郭蕊
(河北省昌黎縣動物疫病預防控制中心,河北昌黎066600)
副豬嗜血桿菌病細菌分離及PCR檢測方法的建立與應用
郭蕊
(河北省昌黎縣動物疫病預防控制中心,河北昌黎066600)
本病又稱為革拉斯病(Glsser Disease),是由副豬嗜血桿菌引起的豬的又一種新的細菌性傳染病,以多發(fā)性漿膜炎和關節(jié)炎為特征,主要表現(xiàn)為發(fā)熱、咳嗽、呼吸困難、消瘦、跛行、共濟失調(diào)和被毛粗亂、胸膜炎、肺炎、心包炎、腹膜炎、關節(jié)炎和腦膜炎等。也可引起母豬流產(chǎn)、公豬慢性跛行。該病目前呈世界性分布,在我國的發(fā)病也呈上升的趨勢,造成的經(jīng)濟損失日益嚴重,但豬副嗜血桿菌病與豬鏈球菌病、豬傳染性胸膜肺炎(嗜血桿菌)等可引起呼吸系統(tǒng)的疾病不易區(qū)分,且混感率較高,為該病的診斷帶來一定的困難。
副豬嗜血桿菌為革蘭氏染色陰性,有莢膜,具有多種不同的形態(tài)。該菌生長時嚴格需要煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD或V因子)。流行菌株在TSA平板的菌落呈針尖大小、灰白色、透明。本菌至少有15種血清型,另有大量分離株血清型不可定型,目前在我國的主要流行菌株是4、5、14和15型等,且不同地區(qū)不同分離菌株致病力差異較大。14~120日齡的豬均易感,但通常見于5~8周齡的豬發(fā)病。發(fā)病率 10%~15%,嚴重時死亡率可達50%~60%。
因此為了保證診斷的準確性,在最短的時間內(nèi)對豬群進行處理,繼而降低經(jīng)濟損失,我們采取細菌分離與PCR結合的方法來對其進行研究。
1.1 實驗動物
某發(fā)病豬場的病豬及送檢病、死豬。
1.2 臨床癥狀
發(fā)熱、食欲不振、厭食、反應遲鈍、呼吸困難、咳嗽、疼痛(尖叫)、關節(jié)腫脹、跛行、顫抖、共濟失調(diào)、可視黏膜發(fā)紺、側臥,消瘦和被毛凌亂,隨之可能死亡。急性感染后可能留下后遺癥,即母豬流產(chǎn)、公豬慢性跛行。肉眼病變主要是全身性漿液性、化膿性、纖維素性炎癥,包括心、肺、肝等內(nèi)臟器官、腹膜、心包膜、胸膜、及其關節(jié)表面(圖3~6)等,尤其是腕關節(jié)和跗關節(jié),出現(xiàn)漿液性和化膿性纖維蛋白滲出物。診斷本病時應注意與鏈球菌、胸膜肺炎放線桿菌、支原體多發(fā)性漿膜炎和關節(jié)炎等相區(qū)別,本病確診有賴于細菌學以及分子生物學檢查。
2.1 主要試劑與儀器
牛血清、TSA、輔酶I(煙酞胺腺嘌呤二核苷酸NAD)、培養(yǎng)基、培養(yǎng)箱、電子秤、搖床、高速冷凍離心機等。
TSA固體培養(yǎng)基:準確稱取胰蛋白大豆瓊脂(TSA)40克,加入940毫升蒸餾水,充分搖勻后加熱至充分溶解,高壓蒸汽滅菌15分鐘,加入50毫升過濾除菌的牛血清、10毫升過濾除菌的0.01%NAD,充分搖勻后倒平皿。
2.2 實驗方法
無菌采集胸膜、胸腹腔積水、心包積液、關節(jié)液等病料,分別接種于自制的TSA固體培養(yǎng)基平板,置于5%~10%CO2中培養(yǎng),37℃恒溫箱培養(yǎng)24~48小時后,檢查其在培養(yǎng)基上的生長表現(xiàn)、菌落特征等培養(yǎng)特性,結果顯示菌株在TSA平板的菌落呈針尖大小、灰白色、透明(圖1),然后純培養(yǎng)與鑒定。
對培育菌株進行革蘭氏染色以及培養(yǎng)后接種于脈酶、氧化酶、接觸酶、硝酸鹽還原、葡萄糖、蔗糖、果糖、半乳糖、核糖和麥芽糖等微型生化鑒定管等進行生化指標的測定,37℃培養(yǎng),24~48小時后觀察現(xiàn)象。革蘭氏染色陰性,多種不同形態(tài)的小桿菌(圖2)。
將培育菌株劃線接種于鮮血瓊脂平皿,用紙片法將20種藥物進行藥敏試驗,37℃胚培養(yǎng)24~36小時,觀察結果顯示:本菌對紅霉素、氨基甙類、壯觀霉素和林可霉素有抗藥性。
3.1 主要試劑與儀器
電泳緩沖液TAE、PBS、DNA marker、EB、各種型號移液器及滴頭、氯仿以及其他分析純等。
PCR儀、電泳儀、電子天平、超凈工作臺、水浴鍋、高速低溫離心機、高壓滅菌鍋等。
3.2 實驗步驟
將被檢菌液12000轉/分鐘離心5分鐘,棄上清液,用無菌水懸浮,渦旋后于沸水中水浴10分鐘后,再放置-20℃凍結,然后12000轉/分鐘離心5分鐘,取上清液作為DNA模板。根據(jù)副豬嗜血桿菌序列設計引物,由上海生某公司合成。
采用50微升反應體系:上下游引物1.5微升,2.5毫摩爾 dNTPs 4.0微升,Exbuffer 5.0微升,ExTaq酶0.5微升,模板DNA 8.0微升、滅菌雙蒸水30微升。反應循環(huán)參數(shù):94℃預變性5分鐘,94℃變性30秒,58℃退火30秒,72℃延伸40秒,共30循環(huán);最后72℃延伸10分鐘,4℃保存。反應結束后用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定擴增片段的大小。
1%瓊脂糖凝膠的配制:稱取3克瓊脂糖,加入300毫升lxTAE溶液,微波爐加熱至完全溶解。稍微冷卻,加入溴化乙錠(EB至終濃度為5微克/毫升),趁熱倒入制膠槽,高度約0.5厘米,自然凝固后,小心拔出梳子,將平板放入電泳槽中,加樣孔一端朝向陰極。電泳槽內(nèi)倒入足夠的lxTAE溶液,使之正好沒過制好的瓊脂面。
加樣:PCR產(chǎn)物15微升與3微升6x加樣緩沖液混合均勻,用微量進樣器吸取混合液,Tip頭伸入液面以下,對準加樣孔,緩慢推出使樣品垂直落入加樣孔內(nèi)。電泳:蓋上電泳槽電泳40~50分鐘,然后在凝膠成像儀中觀察結果。
3.3 實驗結果
PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳,獲得約822堿基對的特異性片段,與預期結果相符。經(jīng)序列測定,其序列與目的基因序列一致。
M:DNA Marker;1:目的基因的擴增產(chǎn)物
4.1 近年來,該菌在我國豬群普遍存在(感染率呈明顯的上升趨勢),且臨床癥狀又與鏈球菌、胸膜肺炎放線桿菌等疾病極其相似不易區(qū)分,因此必須要通過細菌分離及PCR檢測的方法進行確診,避免因誤診造成不必要的損失。
4.2 副豬嗜血桿菌抗藥性日漸增強也已成為不可忽視的問題,疾病發(fā)生的早期,治療或保健性預防用藥效果明顯,但一定要選擇敏感的抗菌素藥物。大多數(shù)副豬嗜血桿菌對頭孢類抗生素、氟苯尼考、替米考星及喹諾酮類高度敏感,但對一些氨基甙類、壯觀霉素和林可霉素有抵抗力,所以說,對豬場副豬嗜血桿菌進行定期的敏感性藥物監(jiān)測,有利于減少經(jīng)濟損失,保證豬群健康。
4.3 副豬嗜血桿菌疫苗是預防該病的最為有效的方法之一,但不同血清型菌株之間的交叉保護率相對較低,因此,疫苗的使用具有一定的區(qū)域性和局限性,一定要有血清型的針對性才能取得良好的防疫效果。從當?shù)胤蛛x的菌株制備滅活苗,可有效控制副豬嗜血桿菌病的發(fā)生。同時做好豬瘟、偽狂犬病、藍耳病、口蹄疫等預防免疫工作,有利于減少本病的發(fā)生。
4.4 同時加強對豬群飼養(yǎng)管理。保證勤打掃,常通風,實行嚴格的定期消毒制度,特別是冬季一定要做好保溫與通風的協(xié)調(diào),盡量減少應激。減少或消除其他呼吸道病原,如提前斷奶,減少豬群流動,杜絕豬生產(chǎn)各階段的混養(yǎng)狀況等,并在疫病多發(fā)季節(jié),在飼料中添加增強體質(zhì)的藥物如:黃芪多糖、電解多維、VC、VE以增強機體抵抗力,減少應激,都可有效增強豬體自身免疫力減少本病的發(fā)生。
圖1 副豬嗜血桿菌菌落形態(tài)
圖2 副豬嗜血桿菌形態(tài)
圖3 心包積液,心臟周圍出現(xiàn)纖維素性炎癥
圖4 肺臟包膜
圖5 肺臟黏連
圖6 腹腔出現(xiàn)化濃性炎癥