HPLC 法測(cè)定阿普斯特對(duì)映異構(gòu)體

蒙發(fā)明

（中山奕安泰醫(yī)藥科技有限公司 廣東中山 528437）

阿普斯特是一種磷酸二酯酶4(PDE4)抑制劑，阻止類風(fēng)濕滑膜細(xì)胞分泌腫瘤壞死因子α（TNF-α）而產(chǎn)生抗炎活性，主要用于治療活動(dòng)性銀屑病關(guān)節(jié)炎[1]。阿普斯特有效成分為S 構(gòu)型，其對(duì)應(yīng)異構(gòu)體R 構(gòu)型對(duì)其效果有較大影響；為了控制阿普斯特產(chǎn)品質(zhì)量，本文對(duì)阿普斯特對(duì)映異構(gòu)體進(jìn)行了方法學(xué)研究。

一、儀器與試藥

1.儀器

島津LC-15C 高效液相色譜儀、梅特勒XS204 電子天平。

2.試藥及試劑

阿普斯特對(duì)照品（自制，批號(hào)為20150101，含量99.3%)，阿普斯特對(duì)映異構(gòu)體對(duì)照品（自制，20150103,含量100%)；阿普斯特產(chǎn)品（自制，批號(hào)為150201， 150202， 150203）；正己烷（色譜純）；乙醇（色譜純）；甲醇（色譜純）。

二、方法與結(jié)果

1.色譜條件

色譜柱為大賽璐Chiralpak AS-H 手性柱；以正己烷-乙醇（20:80)為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)230nm；室溫：30℃；流速1.0ml/min；進(jìn)樣量：20ul。理論板數(shù)按照阿普斯特計(jì)不得低于1500，阿普斯特與其對(duì)應(yīng)異構(gòu)體的分離度應(yīng)符合要求。

2.對(duì)應(yīng)異構(gòu)體的測(cè)定

取阿普斯特樣品適量，用甲醇制成約0.5mg/ml 溶液，作為供試品溶液；精密取供試品溶液1ml,用甲醇稀釋至100ml,作為對(duì)照溶液；分別取阿普斯特對(duì)照品及阿普斯特對(duì)應(yīng)異構(gòu)體對(duì)照品適量，置于同一容量瓶中，用甲醇溶解并制成含阿普斯特0.5mg/ml 及其對(duì)應(yīng)異構(gòu)體為25ug/ml 溶液，作為系統(tǒng)適應(yīng)性溶液。分別取供試品溶液、對(duì)照溶液、系統(tǒng)適應(yīng)性溶液注入液相色譜儀，記錄色譜圖，供試品溶液色譜圖中如有與系統(tǒng)適應(yīng)性色譜圖中阿普斯特對(duì)應(yīng)異構(gòu)體保留時(shí)間一致的色譜峰，其峰面積不得大于對(duì)照溶液主峰的峰面積的0.5 倍（0.5%）。

3.對(duì)映異構(gòu)體方法學(xué)考察

（1）空白試驗(yàn)及系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)：取2.2 項(xiàng)下系統(tǒng)適應(yīng)性溶液及甲醇溶劑，按照2.1 色譜條件檢測(cè)，記錄色譜圖（見下圖），表明空白溶劑甲醇不干擾阿普斯特及其對(duì)應(yīng)異構(gòu)體的檢測(cè)，系統(tǒng)適應(yīng)性色譜圖中，理論板數(shù)以阿普斯特計(jì)符合規(guī)定，阿普斯特與其對(duì)應(yīng)異構(gòu)體分離度符合要求。

（2）準(zhǔn)確度：稱取4 份阿普斯特對(duì)照品約25mg，置于50ml 的容量瓶，其中一份不加阿普斯特對(duì)應(yīng)異構(gòu)體溶液，其余3 份分別加入阿普斯特對(duì)應(yīng)異構(gòu)體溶液適量，制成相當(dāng)于阿普斯特對(duì)應(yīng)異構(gòu)體0.1%、0.5%、1.0%濃度的溶液，取以上4 份溶液，按照2.1 色譜條件測(cè)定，每個(gè)溶度獨(dú)立測(cè)定三次。計(jì)算加入阿普斯特對(duì)映異構(gòu)體的回收率。結(jié)果顯示平均回收率為98.7 %, RSD為1.52%，符合實(shí)驗(yàn)要求

（3）精密度：分別配置系統(tǒng)適應(yīng)性溶液6份，按照2.1色譜條件檢測(cè)，分別考察阿普斯特及其對(duì)映異構(gòu)體的保留時(shí)間及主峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（數(shù)據(jù)見下表）。結(jié)果顯示，阿普斯特主峰保留時(shí)間RSD%為0.08%，主峰面積RSD%為0.56%；阿普斯特對(duì)映異構(gòu)體保留時(shí)間RSD%為0.13%，峰面積RSD 為0.64%，本方法精密度符合要求。

（4）線性范圍：取阿普斯特對(duì)映異構(gòu)體對(duì)照品約25mg，精密稱定，置于50mL 容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)映異構(gòu)體貯備溶液（0.5mg/mL）；精密量取5mL 置于100mL 容量瓶（25ug/mL），加甲醇稀釋至刻度，搖勻．分別精密量取0.1,0.2,0.5,1,2,4mL，置于10mL 容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，依法測(cè)定。以濃度C 對(duì)阿普斯特對(duì)映異構(gòu)體主峰面積A 進(jìn)行線性回歸（見下圖），得回歸方程為：

Y=33.94X+0.4647，R=0.9999 結(jié)果表明，阿普斯特對(duì)映異構(gòu)體濃度在0.25 ～10ug/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

（5）溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)：取2.3.2 項(xiàng)下一份溶液，分別放置在室溫下0 小時(shí)、1 小時(shí)、2 小時(shí)、4 小時(shí)、8 小時(shí)。放置后，按照2.1 色譜條件依法測(cè)定，考察阿普斯特及阿普斯特對(duì)應(yīng)異構(gòu)體的峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。結(jié)果顯示阿普斯特峰面積的RSD 為1.11%，阿普斯特對(duì)映異構(gòu)體峰面積的RSD 為1.74%．結(jié)果表明，該方法檢測(cè)配置的溶液在8h 以內(nèi)穩(wěn)定。

（6）檢測(cè)限及定量限的確定：取2.3.2 項(xiàng)下一份溶液，用空白溶劑甲醇作為稀釋劑，逐步稀釋，并進(jìn)樣測(cè)定，以信噪比剛好大于10，作為阿普斯特對(duì)映異構(gòu)體的檢測(cè)限；以信噪比剛好大于3，作為阿普斯特對(duì)映異構(gòu)體的定量限；實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示定量限為0.15ug/mL；檢測(cè)限為0.04ug/mL。定量限為常規(guī)檢測(cè)量的0.03%，檢測(cè)限為常規(guī)檢測(cè)量的0.008%。

（7）耐用性：通過(guò)改變色譜柱生產(chǎn)廠家、5%比例改變流動(dòng)相組成、柱溫。分別進(jìn)行系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)，結(jié)果表明均不影響阿普斯特及其對(duì)應(yīng)異構(gòu)體的檢測(cè)。

（8）三批樣品測(cè)定：取阿普斯特3 批樣品，用甲醇制成0.5 mg/mL 溶液，依法測(cè)定。結(jié)果3 批產(chǎn)品的對(duì)映異構(gòu)體含量分別為0.11%、0.13%、0.07%。

三、討論

本實(shí)驗(yàn)對(duì)HPLC 法測(cè)定阿普斯特的對(duì)映異構(gòu)體進(jìn)行了方法學(xué)研究，用采用大賽璐Chiralpak AS-H 手性色譜柱；以正己烷-乙醇（20:80）為流動(dòng)相：檢測(cè)波長(zhǎng)230nm：流速1.0ml/min，阿普斯特對(duì)映異構(gòu)體和阿普斯特的相對(duì)保留時(shí)間分別約為0.71 和1.00；其分離度符合要求，方法學(xué)各項(xiàng)考察指標(biāo)均符合方法學(xué)考察要求，故該液相色譜法可用于阿普斯特的對(duì)映異構(gòu)體的檢測(cè)。

[1] 陳建超; 孫鐵民; 阿普斯特.中國(guó)藥物化學(xué)雜志.2014年第24 卷第5 期 418-418 頁(yè)