香煙提取物對大鼠骨骼肌細胞肌肉生長抑制素表達的影響研究

鄧俊亮，吳 健，楊士芳

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香煙提取物對大鼠骨骼肌細胞肌肉生長抑制素表達的影響研究

鄧俊亮，吳 健，楊士芳

目的 探討香煙提取物(CSE)對骨骼肌細胞肌肉生長抑制素(MSTN)表達的影響。方法 取新生3～5 d的SD大鼠的骨骼肌組織，用含150 ml/L胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)進行體外原代細胞培養(yǎng)和傳代。采用免疫熒光鑒定檢測骨骼肌細胞。選擇恰當?shù)腃SE濃度(2.5%、5.0%、10.0%)刺激48 h，分為2.5%組、5.0%組、10.0%組和對照組(不予CSE刺激)，分別采用實時定量PCR 檢測MSTN mRNA的表達水平與Western blotting 檢測MSTN蛋白的表達水平。結(jié)果 骨骼肌細胞培養(yǎng)成活率高，體外生長、增殖良好。實時定量PCR 檢測結(jié)果顯示，4組MSTN mRNA 相對表達水平比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；其中，5.0%組、10.0%組MSTN mRNA 相對表達水平高于對照組和2.5%組(P<0.05)。Western blotting檢測結(jié)果顯示，4組MSTN蛋白表達水平比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；其中，5.0%組、10.0%組MSTN蛋白表達水平高于對照組和2.5%組(P<0.05)。結(jié)論 骨骼肌細胞模型可對CSE刺激產(chǎn)生有效反應(yīng)，為吸煙引起骨骼肌抑制的機制研究奠定了細胞學基礎(chǔ)。

肌肉生長抑制素；肺疾病，慢性阻塞性；肌細胞；骨骼；大鼠

鄧俊亮，吳健，楊士芳.香煙提取物對大鼠骨骼肌細胞肌肉生長抑制素表達的影響研究[J].中國全科醫(yī)學，2015，18(12)：1401-1405.[www.chinagp.net]

Deng JL,Wu J,Yang SF.Influence of cigarettes smoke extract on the expression of MSTN in SD rat skeletal muscle cells[J].Chinese General Practice，2015，18(12)：1401-1405.

目前，慢性阻塞性肺疾病(COPD)仍然是一個重要的公共衛(wèi)生問題；我國40歲以上人群COPD患病率為8.2%，每年致殘人數(shù)達500～1 000萬，致死人數(shù)達100萬。到2020年，COPD將成為世界第三大死亡原因，居世界經(jīng)濟負擔第5位[1]。迄今為止，吸煙是引起COPD 的主要危險因素[2]。COPD不僅累及肺臟，同時也涉及多器官受損，包括骨骼肌功能障礙(SMD)和其他系統(tǒng)(如心血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、消化系統(tǒng)等)功能障礙。肌肉生長抑制素(myostatin，MSTN)主要表達于骨骼肌，其主要作用為抑制肌肉的生長發(fā)育，導致肌肉消耗和萎縮[3]。正常情況下，MSTN以無活性的形式存在，在酸血癥、氧化損傷、使用糖皮質(zhì)激素[4]、缺氧[5]等高危因素下均可通過直接或間接途徑激活，刺激MSTN高表達；而COPD患者存在缺氧、CO2潴留、使用糖皮質(zhì)激素等條件。研究證明，MSTN在COPD患者血中高表達，促使骨骼肌消耗及功能障礙[6]。香煙、COPD、MSTN、SMD存在關(guān)聯(lián)。本研究旨在觀察大鼠骨骼肌細胞經(jīng)香煙提取物(CSE)刺激形成COPD模型后MSTN的表達水平，并初步評價其在COPD患者SMD中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器 新生3～5 d的SD大鼠6只，雌雄1∶1，購于中山大學實驗動物中心，SPF級。15%胎牛血清(Mediatech,美國)，高糖DMEM(Gibco,美國),引物(TaKaRa,日本)，鼠抗MSTN一抗(R&D 公司,美國)，鼠抗β-actin組蛋白一抗(DSHB，美國)，驢抗羊IgG 二抗(Sigma,美國)，TRIizol(Molecular,美國)，生物發(fā)光顯色劑(碧云天生物技術(shù)研究所,中國)。CO2培養(yǎng)箱(SANYO,日本)，倒置顯微鏡(Olympus,日本)，PTC 200 RT-PCR儀(MJ Research,美國)，LAS-500(富士山,日本)，聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠電泳及轉(zhuǎn)膜裝置(Bio-Rad 公司,美國)。

1.2 方法

1.2.1 原代細胞培養(yǎng) 術(shù)前培養(yǎng)瓶包被多聚L賴氨酸[7]，將新生SD大鼠拉頸處死，取雙側(cè)大腿肌肉，去脂肪、血液、結(jié)締組織，剪碎至1 mm3。

1.2.1.1 組織塊培養(yǎng) 將碎塊移入培養(yǎng)瓶，0.3 cm間距，翻轉(zhuǎn)放置37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)3～5 h；從無細胞面加入15%胎牛血清培養(yǎng)基，再翻轉(zhuǎn)，放置37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每天換液[8]；約3 d，細胞覆蓋瓶壁70%以上，傳代。

1.2.1.2 單層細胞培養(yǎng) 將碎塊移入小燒瓶，加入0.25%胰蛋白酶，放置37 ℃水浴杯20 min；加入15%胎牛血清培養(yǎng)基，1 000 r/min(離心半徑20 cm)，離心10 min，吸出上清液；上述重復2～3次，集合上清液依次濾過100目、200目篩網(wǎng)，離心后棄上清液，加入15%胎牛血清培養(yǎng)基，重新接種培養(yǎng)瓶(細胞濃度5×105/ml)；放置37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每天換液[9]。約1周，細胞覆蓋瓶壁70%以上，傳代。并在倒置顯微鏡下觀察細胞的形態(tài)。

1.2.2 免疫熒光鑒定 取第3、4代骨骼肌細胞滴加于蓋玻片上，放置37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，定期換液。當增殖70%密度后取出細胞爬片，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次。4%多聚甲醛固定，室溫20 min，PBS 洗滌3 次，5 min /次；0.3%PBS-曲拉通通透，室溫20 min，PBS洗滌3次，5 min /次；再用正常山羊血清封閉非特異性位點，室溫30 min；每張切片樣本中加入一抗(兔抗大鼠α1-action 1∶50)，置于濕盒中4 ℃過夜，PBS 洗滌3 次，5 min /次；二抗〔羊抗兔-異硫氰酸熒光素(FITC)1∶300〕置于濕盒中室溫避光孵育2 h，PBS 洗滌3次，5 min/次；最后加入含4 ′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)的抗熒光猝滅封片劑封片，4 ℃保存，免疫熒光鏡下觀察并攝片。

1.2.3 CSE的制備 按金常娥等[10]方法制作CSE，選用市售紅雙喜香煙(廣東中煙工業(yè)公司)，烤煙型，每支香煙焦油含量11 mg，煙氣煙堿含量1.0 mg，煙氣一氧化碳含量13 mg。將1支香煙點燃，其過濾嘴端接1根玻璃管，玻璃管的另一端接橡膠管、50 ml注射器；點燃香煙，每次吸50 ml，共收集12管 600 ml煙霧，將煙霧注入含25 ml PBS的玻璃瓶中，即為100%原液；均于使用前30 min制備，用0.22 μm微孔濾膜過濾去除細菌和大顆粒。

1.2.4 CSE濃度選擇 分別制成體積比(V/V)為1%、2%、4%、6%、8%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、98%CSE濃度的15%胎牛血清高糖DMEM培養(yǎng)液。6孔板細胞覆蓋瓶壁50%以上，分別加入上述添加CSE的培養(yǎng)液，放置37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每天換液；分別于6、12、18、24、30、36、42、48、54、60、66、72 h在倒置顯微鏡下動態(tài)觀察細胞生長情況，并拍照為證。結(jié)果1%～10% CSE刺激的細胞在72 h后仍貼壁生長；≥15% CSE刺激的細胞6 h開始出現(xiàn)細胞質(zhì)回縮、細胞變圓球形、細胞間隙增大現(xiàn)象，12 h后出現(xiàn)細胞懸??；上述情況進行性加重，在24 h后，細胞完全懸?。豢紤]貼壁細胞已經(jīng)死亡。上述處理4次。本實驗要求細胞在CSE中生長48 h,所以只能先用10%以內(nèi)的濃度，為了容易觀察實驗，故選擇2.5%、5.0%、10.0%CSE。

1.2.5 實時定量PCR 檢測MSTN mRNA的表達 在骨骼肌細胞長滿細胞覆蓋瓶壁70%以上后分為2.5%組、5.0%組、10.0%組和對照組(不予CSE刺激)。用TRIzol裂解，常規(guī)提取總RNA，D260 nm/D280 nm值進行RNA 定量和質(zhì)量檢測，采用三步法實時定量PCR檢測MSTN mRNA的表達水平。根據(jù)基因庫中SD大鼠MSTN堿基序列，設(shè)計其基因部分片段的擴增引物，MSTN上游引物：5′-ATTATCACGCTACCACGGAAACA-3′；下游引物：5′-AGCTGGGCCTTTACCACTTTG-3′。反轉(zhuǎn)錄程序:42 ℃ 延伸60 min，72 ℃變性5 min，12 ℃維持。PCR 反應(yīng)程序為:95 ℃預變性10 min，95 ℃變性15 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，共40個循環(huán)，4 ℃維持。擴增產(chǎn)物經(jīng)PTC 200 RT-PCR 儀處理，作mRNA的相對含量〔將甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)作為內(nèi)參照而求得的相對含量〕，以2-ΔΔCT表示。檢測13次。

1.2.6 Western blotting 檢測MSTN蛋白的表達 采用十二烷基硫酸鈉(SDS)蛋白裂解液分別提取48 h 時相的各組骨骼肌細胞的總蛋白，并用BCA試劑盒進行蛋白定量；行12%SDS-PAGE凝膠電泳，以β-actin蛋白為內(nèi)參，然后將蛋白轉(zhuǎn)印至聚偏氟乙烯膜(PDVF)，用TBST(Tris-buffered saline-Tween) 配制的5%脫脂奶粉低速室溫封閉1 h；用5%脫脂奶粉封閉液稀釋的鼠抗MSTN一抗(1∶100)和鼠抗β-actin組蛋白一抗(1∶1 000)4 ℃過夜；用1×TBST于脫色搖床中洗滌3次，15 min、5 min、5 min；再以5%脫脂奶粉稀釋辣根過氧化酶標記的驢抗羊IgG二抗(1∶5 000) 4 ℃孵育3 h;最后用1×TBST于脫色搖床中洗滌3 次，10 min/次；在暗室中進行生物發(fā)光顯色，暗室曝光。檢測33次。

2 結(jié)果

2.1 骨骼肌細胞培養(yǎng)的形態(tài)學觀察 倒置顯微鏡下可見，骨骼肌細胞剛鋪板于15%胎牛血清培養(yǎng)基時細胞呈圓形，形態(tài)均一，折光性強，懸浮于培養(yǎng)基中；5～6 h后開始貼壁，24 h后完全貼壁，并開始增生，細胞逐漸延伸成梭形，相互融合，按一定方向有序排列。隨細胞密度的增加,細胞逐漸有規(guī)律地平行排列；培養(yǎng)至2～3 d 時細胞分化達到高峰，隨后逐漸開始凋亡、漂浮(見圖1)。

2.2 免疫熒光鑒定 將分化成熟的細胞，行α1-action免疫熒光染色，90%以上的細胞呈陽性反應(yīng)，細胞核染成藍色，表明培養(yǎng)的細胞為骨骼肌細胞(見圖2)。

圖1 骨骼肌細胞培養(yǎng)的形態(tài)學觀察(×20)

圖2 骨骼肌細胞的免疫熒光鑒定(×200)

2.3 MSTN mRNA相對表達水平 實時定量PCR 檢測結(jié)果顯示，4組MSTN mRNA 相對表達水平比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；其中，5.0%組、10.0%組MSTN mRNA 相對表達水平高于對照組和2.5%組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見表1)。

2.4 MSTN蛋白表達水平 Western blotting檢測結(jié)果顯示，4組MSTN蛋白表達水平比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；其中，5.0%組、10.0%組MSTN蛋白表達水平高于對照組和2.5%組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見表2、圖3)。

Table 1 Comparison of relative expression level of MSTN mRNA among four groups

組別例數(shù)MSTNmRNA相對表達水平對照組131.000±0 2.5%組131.767±1.416 5.0%組134.936±4.950*△10.0%組115.460±6.067*△F值4.113P值0.011

注：MSTN=肌肉生長抑制素；與對照組比較，*P<0.05；與2.5%組比較，△P<0.05

表2 4組MSTN蛋白表達水平比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與2.5%組比較，△P<0.05

注：MSTN=肌肉生長抑制素

圖3 CSE刺激48 h 后MSTN蛋白的表達

Figure 3 The expression of MSTN proteins after 48 h of CSE stimulation

3 討論

COPD患者中90%是吸煙者或曾經(jīng)有過吸煙史[11]。香煙產(chǎn)生的大量活性氧(ROS)可導致氧化應(yīng)激。有證據(jù)顯示，COPD患者骨骼肌組織的氧化應(yīng)激明顯增加，且這種增加與其活動能力和活動耐力呈負相關(guān)[12]。與同年齡的健康對照者相比，COPD患者骨骼肌力量下降[13]，且下肢比上肢明顯，尤其股四頭肌的耐力明顯下降[14]，而且抗氧化治療可以改善COPD患者的骨骼肌活動耐力[15]。故可以認為，香煙產(chǎn)生ROS導致氧化應(yīng)激，作用于骨骼肌產(chǎn)生SMD。

呼吸系統(tǒng)不僅是氧化應(yīng)激的主要靶器官，ROS可以隨著血液循環(huán)分布于全身各個臟器，作為人體最大體積的一種器官組織——肌肉組織，同樣也是氧化應(yīng)激的“受害者”。過去一直認為COPD患者出現(xiàn)運動受限主要是因為肺功能受損所致。但近年來越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，在運動受限的COPD患者中，約40%患者肺功能并沒有嚴重受損，而表現(xiàn)為明顯的SMD[16-17]。研究表明，COPD患者常見骨骼肌無力，可早于惡病質(zhì)；晚期COPD患者骨骼肌明顯萎縮，與呼吸功能、活動耐量、健康狀態(tài)和病死率增加有關(guān)[18]。膈肌和股四頭肌中的MSTN高表達[19-20]。再者，COPD患者肌肉的毛細血管密度[21]及代謝活性均下降[22]。因此推斷，CSE可導致MSNT水平升高，骨骼肌消耗和萎縮；最終導致肌肉耐力、速度下降，加劇呼吸肌無力，與COPD呈正相關(guān)。

本實驗采用香煙煙霧暴露建立SD大鼠的COPD模型。研究結(jié)果顯示，與對照組比較，5.0%組和10.0%組骨骼肌細胞MSTN mRNA相對表達水平和MSTN蛋白表達水平均增高。

COPD是一種慢性系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)性疾病，常見癥狀是全身骨骼肌消耗，呼吸肌作為最重要的骨骼肌之一，與生命息息相關(guān)。呼吸肌消耗及功能障礙導致的呼吸衰竭是許多疾病晚期死亡的主要原因。而膈肌作為主要呼吸肌，MSTN抗體可使膈肌修復，長期使用則可改善膈肌形態(tài)并促進其收縮功能[23]。目前,COPD患者SMD尚未得到足夠重視，對于改善骨骼肌功能障礙狀態(tài)以緩解COPD臨床癥狀的研究較少；且尚未發(fā)現(xiàn)更為有效的方法來阻止或逆轉(zhuǎn)其發(fā)展。因此，通過對大鼠骨骼肌細胞MSTN的表達水平實驗，了解其在呼吸肌中的變化；有望為COPD患者提供以MSTN作為靶向目標的治療前景[24]，為COPD患者提供更好、更全面的治療，改善預后，提高生活質(zhì)量。

綜上所述，本研究從細胞模型水平，采用分子生物學和生理學的方法，研究MSTN參與COPD患者SMD發(fā)病的機制，為進一步闡明COPD患者SMD的發(fā)病機制并對其進行治療提供新的思路及策略。再者，證實香煙對骨骼肌的毒性作用，戒煙是防治COPD/肺氣腫的重要有效措施，具有重要的臨床和社會價值。

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(本文編輯：陳素芳)

Influence of Cigarettes Smoke Extract on the Expression of MSTN in SD Rat Skeletal Muscle Cells

DENGJun-liang,WUJian,YANGShi-fang.

SouthernMedicalUniversity,Guangzhou510515,China

Objective To investigate the influence of cigarettes smoke extract(CSE) on the expression of MSTN in skeletal muscle cells.Methods The skeletal muscle tissues from newborn SD rat within 3-5 days old,were cultured and subcultured in high glucose DMEM with 150 ml/L fetal bovine serum in a incubator for proliferation in vitro.The skeletal muscle cells were detected by immunofluorescence technology.The skeletal muscle cells were treated with different levels of CSE(2.5%,5.0%,10.0%) for 48 h,and according to CSE concentration,skeletal muscle cells were divided into 2.5% group,5.0% group,10.0% group,and control group(cells were not treated with CSE) respectively.The expression of MSTN mRNA was detected by RT-PCR,and the expression of MSTN proteins was detected by Western blotting technology.Results The survival rate of skeletal muscle cells was high in vitro,and the growth and proliferation status was good.According to RT-PCR results,there were significant differences in relative expression level of MSTN mRNA among four groups(P<0.05).The relative expression level of MSTN mRNA in 5.0% group and in 10.0% group was significantly higher than that in control group and in 2.5% group,respectively(P<0.05).According to Western blotting results,there were significant differences in expression level of MSTN proteins among four groups(P<0.05).The expression level of MSTN proteins in 5.0% group and in 10.0% group was significantly higher than that in control group and in 2.5% group,respectively(P<0.05).Conclusion Skeletal muscle cell model can effectively respond to CSE stimulation,which provides cytological basis for mechanism research on cigarettes smoke-induced skeletal muscle inhibition.

Myostatin；Pulmonary disease,chronic obstructive；Muscle cells；Skeleton；Rats

國家自然科學基金資助項目(81300034)

510515廣東省廣州市，南方醫(yī)科大學(鄧俊亮)；廣東省人民醫(yī)院呼吸科(吳健，楊士芳)

吳健,510080廣東省廣州市，廣東省人民醫(yī)院呼吸科；E-mail：wujian67@aliyun.com

R 563

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2015.12.011

2014-11-16；

2015-01-25)