO3asiRNA組p-Akt水平升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；SI/R+INS組p-Akt水平較SI/R+INS+Wort組升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與SI/R+INS+Wort組比較，SI/R+INS+FoxO1siRNA組、SI/R+INS+FoxO3asiRNA組p-Akt水平升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見圖2)。5組細胞p-FoxO1、p-FoxO3a水平比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.001)；組間兩兩比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見圖3、4)。5組SVV蛋白表達水平比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001);組間兩兩比較：與SI/R組比較，SI/R+INS組、SI/R+INS+Wort組、SI/R+INS+FoxO1siRNA組、SI/R+INS+FoxO3asiRNA組SVV蛋白表達水平升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與SI/R+INS組比較，SI/R+INS+Wort組、SI/R+INS+FoxO3asiRNA組SVV蛋白表達水平降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與SI/R+INS+Wort組比較，SI/R+INS+FoxO1siRNA組、SI/R+INS+FoxO3asiRNA組SVV蛋白表達水平升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；SI/R+INS+FoxO1siRNA組SVV蛋白表達水平較SI/R+INS+FoxO3asiRNA組升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；而SI/R+INS+FoxO1siRNA組與SI/R+INS組的SVV蛋白表達水平比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，見圖5、表2)。

3 討論

血管內皮細胞是血液與組織之間的生理屏障，承擔著至關重要的生理功能，對維護機體穩(wěn)態(tài)十分重要。CMECs與其他內皮細胞相比，在形態(tài)和功能上均具有顯著特異性[6]。研究發(fā)現(xiàn)，在IRI中CMECs凋亡明顯早于心肌細胞，提示CMECs是IRI中最早并最先波及的部位，因此保護CMECs是早期抑制IRI的關鍵因素[7-8]。

Fox基因即Forkhead，命名起源于1989年首次發(fā)現(xiàn)果蠅的“叉頭”，是上述叉頭轉錄因子的總稱，F(xiàn)oxO是Forkhead轉錄因子家族中的亞族，F(xiàn)oxO1、FoxO3a是人類O亞家族4個同源基因中的重要成員，其通過轉錄調控手段，在細胞的生長、分化、代謝、凋亡和免疫等方面起關鍵作用[9-11]。PI3K/Akt是細胞內重要的促增殖和抗凋亡的經(jīng)典信號轉導通路，可通過影響下游細胞周期調節(jié)蛋白和凋亡相關蛋白等效應分子的活性實現(xiàn)其激活，導致細胞周期的失控和細胞凋亡的異常[12]。研究證實，F(xiàn)oxO1、FoxO3a是Akt的主要靶蛋白[13]。文獻報道，Akt從不同位點上磷酸化FoxO1、FoxO3a，在結構蛋白14-3-3的協(xié)調作用下，使得FoxO1、FoxO3a發(fā)生核排斥，從細胞核內易位并滯留于細胞質中，伴隨轉錄激活靶基因活性表達的降低，使得FoxO1、FoxO3a活性受到抑制，從而促進細胞生長和增殖，抑制凋亡[13-17]。筆者在研究中發(fā)現(xiàn)，INS可通過激活PI3K/Akt信號通路促使FoxO1、FoxO3a發(fā)生磷酸化，抑制IRI誘導的CMECs凋亡，這與Daly等[18]的研究發(fā)現(xiàn)類似，但其下游分子尚不清楚。SVV是近年發(fā)現(xiàn)的一個抑制細胞凋亡的重要分子，筆者前期研究同時發(fā)現(xiàn)，IRI本身可刺激心肌細胞表達少量的SVV，而INS也可通過激活PI3K/Akt信號通路抑制心肌細胞凋亡，同時證實，顯著提高SVV蛋白表達水平后，可抑制IRI誘導的CMECs凋亡[3,7]，但 FoxO1/3a是否通過參與此信號通路并調節(jié)SVV蛋白表達水平來誘導CMECs的增殖與凋亡尚不明確。

圖2 Western blotting法檢測p-Akt水平

圖3 Western blotting法檢測FoxO1表達量及p-FoxO1水平

Figure 3 FoxO1expression and FoxO1Phosphorylation level detected by western blotting

圖4 Western blotting法檢測FoxO3a表達量及p-FoxO3a水平

Figure 4 FoxO3aexpression and FoxO3aPhosphorylation level detected by western blotting

注：SVV=生存素

圖5 Western blotting法檢測SVV表達量

注：與SI/R組比較,*P<0.05;與SI/R+INS組比較,△P<0.05;與SI/R+INS+Wort組比較,▲P<0.05;與SI/R+INS+FoxO1siRNA組比較,★P<0.05；SVV=生存素；-代表不存在

本實驗中，通過建立CMECs SI/R模型，分別應用PI3K特異性抑制劑Wort、FoxO1/3a干擾RNA處理細胞，發(fā)現(xiàn)在SI/R后，p-FoxO1、p-FoxO3a水平降低，給予INS培養(yǎng)液后，p-FoxO1/3a水平及下游分子SVV蛋白表達水平均升高；分別給予FoxO1/3a干擾RNA后發(fā)現(xiàn)，p-FoxO1、p-FoxO3a、SVV蛋白表達水平均降低，且SI/R+INS+FoxO3asiRNA組SVV蛋白表達水平低于SI/R+INS+FoxO1siRNA組。由此推測，INS通過PI3K/Akt/FoxO信號通路，促使CMECs內FoxO1/3a發(fā)生磷酸化，且主要為FoxO3a磷酸化，從而顯著上調 SVV蛋白表達水平，抑制IRI誘導的CMECs凋亡；同時也在實驗中發(fā)現(xiàn)，加入PI3K/Akt特異性抑制劑Wort后，CMECs凋亡率升高，推測在IRI誘導的CMECs凋亡中尚有其他信號通路存在。

綜上所述，INS可通過Akt/FoxO/SVV信號通路抑制IRI誘導的CMECs凋亡，同時為INS治療IRI提供重要的理論依據(jù)。對于其他信號通路如何調控IRI誘導的CMECs凋亡加重心肌IRI的機制，還有待于后續(xù)研究。

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(本文編輯：高曉歡)

Research on Insulin Inhibition of Cardiac Microvascular Endothelial Cells Apoptosis Induced by Ischemia Reperfusion Injury through Akt/FoxO/SVV Pathway

YEJin,SIRui,HAOQi-meng,etal.

DepartmentofCardiology，XijingHospitalofFourthMilitaryMedicalUniversity，Xi′an710032，China

Objective To explore the effect and mechanisms of insulin(INS) inhibition of apoptosis of microvascular endothelial cells (CMECs) induced by ischemia reperfusion injury(IRI).Methods CMECs were isolated from the hearts of adult rats to establish IRI model.INS,Wortmannin(Wort) and FoxO1/3asiRNA were used to process the cells.The CMECs were randomly divided into SI/R group (CMECs of 5 rats),SI/R+INS group(CMECs of 5 rats),SI/R+INS+Wort group(CMECs of 5 rats),SI/R +INS+FoxO1siRNA group(CMECs of 6 rats) and SI/R+INS+FoxO3asiRNA group(CMECs of 4 rats).TUNEL was used to detect the apoptosis rate of CMECs in each group.ELISA was used to detect the activity of Caspase-3 in each group.Western blotting method was used to detect the levels of p-Akt (Ser473),p-FoxO1(Ser256) and p-FoxO3a(Thr32) and the protein expression of SVV.Results Compared with SI/R group,apoptotic index and Caspase-3 activity were significantly lower in groups of SI/R+INS,SI/R+INS+FoxO1siRNA,SI/R+INS+FoxO3asiRNA(P<0.01);but the apoptotic index and Caspase-3 activity in SI/R+INS+Wort group showed no significant difference compared with SI/R group (P>0.05);compared with SI/R+INS group,apoptotic index and Caspase-3 activity was significantly increased in groups of SI/R+INS+FoxO1siRNA and SI/R+INS+FoxO3asiRNA,and the apoptotic index in SI/R+INS+FoxO1siRNA group was significantly higher than that of the SI/R+INS+FoxO3asiRNA group (P<0.01).Western blotting analysis showed that p-Akt level,p-FoxO1level,p-FoxO3alevel and SVV protein expression in SI/R+INS group were significantly higher than groups of SI/R,SI/R+INS +Wort,SI/R+INS+FoxO1siRNA and SI/R+INS+FoxO3asiRNA (P<0.01);and the SVV protein expression in SI/R+INS+FoxO3asiRNA group was significantly lower than that of the SI/R+INS+FoxO1siRNA group (P<0.01).Conclusion INS can significantly inhibit the apoptosis of CMECs induced by IRI,and the possible mechanism may be the activation of Akt/FoxO1/SVV pathway,and it is mainly through the up-regulation of SVV based on the activation of FoxO3a.

Insulin;Reperfusion injury;Signal transduction;Endothelial cells;Apoptosis

國家自然科學基金資助項目(81070126)

710032 陜西省西安市，第四軍醫(yī)大學西京醫(yī)院心內科

郭文怡，710032 陜西省西安市，第四軍醫(yī)大學西京醫(yī)院心內科；E-mail：guowenyi@tom.com

R 322.13

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2015.09.008

2014-09-26；

2015-01-01)