磷脂酶A2-ⅡA亞型基因rs11677 C/T多態(tài)位點(diǎn)基因突變及蛋白表達(dá)與食管鱗狀細(xì)胞癌臨床病理特征的關(guān)聯(lián)性研究

翟艷春，魏文強(qiáng)，何 燕，李新慶，王 嵬，劉 芬

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磷脂酶A2-ⅡA亞型基因rs11677 C/T多態(tài)位點(diǎn)基因突變及蛋白表達(dá)與食管鱗狀細(xì)胞癌臨床病理特征的關(guān)聯(lián)性研究

翟艷春，魏文強(qiáng)，何 燕，李新慶，王 嵬，劉 芬

目的 探討磷脂酶A2-ⅡA亞型(PLA2G2A)基因中的單核苷酸多態(tài)性(SNP)rs11677 C/T多態(tài)位點(diǎn)基因突變及蛋白表達(dá)與食管鱗狀細(xì)胞癌(ESCC)臨床病理特征的關(guān)系。方法 選取2009年10月—2010年9月河南省林州市食管癌高發(fā)區(qū)，首次經(jīng)組織病理學(xué)確診的食管ESCC患者260例，血液標(biāo)本采用MassArray時(shí)間飛行質(zhì)譜生物芯片檢測(cè)PLA2G2A基因rs11677 C/T位點(diǎn)基因型；采用免疫組織化學(xué)染色方法(SP法)檢測(cè)癌及癌旁組織中PLA2G2A蛋白的表達(dá)情況。比較不同臨床特征食管ESCC患者PLA2G2A基因rs11677 C/T陽(yáng)性率及PLA2G2A蛋白表達(dá)陽(yáng)性率，不同rs11677 C/T基因型食管ESCC患者PLA2G2A蛋白表達(dá)陽(yáng)性率。結(jié)果 260例食管ESCC患者中PLA2G2A基因rs11677 C/T多態(tài)位點(diǎn)CC型 66.2%(172/260)、CT+TT型 33.8%(88/260)。攜帶CC基因型者PLA2G2A蛋白表達(dá)陽(yáng)性率(56.4%，97/172)與攜帶CT+TT基因型者(55.7%，49/88)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。不同年齡、組織學(xué)分化、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)深度食管ESCC患者PLA2G2A基因rs11677 C/T基因型頻率比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。不同年齡、組織學(xué)分化、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移食管ESCC患者PLA2G2A蛋白表達(dá)陽(yáng)性率比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；不同浸潤(rùn)深度食管ESCC患者PLA2G2A蛋白表達(dá)陽(yáng)性率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。不同rs11677C/T基因型食管ESCC患者PLA2G2A蛋白表達(dá)陽(yáng)性率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.149，P=0.928)。結(jié)論 未發(fā)現(xiàn)PLA2G2A基因 rs11677 C/T多態(tài)位點(diǎn)基因突變與其蛋白表達(dá)的相關(guān)性，PLA2G2A蛋白表達(dá)與食管ESCC浸潤(rùn)深度相關(guān)。

食管腫瘤；癌,鱗狀細(xì)胞；Ⅱ型磷脂酶A2；多態(tài)性,單核苷酸

翟艷春，魏文強(qiáng)，何燕，等.磷脂酶A2-ⅡA亞型基因rs11677 C/T多態(tài)位點(diǎn)基因突變及蛋白表達(dá)與食管鱗狀細(xì)胞癌臨床病理特征的關(guān)聯(lián)性研究[J].中國(guó)全科醫(yī)學(xué)，2015，18(12)：1396-1400.[www.chinagp.net]

Zhai YC,Wei WQ,He Y,et al.Correlation among PLA2G2A rs11677 C/T polymorphism,protein expression and clinicopathologic features of esophageal squamous cell carcinoma[J].Chinese General Practice，2015，18(12)：1396-1400.

食管癌是一種常見(jiàn)的人類消化道惡性腫瘤，其5年生存率為10%～15%[1]。食管癌的病理類型包括鱗狀細(xì)胞癌(ESCC)和腺癌2種類型，我國(guó)食管癌90%是ESCC[2]。磷脂酶A2-ⅡA亞型(PLA2G2A)被報(bào)道在人類多種腫瘤中有表達(dá)，包括結(jié)腸癌、胰腺癌及前列腺癌[3]，并且在炎性反應(yīng)、血管生成及腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用[4]。本研究采用MassArray時(shí)間飛行質(zhì)譜生物芯片檢測(cè)PLA2G2A基因rs11677 C/T基因型在ESCC患者中的分布情況，結(jié)合免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)PLA2G2A蛋白表達(dá)情況，探討PLA2G2A基因rs11677 C/T多態(tài)位點(diǎn)基因突變及蛋白表達(dá)的臨床意義，為食管ESCC的診治提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 選取2009年10月—2010年9月河南省林州市食管癌高發(fā)區(qū)，首次經(jīng)組織病理學(xué)確診的食管ESCC患者260例，收集手術(shù)切除癌及癌旁組織(患者術(shù)前均未接受化療、放療或其他任何相關(guān)的腫瘤治療)標(biāo)本以及靜脈血2 ml。其中，血標(biāo)本進(jìn)行PLA2G2A基因rs11677 C/T多態(tài)性檢測(cè)，癌組織及癌旁組織進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)。260例食管ESCC患者中，男182例，女78例；年齡33～79歲，中位年齡60歲；分化程度：高分化45例、中分化124例、低分化91例；腫瘤分期：Ⅰ期37例、Ⅱ期127例、Ⅲ期89例、Ⅳ期7例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移118例、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移142例。

1.2 試劑 PLA2G2A兔抗人多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司，超敏SP免疫組織化學(xué)試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。引物由北京賽百盛生物工程公司設(shè)計(jì)，Enzyme、Buffer、dNTP購(gòu)自Mannheim公司，樹(shù)脂購(gòu)自Sequenom公司。

同行評(píng)議：

本研究探討了磷脂酶A2-ⅡA亞型(PLA2G2A)基因rs11677 C/T多態(tài)位點(diǎn)基因突變及其蛋白表達(dá)與食管鱗狀細(xì)胞癌(ESCC)的關(guān)聯(lián)性，為闡明ESCC的遺傳易患性提供了新的理論依據(jù)。本研究設(shè)計(jì)嚴(yán)謹(jǐn)，資料齊全，有一定創(chuàng)新性，有指導(dǎo)和參考價(jià)值。

1.3 方法

1.3.1 免疫組織化學(xué)染色SP法 按照北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司SP免疫組織化學(xué)試劑盒操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。常規(guī)切片，二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，3%過(guò)氧化氫10 min阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性，0.01 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液(pH=6.0)高壓抗原修復(fù)10 min，冷卻至室溫。牛血清清蛋白封閉50 min，加入PLA2G2A兔抗人多克隆抗體(一抗)(ab23705,1∶200；Abcam,Cambridge,MA,USA)，濕盒孵育4 ℃過(guò)夜。次日室溫復(fù)溫，加入二抗孵育60 min。二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，蘇木素復(fù)染，鹽酸-乙醇分色，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。

磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作為陰性對(duì)照，陽(yáng)性對(duì)照切片由北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司提供，PLA2G2A蛋白反應(yīng)為棕黃色顆粒定位于細(xì)胞質(zhì)。

1.3.2 MassArray時(shí)間飛行質(zhì)譜生物芯片測(cè)定單核苷酸多態(tài)性(SNP) 利用MassArray Assay Design(Sequenom) 軟件設(shè)計(jì)引物，上游引物為5′-ACGTTGGATGACCTCAACTCCGTGCTTAAC-3′，下游引物為5′-ACGTTGGATGGGCAATGCATACACACACAC-3′。引物合成后，所有DNA樣本稀釋到10～50 ng/μl，取1 μl將其與1.8 μl水、0.5 μl PCR、0.4 μl 氯化鎂(MgCl2)、0.1 μl dNTP、1 μl PCR 引物混合在一起。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 2 min；95 ℃ 30 s；56 ℃ 30 s；72 ℃ 1 min；共45個(gè)循環(huán)；最終72 ℃ 5 min，降溫至25 ℃。對(duì)上步的PCR產(chǎn)物進(jìn)行SAP酶消化，該反應(yīng)在37 ℃進(jìn)行40 min，然后85 ℃ 5 min使酶失活；降溫至25 ℃。該步完成之后，將消化后的產(chǎn)物進(jìn)行單堿基延伸反應(yīng)，條件如下：94 ℃ 30 s；94 ℃ 5 s；52 ℃ 5 s；80 ℃ 5 s；5個(gè)內(nèi)部循環(huán)；72 ℃ 3 min。共40個(gè)外部循環(huán)；降溫至25 ℃。結(jié)束上述反應(yīng)后，將產(chǎn)物進(jìn)行樹(shù)脂純化，將所有產(chǎn)物中的鹽離子清除。將最終的分型產(chǎn)物點(diǎn)樣到芯片上，進(jìn)行MALDI-TOF質(zhì)譜檢測(cè)。最后結(jié)果由MassArray RT軟件系統(tǒng)實(shí)時(shí)讀取，并通過(guò)軟件系統(tǒng)完成基因分型分析。

1.4 結(jié)果判定 免疫組織化學(xué)結(jié)果由2名病理學(xué)專家獨(dú)立進(jìn)行判讀，結(jié)果采用半定量方法。判定標(biāo)準(zhǔn)如下：+陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)<5%;++陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)5%～30%；+++陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)>30%。統(tǒng)計(jì)分析時(shí)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)≥5%判定為陽(yáng)性，<5%判定為陰性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 16.0軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 PLA2G2A基因rs11677 C/T基因型與蛋白表達(dá)的相關(guān)性 260例食管ESCC患者中PLA2G2A基因rs11677 C/T多態(tài)位點(diǎn)CC型66.2%(172/260)、CT+TT型33.8%(88/260)。攜帶CC基因型者PLA2G2A蛋白表達(dá)陽(yáng)性率(56.4%，97/172)與攜帶CT+TT基因型者(55.7%，49/88)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.12，P=0.913)。癌組織免疫組織化學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，PLA2G2A蛋白表達(dá)陽(yáng)性呈棕黃色顆粒狀，主要分布于細(xì)胞質(zhì)中，而正常組織中無(wú)陽(yáng)性表達(dá)(見(jiàn)圖1)。

注：A為食管ESCC癌組織，B為正常組織

圖1 食管ESCC癌組織與正常組織PLA2G2A免疫組織化學(xué)染色 (×400)

Figure 1 PLA2G2A immunohistochemical staining in ESCC tissues and normal tissues

2.2 不同臨床特征食管ESCC患者PLA2G2A基因rs11677 C/T基因型頻率比較 不同年齡、組織學(xué)分化、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)深度食管ESCC患者PLA2G2A基因rs11677 C/T基因型頻率比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見(jiàn)表1)。

表1 不同臨床特征食管ESCC患者PLA2G2A基因rs11677 C/T基因型頻率比較〔n(%)〕

Table 1 Comparison of the positive rates of PLA2G2A rs11677 C/T among ESCC patients groups with different clinical features

臨床特征例數(shù)基因型CC TT+CTχ2值P值年齡(歲)0.1200.729 ≤503019(63.3)11(36.7) >50230153(66.5)77(33.5)組織學(xué)分化0.2560.880 高4529(64.4)16(35.6) 中12481(65.3)43(34.7) 低9162(68.1)29(31.9)TNM分期1.0960.778 Ⅰ3725(67.6)12(32.4) Ⅱ12781(63.8)46(36.2) Ⅲ8962(69.7)27(30.3) Ⅳ74(57.1)3(42.9)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移0.2600.610 無(wú)14292(64.8)50(35.2) 有11880(67.8)38(32.2)浸潤(rùn)深度2.3640.500 T14430(68.2)14(31.8) T23722(59.5)15(40.5) T3176117(66.5)59(33.5) T433(100.0)0

注：PLA2G2A=磷脂酶A2-ⅡA亞型

2.3 不同臨床特征食管ESCC患者PLA2G2A蛋白表達(dá)陽(yáng)性率比較 不同年齡、組織學(xué)分化、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移食管ESCC患者PLA2G2A蛋白表達(dá)陽(yáng)性率比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；不同浸潤(rùn)深度食管ESCC患者PLA2G2A蛋白表達(dá)陽(yáng)性率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見(jiàn)表2)。

2.4 不同rs11677 C/T基因型食管ESCC患者PLA2G2A蛋白表達(dá)陽(yáng)性率比較 不同rs11677 C/T基因型食管ESCC患者PLA2G2A蛋白表達(dá)陽(yáng)性率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.149，P=0.928，見(jiàn)表3)。

3 討論

在中國(guó)，食管ESCC是食管癌主要病理類型，大約占所有食管癌的90%[5]，是侵襲性極強(qiáng)并且預(yù)后很差的腫瘤之一。在中國(guó)北部，尤其是靠近太行山一帶，食管ESCC在癌癥致死疾病中占首位[6]。食管癌的發(fā)病因素很多，目前公認(rèn)吸煙、飲酒、對(duì)食管造成損傷的各類慢性刺激及環(huán)境因素是中國(guó)食管ESCC高發(fā)的主要原因。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，喜吃燙食、超量飲酒、低收入、低體質(zhì)指數(shù)、既往食管病變、不按時(shí)就餐、喜食辣食及腫瘤家族史等均是增加食管癌患病風(fēng)險(xiǎn)的因素[7-8]。近年來(lái)，與食管ESCC發(fā)生、演化相關(guān)的基因水平的研究越來(lái)越受到人們的重視。已有研究表明，PLA2G2A在食管ESCC癌組織和食管正常組織中的表達(dá)存在差異[9]。

表2 不同臨床特征食管ESCC患者PLA2G2A蛋白表達(dá)陽(yáng)性率比較〔n(%)〕

Table 2 Comparison of the positive rates of PLA2G2A protein expression among ESCC patients groups with different clinical features

臨床特征例數(shù)PLA2G2A蛋白陽(yáng)性 陰性χ2值P值年齡(歲)1.2400.266 ≤503016(53.3)14(46.7) >5023098(42.6)132(57.4)組織學(xué)分化0.8830.643 高4517(37.8)28(62.2) 中12455(44.4)69(55.6) 低9142(46.2)49(53.8)TNM分期6.7170.081 Ⅰ3723(62.2)14(37.8) Ⅱ12752(40.9)75(59.1) Ⅲ8935(39.3)54(60.7) Ⅳ74(57.1)3(42.9)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移1.4150.234 無(wú)14267(47.2)75(52.8) 有11847(39.8)71(60.2)浸潤(rùn)深度10.3600.016 T14428(63.6)16(36.4) T23711(29.7)26(70.3) T317674(42.0)102(58.0) T431(33.3)2(66.7)

表3 不同rs11677 C/T基因型食管ESCC患者PLA2G2A蛋白表達(dá)陽(yáng)性率比較〔n(%)〕

Table 3 Comparison of the positive rates of PLA2G2A protein expression among ESCC patients groups with different rs11677 C/T genotypes

rs11677C/T基因型例數(shù)PLA2G2A蛋白陽(yáng)性 陰性CC17297(56.4)75(43.6)CT7340(54.8)33(45.2)TT159(60.0)6(40.0)

磷脂酶A2(PLA2) 是一類能催化水解磷脂Sn-2 位脂肪酸磷酸甘油酯?；ユI形成游離脂肪酸及溶血磷脂的酶族。PLA2主要有4種類型:分泌型、胞質(zhì)型、非鈣離子依賴型及脂蛋白相關(guān)型；其中分泌型磷脂酶A2(sPLA2)包括約10種亞型，ⅡA亞型(sPLA2-ⅡA)主要來(lái)源于非胰腺組織，如白細(xì)胞、血小板和胎盤等[10]。人類的sPLA2-ⅡA首先從類風(fēng)濕患者的滑膜液中發(fā)現(xiàn)并分離獲得[11]。在其免疫防御功能得到肯定的同時(shí)，作為花生四烯酸代謝通路上游的第一個(gè)限速酶，sPLA2-ⅡA與消化系統(tǒng)腫瘤癌前病變、細(xì)胞增殖、血管侵襲和腫瘤轉(zhuǎn)移等關(guān)系的研究取得了一定的進(jìn)展[12-13]。1997年，Cormier研究小組首次發(fā)現(xiàn)PLA2G2A具有對(duì)抗小鼠腸管腫瘤發(fā)生和增殖的功能[13]。然而研究結(jié)果顯示，PLA2G2A基因并不像傳統(tǒng)的抑癌基因那樣發(fā)揮作用，在人類前列腺癌中PLA2G2A發(fā)揮促癌基因的作用[14]，在晚期胃癌患者中PLA2G2A的表達(dá)與其存活存在正相關(guān)[15]，這就表明在不同類型的消化系統(tǒng)腫瘤中或者在不同的理化條件下，PLA2G2A對(duì)腫瘤所發(fā)揮的作用存在著一定的差異，有時(shí)甚至相反[16]。

本課題前期的研究表明，PLA2G2A基因rs11677 C/T多態(tài)位點(diǎn)基因突變與食管ESCC風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)，與攜帶與CC基因型者比較，攜帶CT+TT基因型者食管ESCC發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)降低[17]。本研究結(jié)果顯示，攜帶不同基因型者PLA2G2A蛋白表達(dá)陽(yáng)性率無(wú)差異。另外，PLA2G2A蛋白表達(dá)與食管ESCC臨床特征關(guān)系中，除不同浸潤(rùn)深度間存在差異外，其他臨床特征間均無(wú)差異。不同臨床特征食管ESCC患者PLA2G2A基因rs11677 C/T基因型間均無(wú)差異。

綜上所述，本研究未發(fā)現(xiàn)PLA2G2A基因rs11677 C/T多態(tài)位點(diǎn)基因突變與其蛋白表達(dá)的相關(guān)性，但PLA2G2A蛋白表達(dá)與食管癌浸潤(rùn)深度相關(guān)。研究結(jié)果仍需更多大樣本、多中心研究進(jìn)一步驗(yàn)證。

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(本文編輯：陳素芳)

Correlation Among PLA2G2A rs11677 C/T Polymorphism,Protein Expression and Clinicopathologic Features of Esophageal Squamous Cell Carcinoma

ZHAIYan-chun,WEIWen-qiang,HEYan,etal.

DepartmentofEpidemiologyandHealthStatistics,SchoolofPublicHealth,CapitalMedicalUniversity,Beijing100069,China

Objective To investigate the correlation among the phospholipase A2 group ⅡA(PLA2G2A) gene single nucleotide polymorphism(SNP)(rs11677 C/T),the protein expression and the clinicopathologic characteristics of esophageal squamous cell carcinoma(ESCC).Methods A total of 260 ESCC patients from Linzhou city,Henan province,an area of high incidence of esophageal cancer,were selected as study subjects from October 2009 to September 2010,ESCC was confirmed by histopathologic examination for the first time.Blood specimens were used to detect the PLA2G2A rs11677 C/T SNP genotype by time-of-flight mass spectrometry MassArray system,and the carcinoma and pericarcinous tissues were used to examine the expression of PLA2G2A protein by immunohistochemical SP method.The positive rates of PLA2G2A rs11677 C/T and PLA2G2A protein expression were compared among different groups of ESCC patients with different clinical features,the positive rates of PLA2G2A protein expression were compared among different groups of ESCC patients with different rs11677 C/T genotypes.Results Among 260 ESCC patients,the distribution of CC,TT+CT genotype of PLA2G2A rs11677 C/T SNP was 66.2%(172/260) and 33.8%(88/260),respectively.There was no significant difference in the positive rate of PLA2G2A protein expression between cases with CC genotype(56.4%,97/172) and cases with CT+TT genotype(55.7%,49/88)(P>0.05).The genotypes rate of PLA2G2A rs11677 C/T did not vary by age,histological differentiation,TNM stage,lymphatic metastasis and depth of invasion of ESCC(P>0.05).The positive rate of PLA2G2A protein expression did not vary by age,histological differentiation,TNM stage and lymphatic metastasis(P>0.05).There was no significant difference in the positive rate of PLA2G2A protein expression among ESCC patient groups with different rs11677 C/T genotypes(χ2=0.149，P=0.928).Conclusion The correlation between PLA2G2A rs11677 C/T polymorphism and the PLA2G2A protein expression is not significant,while PLA2G2A protein expression is closely related to the depth of invasion of ESCC.

Esophageal neoplasms；Carcinoma,squamous cell；Group Ⅱ phospholipases A2；Polymorphism,single nucleotide

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81473056,30901239)；北京市自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(7132023)；北京市屬高等學(xué)校高層次人才引進(jìn)與培養(yǎng)計(jì)劃項(xiàng)目(CIT&TCD201404183)

100069北京市，首都醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院流行病與衛(wèi)生統(tǒng)計(jì)學(xué)系，北京市臨床流行病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(翟艷春，何燕，王嵬，劉芬)；中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院流行病室(魏文強(qiáng)，李新慶)

王嵬，100069北京市，首都醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院流行病與衛(wèi)生統(tǒng)計(jì)學(xué)系，北京市臨床流行病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；

E-mail:wei6014@yahoo.com

R 735.1

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2015.12.010

2014-12-16；

2015-02-12)

劉芬，100069北京市，首都醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院流行病與衛(wèi)生統(tǒng)計(jì)學(xué)系，北京市臨床流行病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；

E-mail：liufen05@ccmu.edu.cn