次級淋巴組織趨化因子在潰瘍性結(jié)腸炎中的表達(dá)及其意義*

次級淋巴組織趨化因子在潰瘍性結(jié)腸炎中的表達(dá)及其意義*

高東鋒#周國雄曹維陳海琴張海峰&

南通大學(xué)附屬醫(yī)院消化內(nèi)科(226001)

*基金項(xiàng)目：南通市應(yīng)用研究計(jì)劃項(xiàng)目(BK2012074)

#現(xiàn)工作單位：陜西省咸陽市中心醫(yī)院消化內(nèi)科 (712000)，Email: 2293885415@qq.com

背景：次級淋巴組織趨化因子(SLC)參與淋巴歸巢和抗腫瘤免疫應(yīng)答，對腸道淋巴細(xì)胞有趨化作用。多項(xiàng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明SLC參與了潰瘍性結(jié)腸炎(UC)的發(fā)生、發(fā)展。目的：探討SLC在UC患者中的表達(dá)及其意義。方法：納入2010年12月-2012年12月南通大學(xué)附屬醫(yī)院40例活動(dòng)期UC患者，以20名健康志愿者作為正常對照，采用免疫組化法檢測結(jié)腸組織SLC表達(dá)，并分析其與UC病情程度的關(guān)系。結(jié)果：UC組SLC均陽性表達(dá)，正常對照組呈陰性或弱陽性表達(dá)，UC組SLC表達(dá)顯著高于正常對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(4.16±0.78對0.52±0.11，P<0.05)。UC病變程度越重，SLC表達(dá)陽性率越高。結(jié)論：SLC參與了UC的發(fā)生和發(fā)展，其可能在UC局部結(jié)腸組織破壞和病理變化中起重要作用。

關(guān)鍵詞結(jié)腸炎，潰瘍性；次級淋巴組織趨化因子；免疫組織化學(xué)

多項(xiàng)研究結(jié)果證實(shí)次級淋巴組織趨化因子(secondary lymphoid tissue chemokine, SLC)及其受體CCR7在潰瘍性結(jié)腸炎(UC)中表達(dá)升高，參與了UC的發(fā)病，但具體機(jī)制尚不明確。SLC屬于CC類趨化因子，是第一個(gè)被證實(shí)參與體內(nèi)淋巴細(xì)胞歸巢的趨化因子。CCR7是SLC的受體，屬于G蛋白偶聯(lián)的7次跨膜受體超家族。SLC需與CCR7結(jié)合方能發(fā)揮其多數(shù)生物學(xué)作用，且作用的強(qiáng)弱與CCR7表達(dá)水平密切相關(guān)。SLC可趨化T細(xì)胞、B細(xì)胞、活化的自然殺傷細(xì)胞(natural killer cell, NK細(xì)胞)以及樹突細(xì)胞(dendritic cell, DC)至外周淋巴組織或器官，在UC的發(fā)生和進(jìn)展中起重要作用。多項(xiàng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)[1-5]表明SLC參與了UC的發(fā)生、發(fā)展。本研究通過免疫組化法檢測SLC在UC患者中的表達(dá)情況并分析其與病情程度的關(guān)系，旨在了解SLC在UC發(fā)病中的作用。

對象與方法

一、研究對象

收集2010年12月-2012年12月南通大學(xué)附屬醫(yī)院經(jīng)內(nèi)鏡和病理檢查證實(shí)為UC的門診和住院患者40例，診斷符合2000年成都全國炎癥性腸病學(xué)術(shù)會議研討會制定的UC診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]。其中男21例，女19例，年齡20~69歲(中位年齡46歲)；所有患者均為疾病活動(dòng)期，按Truelove Witts標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行病情程度分級：輕度12例，中度18例，重度10例；病變累及部位：直腸炎8例，直乙狀結(jié)腸炎12例，左半結(jié)腸炎18例，全結(jié)腸炎2例。取同期性別、年齡相匹配的20名健康志愿者作為對照，其中男10名，女10名，年齡25~65歲(中位年齡40歲)。本研究方案獲得南通大學(xué)附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，獲取標(biāo)本時(shí)取得患者知情同意。

二、標(biāo)本采集

所有研究對象常規(guī)作腸道準(zhǔn)備，然后行結(jié)腸鏡檢查，UC患者在病變最明顯處取組織2塊，健康志愿者取正常腸黏膜2塊。所得標(biāo)本立即置于4%甲醛溶液中固定。制備組織切片，部分切片行HE染色，光學(xué)顯微鏡下評價(jià)炎癥、潰瘍等組織學(xué)改變；另一部分用于檢測SLC的表達(dá)。

三、免疫組化

采用LabVision公司的2D全自動(dòng)免疫組化染色儀，行EnVision二步法染色。兔抗人SLC多克隆抗體(購自Abcam公司)的工作濃度為 1∶100，羊抗兔二抗(購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)工作濃度1∶100。所有切片均在同一條件的光學(xué)顯微鏡下觀察，每張切片隨機(jī)計(jì)數(shù)至少10個(gè)400倍視野，結(jié)果以細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色或褐色顆粒狀物者為陽性細(xì)胞，陰性對照為無棕黃色反應(yīng)產(chǎn)物。SLC表達(dá)以染色強(qiáng)度與陽性細(xì)胞數(shù)之積表示，染色強(qiáng)度：0分，陰性染色；1分，弱陽性染色；2分，中度陽性染色；3分，強(qiáng)陽性染色。陽性細(xì)胞數(shù)：0分，陰性；1分，陽性細(xì)胞數(shù)占1%~25%；2分，陽性細(xì)胞數(shù)占26%~50%；3分，陽性細(xì)胞數(shù)占51%~75%；4分，陽性細(xì)胞數(shù)占76%~100%。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié)果

正常對照組結(jié)腸黏膜上皮完整，未見糜爛、潰瘍，黏膜和黏膜下層可見少量炎癥細(xì)胞浸潤，固有層腺體形態(tài)正常、排列整齊；UC患者結(jié)腸黏膜上皮損傷、缺失，糜爛和潰瘍形成明顯，黏膜和黏膜下層可見密集分布的淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞浸潤，固有層腺體變形、排列紊亂(圖1)。正常對照組結(jié)腸黏膜組織中SLC呈陰性或弱陽性表達(dá)，UC組SLC均陽性表達(dá)(圖2)。UC患者結(jié)腸SLC表達(dá)較正常對照組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(4.16±0.78對0.52±0.11，P<0.05)；輕、中、重度UC患者結(jié)腸黏膜SLC表達(dá)(2.72±0.52、4.22±0.88、5.98±1.10)均較正常對照組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。中、重度UC患者結(jié)腸黏膜SLC表達(dá)與輕度UC組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；重度UC患者結(jié)腸黏膜SLC表達(dá)與中度UC相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表1)。

A：正常對照組；B：UC患者

圖1正常對照組和UC患者結(jié)腸組織病理檢查結(jié)果(HE染色，×200)

A：正常對照組；B：UC患者

圖2正常對照組和UC患者結(jié)腸組織中SLC表達(dá)(免疫組化 染色，×400)

表1　正常對照組和UC患者中SLC的表達(dá)±s)

*與正常對照組比較，P<0.05；#與輕度UC組比較，P<0.05

討論

當(dāng)UC發(fā)病時(shí)，在各種因素的作用下，一方面腸道SLC表達(dá)增高，通過濃度梯度吸引CCR7陽性淋巴細(xì)胞向淋巴結(jié)遷移；另一方面機(jī)體的淋巴細(xì)胞數(shù)量、淋巴細(xì)胞表面的CCR7表達(dá)亦明顯增加，兩者共同誘導(dǎo)多種淋巴細(xì)胞歸巢，促進(jìn)抗原呈遞細(xì)胞如T細(xì)胞、B細(xì)胞在淋巴結(jié)中聚集、活化、分化等[7-12]。Kawashima等[13]通過分析腸樣本發(fā)現(xiàn)SLC散在分布于腸內(nèi)淋巴結(jié)、集合淋巴管和淋巴管，腸系膜淋巴結(jié)SLC高表達(dá)于高內(nèi)皮小靜脈、淋巴管和間質(zhì)DC，尤其在T細(xì)胞區(qū)域。與UC相比，克羅恩病腸系膜淋巴結(jié)中SLC、ELC和CCR7 mRNA表達(dá)明顯增多，主要高表達(dá)于高內(nèi)皮小靜脈、成熟DC和淋巴管，引起T細(xì)胞異常增殖。SLC、ELC和CCR7的相互作用促進(jìn)了Th1免疫反應(yīng)，克羅恩病中記憶T細(xì)胞和成熟DC可能歸巢至腸系膜淋巴結(jié)。

多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎大鼠模型研究[1-3]表明，正常大鼠結(jié)腸少量表達(dá)SLC，主要表達(dá)于黏膜下層，可能與腸壁淋巴組織的發(fā)育、正常運(yùn)動(dòng)有關(guān)。SLC mRNA表達(dá)較對照組明顯增高，結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸黏膜下微血管區(qū)、淋巴結(jié)和派氏集結(jié)區(qū)的高內(nèi)皮小靜脈SLC強(qiáng)表達(dá)，同時(shí)亦可見腸黏膜下淋巴細(xì)胞的異常歸巢，SLC抗體干預(yù)后炎癥病變減輕，提示SLC大量表達(dá)可能參與結(jié)腸炎的病理過程，阻斷SLC有可能減輕結(jié)腸炎發(fā)病。進(jìn)一步對不同組別大鼠的腸道淋巴細(xì)胞培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，SLC對腸道淋巴細(xì)胞有趨化作用，結(jié)腸炎模型組的淋巴細(xì)胞趨化能力明顯增強(qiáng)，且移行能力與SLC濃度呈劑量效應(yīng)關(guān)系，但存在飽和現(xiàn)象，SLC抗體可減弱對淋巴細(xì)胞的趨化作用。本課題組的前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)[4-5]發(fā)現(xiàn)，SLC在結(jié)腸炎組織中表達(dá)上調(diào)，反映了疾病的炎癥程度，可作為病情嚴(yán)重程度的評價(jià)指標(biāo)，可能成為潛在治療的靶點(diǎn)。雷公藤內(nèi)酯醇能減輕結(jié)腸炎小鼠臨床癥狀，并下調(diào)SLC表達(dá)，表明雷公藤內(nèi)酯醇對小鼠結(jié)腸炎的治療效應(yīng)與抑制SLC表達(dá)相關(guān)，雷公藤內(nèi)酯醇拮抗SLC的表達(dá)可能成為有效的UC治療方法。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SLC在正常人結(jié)腸組織中不表達(dá)或弱陽性表達(dá)，而在UC患者結(jié)腸組織中的表達(dá)明顯上調(diào)，且UC病變程度越重，SLC表達(dá)陽性率越高，提示其表達(dá)與病變程度有一定相關(guān)性，這與動(dòng)物模型研究結(jié)果一致，說明SLC在UC局部結(jié)腸組織破壞和病理變化中起重要作用，SLC表達(dá)增高與UC發(fā)病密切相關(guān)，提示SLC是UC發(fā)病、發(fā)展的重要因素。抑制其過表達(dá)或靶向性抗體可達(dá)到治療UC的目的，為臨床治療提供新的思路。

總之，SLC參與了UC的發(fā)生和發(fā)展，反映了疾病的炎癥程度，可作為病情嚴(yán)重程度的評價(jià)指標(biāo)，可能成為潛在治療的靶點(diǎn)。

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(2014-09-12收稿；2014-10-16修回)

·短篇論著·

Expression and Significance of Secondary Lymphoid Tissue Chemokine in Ulcerative ColitisGAODongfeng,ZHOUGuoxiong,CAOWei,CHENHaiqin,ZHANGHaifeng.DepartmentofGastroenterology,AffiliatedHospitalofNantongUniversity,Nantong,JiangsuProvince(226001)

Correspondence to: ZHANG Haifeng, Email: zhanghaifeng740702@126.com

Background: Secondary lymphoid tissue chemokine (SLC) is involved in lymphoid homing and anti-tumor immune response, and has a chemotactic effect on intestinal lymphocytes. Several animal studies have shown that SLC is involved in the occurrence and development of ulcerative colitis (UC). Aims: To investigate the expression and significance of SLC in UC. Methods: Forty active UC patients from Dec. 2010 to Dec. 2012 at Affiliated Hospital of Nantong University were enrolled, and 20 healthy volunteers were served as controls. Expression of SLC in the colon mucosa was detected by immunohistochemistry, and its relationship with severity of UC was analyzed. Results: SLC was positively expressed in all UC patients, while was negatively or weakly positively expressed in controls. Expression of SLC in UC patients was significantly higher than that in controls (4.16±0.78vs. 0.52±0.11,P<0.05). Expression of SLC was correlated with the severity of involvement of UC. Conclusions: Expression of SLC participates in development and progress of UC. SLC may play an important role in the induction of local damage and pathological changes of UC.

Key wordsColitis, Ulcerative;Secondary Lymphoid Tissue Chemokine;Immunohistochemistry

通信作者&本文，Email: zhanghaifeng740702@126.com

DOI:10.3969/j.issn.1008-7125.2015.05.009