中華鱉抗嗜水氣單胞菌亞單位疫苗的制備與應用

黨　偉，陸洪良，高　原，董玲玉，鄭　鶴, 劉雅紅

(杭州師范大學生命與環(huán)境科學學院，浙江 杭州 310036)

中華鱉抗嗜水氣單胞菌亞單位疫苗的制備與應用

黨偉，陸洪良，高原，董玲玉，鄭鶴, 劉雅紅

(杭州師范大學生命與環(huán)境科學學院，浙江 杭州 310036)

摘要：水體條件致病菌嗜水氣單胞菌對中華鱉養(yǎng)殖業(yè)的危害巨大.為預防嗜水氣單胞菌的感染，提高中華鱉免疫抵抗力，研究開發(fā)嗜水氣單胞菌疫苗是一種有效的方法.利用PCR手段克隆獲得嗜水氣單胞菌DnaK和DnaJ兩個基因，并將兩基因重組到大腸桿菌表達載體上，轉化至大腸桿菌表達菌株，純化獲得了重組蛋白rDnaKAh和rDnaJAh.將兩個重組蛋白分別與弗氏佐劑充分混合制備成疫苗，腹腔注射中華鱉幼鱉，加強免疫一次后，用已分離獲得的致病菌株感染中華鱉幼鱉，實驗結果表明rDnaK具有81.8%的免疫保護效應，而rDnaJ僅具有31.8%的免疫保護效應.

關鍵詞：中華鱉；嗜水氣單胞菌；DnaK；DnaJ；免疫保護效應

中華鱉(Pelodiscussinensis)，屬于爬行綱(Reptilia)、龜鱉目(Chelonia)、鱉科(Trlonychidae)、鱉屬(Trionyx)，具有較高的食用和藥用價值，是我國重要的淡水養(yǎng)殖名優(yōu)品種.中華鱉養(yǎng)殖一直是增加農民收入、發(fā)展農村經濟的有效途徑，該養(yǎng)殖產業(yè)已成為許多省市的重點扶持產業(yè)和發(fā)展方向.但是在中華鱉養(yǎng)殖過程中由于商品鱉交易頻繁、人工養(yǎng)殖密度過大和養(yǎng)殖環(huán)境污染等因素，各類病害在養(yǎng)殖群體中頻繁爆發(fā).已有文獻記錄的中華鱉疾病達到30余種[1].水體中的常見菌嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophilia)[2]在現(xiàn)代高密度養(yǎng)殖和加溫(28～30 ℃)飼養(yǎng)條件下，繁殖能力最佳，致病性增強，是導致鱉病的主要致病菌[3].中華鱉嗜水氣單胞菌感染的臨床病型有多種，例如局部感染為主的皮膚潰瘍、癤瘡等，腹底板瓷白色為特征而出現(xiàn)白底，而更多見且危害又最嚴重的是急性出血性敗血癥[3].

結構保守的兩個蛋白DnaK(熱激蛋白70，Heat shock protein 70)和DnaJ(熱激蛋白40，Heat shock protein 40)是水生動物處于正常生存環(huán)境以及承受逆境壓力時發(fā)揮重要分子伴侶功能的物質[4].一些免疫試驗研究發(fā)現(xiàn)不同細菌DnaJ和DnaK的重組蛋白對宿主具有良好的免疫保護作用[5-7]；另一些研究雖未發(fā)現(xiàn)DnaK良好的免疫保護效應，但DnaK能夠提高宿主的體液免疫反應[8].本研究通過克隆獲得嗜水氣單胞菌的DnaK和DnaJ基因，利用原核表達系統(tǒng)對這兩個基因進行過量表達并純化獲得重組蛋白，采用弗氏佐劑作為免疫佐劑制備亞單位疫苗注射中華鱉幼鱉，為預防嗜水氣單胞菌感染中華鱉做好技術基礎.

1材料與方法

1.1　實驗材料

本實驗所用嗜水氣單胞菌A.hydrophiliaTL1，系本實驗室從余杭某養(yǎng)殖場病鱉肝臟中分離獲得.本實驗所用的中華鱉幼鱉購于浙江杭州某養(yǎng)殖場，重量都在7 g左右.

1.2　基因克隆

以嗜水氣單胞菌基因組DNA為模板，DnaKAh F1( 5’-CCCGGGCATATGGGTAAAATCATCGGTATTGA -3’,劃線部分為限制性內切酶SmaⅠ酶切位點)和DnaKAh R1(5’-CCCGGGCTCGAGCTTCTTGTCGTCTTTCACTTC -3’ ,劃線部分為限制性內切酶SmaⅠ酶切位點)為引物進行PCR擴增，獲得的DnaKAh基因，PCR條件為：94 ℃ 5min預變性模板DNA，然后94 ℃ 30s，55 ℃ 1min，72 ℃ 1min，5個循環(huán)后調整為94 ℃ 30s，68 ℃ 1min，72 ℃ 1min，25個循環(huán)后72 ℃延伸10min；使用引物DnaJAh F1(GGGCATATGTCGAAGCGCGATTTCTAC，劃線部分為限制性內切酶NdeⅠ酶切位點)和DnaJAh R1(CTCGAGGCTGGTCAGATCGTCGAAGA，劃線部分為限制性內切酶XhoⅠ酶切位點)克隆獲得DnaJAh基因, PCR條件為：94 ℃ 5min預變性模板DNA,然后94 ℃ 30s，58 ℃ 1min，72 ℃ 1min，5個循環(huán)后調整為94 ℃ 30s，66 ℃ 1min，72 ℃ 1min，25個循環(huán)后72 ℃延伸10min.將上述兩個基因的PCR產物純化后分別與載體pEASY-Simple-T1室溫連接10 min，將混合液轉化至大腸桿菌DH5α中，在含有100 μg /ml氨芐青霉素、40 μg/mL X-Gal和24 μg/mL異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)16 h后篩選陽性克隆，獲得重組質粒pEASYDnaK和pEASYDnaJ.

1.3　大腸桿菌表達載體的構建

使用限制性內切酶SmaⅠ酶切質粒pEASYDnaK，使用限制性內切酶NdeⅠ和XhoⅠ酶切質粒pEASYDnaJ，瓊脂糖電泳回收DnaK和DnaJ片段，分別將兩個純化的酶切片段連接至用SwaⅠ酶切處理的pET259和用NdeⅠ、XhoⅠ雙酶切處理的pET259質粒上，獲得大腸桿菌表達載體pETDnaK和pETDnaJ.

1.4　重組蛋白的誘導表達與純化

將重組質粒pETDnaK和pETDnaJ分別轉化至大腸桿菌BL21(DE3)中，使用含有50 μg/mL卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基37 ℃篩選陽性克隆，獲得轉化子BL21/ pETDnaK,將BL21/ pETDnaK于含有50 μg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中37 ℃振蕩過夜培養(yǎng)；而后轉接至新鮮培養(yǎng)液中，于37 ℃振蕩培養(yǎng)至OD600為0.6，加入終濃度為1 mM的IPTG，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，收集菌體，并裂解離心收集上清，采用his親和層析柱純化重組蛋白rDnaKAh和rDnaJAh.

1.5　亞單位疫苗的制備與免疫

將rDnaKAh和rDnaJAh分別與弗氏完全佐劑充分混合，制備成重組蛋白含量為100 μg/mL的亞單位疫苗.將購買的中華鱉隨機分為A, B, C三組，每組30只，A組為空白對照組，每只中華鱉僅注射100μL PBS，B組和C組為樣品組，分別注射100μL rDnaKAh亞單位疫苗和rDnaJAh亞單位疫苗.在第一次免疫3周后，將rDnaKAh和rDnaJAh分別與弗氏不完全佐劑充分混合，分別再次免疫中華鱉幼鱉.

1.6　亞單位疫苗免疫保護效應檢測

在LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)嗜水氣單胞菌至OD600為0.8，4 ℃條件下5000轉離心力離心10 min，收集菌體，將其使用PBS緩沖液重新懸浮至終濃度為5×107CFU/mL.在第二次免疫后一周使用嗜水氣單胞菌懸液腹腔注射三組中華鱉，每只100 μL的注射量.觀察每組中華鱉的死亡情況，14 d后，統(tǒng)計各組中華鱉的死亡數(shù)目.采用下述公式計算相對成活率(RPS):

RPS=100×(1-免疫組中華鱉的總死亡百分比/對照組中華鱉的總死亡百分比)

2結果與分析

2.1　基因的克隆及序列分析

以嗜水氣單胞菌基因組DNA為模板克隆，分別獲得長度為1963 bp的DnaKAh基因和1154 bp的DnaJAh基因(圖1).使用生物軟件DNAMAN分析預測DnaKAh基因能夠翻譯表達獲得等電點為4.52的69.2kDa的蛋白，DnaJAh基因能夠翻譯表達等電點為8.1的41 kDa的蛋白.利用NCBI中的BLAST序列分析發(fā)現(xiàn)，DnakAh蛋白序列極其保守，與氣單胞菌屬細菌的DnaK蛋白序列具有95%以上的同源性， DnaJAh蛋白序列也很保守，與氣單胞菌屬細菌的DnaJ蛋白序列具有87%以上的同源性.在PROSITE檢索發(fā)現(xiàn)，DnaKAh蛋白序列包含有熱激蛋白70的三個標簽序列：IDLGTTNS(7-14aa)、VYDLGGGTFDISII(192-205aa)、VILVGGQTRMPMVQK(337-351aa)，DnaJAh蛋白序列包含有DnaJ的一個標簽序列：FKEVKEAYEILTDANLRARY(47-66aa).

Line 1為DNA marker，line 2為DnaJ PCR結果，line 3為DnaK PCR結果圖1　以嗜水氣單胞菌基因組DNA為模板，PCR結果Fig. 1　PCR results confirmed by agarose electrophoresis

2.2　重組蛋白的純化

將目的基因連接到大腸桿菌表達載體上并成功轉化至大腸桿菌表達菌株中，采用Ni-NTA親和層析柱，純化獲得長度大約為69 kDa的rDnaKAh和長度為41 kDa的rDnaJAh (圖2)，與預測蛋白大小相符合.

Line 1為蛋白marker，line 2為rDnaJ,line 3為rDnaK圖2　DnaJ和DnaK基因在大腸桿菌中過量表達后純化所得的重組蛋白Fig. 2　Purified recombinant protein confirmed by SDS-PAGE

2.3　重組蛋白的免疫保護效應

將與弗氏佐劑混勻的重組蛋白注射中華鱉幼鱉后，加強免疫一次，采用嗜水氣單胞菌攻毒檢測，結果A組注射PBS空白對照組的累積死亡率為37%，B組注射 rDnaKAh亞單位疫苗實驗組的累積死亡率為7%，C組注射 rDnaJAh亞單位疫苗的實驗組累積死亡率為25% (圖3).依據(jù)計算公式計算獲得B、C兩組的相對成活率分別為81.8%和31.8%.

圖3　采用嗜水氣單胞菌攻毒檢測已免疫的3組中華鱉幼鱉每組的累積死亡率Fig. 3　Cumulative mortilities of the vaccined Chinese soft-shelled turtles challenged by pathogens

3討論

水產養(yǎng)殖過程中為預防嗜水氣單胞菌感染，減少由此而帶來的經濟損失，多采用抗生素，如環(huán)丙沙星、螺旋霉素、紅霉素、煙酸諾氟沙星、喹塞多、詠喹酸、先鋒霉素Ⅳ等抗菌素藥物，但所造成的抗生素殘留和引發(fā)的生物耐藥性，對人類健康和生態(tài)環(huán)境的穩(wěn)定都會產生巨大影響.生物疫苗(包括一代傳統(tǒng)疫苗和二代基因工程疫苗)能提高動物對特異性疾病的抵抗力，且不會造成環(huán)境污染、養(yǎng)殖產品藥物殘留等問題，已成為水生動物疾病防治研究的主流方向.

目前已發(fā)表的抗嗜水氣單胞菌的疫苗有多種.使用福爾馬林將嗜水氣單胞菌滅活后，直接注射，效果良好[9-10].也有將包含多種嗜水氣單胞菌毒力因子的生物膜(biofilm)[11-12]、外膜蛋白(outer member proteins)[13]、粗脂多糖(crude lipopolysaccharide)[14]收集起來，作為抗原注射實驗動物，結果都具有良好的免疫保護效應，而且其結果均比福爾馬林滅活疫苗的免疫保護效果更好.已發(fā)現(xiàn)的與細菌毒力相關的基因如溶血素、參與芳香族氨基酸合成的acroA基因，在嗜水氣單胞菌中都可獲得突變減活菌株，將減活菌株直接注射至魚體內，可以在魚體中檢測到較高的抗嗜水氣單胞菌的抗體，采用嗜水氣單胞菌進行攻毒實驗，結果顯示具有較好的免疫保護效應[15-17].S 層蛋白(S-layer protein)、外膜蛋白OmpTS(out member protein TS)都是與嗜水氣單胞菌毒力相關的蛋白，已有學者將其重組表達制備成亞單位疫苗，結果都具有較好的免疫保護效應[18-19].

基因工程亞單位疫苗是利用基因工程手段，克隆獲得微生物中編碼保護性抗原肽段的基因,與質粒等載體重組,導入受體菌或細胞中使之高效表達，產生大量保護性肽段,提取后加入佐劑即成為亞單位疫苗[20].本實驗克隆獲得嗜水氣單胞菌的DnaK和DnaJ基因，并利用大腸桿菌表達系統(tǒng)將其過量表達，首次研究報道這兩種重組蛋白作為保護性抗原對嗜水氣單胞菌的保護效應，免疫保護效應良好，其中DnaKAh的免疫保護效應達到81.8%，說明該疫苗在中華鱉抗嗜水氣單胞菌感染中的可行性.DnakAh蛋白具有極強的保守性，與其單胞菌屬的DnaK蛋白具有95%以上的同源性，與其他包含大腸桿菌在內的100余種革蘭氏陰性菌的DnaK蛋白具有82%以上的同源性，這種保守性對于研究多價疫苗用來預防由于多種細菌爆發(fā)引起的養(yǎng)殖業(yè)疾病具有重要的意義.本實驗主要采用注射免疫的方法，在本研究基礎上如何開發(fā)更加便捷和高效的疫苗將是日后進一步研究的方向.

參考文獻:

[1] 吳惠仙,王淑霞,胡向東.中華鱉疾病研究進展[J].水產科學,1999,18(5):38-41.

[2] Nielsen M E, H?i L, Schmidt A S,etal. IsAeromonashydrophilathe dominant motileAeromonasspecies that causes disease outbreaks in aquaculture production in the Zhejiang Province of China? [J] Diseases of aquatic organisms,2001,46(1):23-29.

[3] 姚金水,陳家祥,盧惠明，等.中華鱉嗜水氣單胞菌感染的病理學觀察[J].福建農業(yè)大學學報,1997,26(1):94-97.

[4] Fan C Y, Lee S, Cyr D M. Mechanisms for regulation of Hsp70 function by Hsp40[J]. Cell Stress Chaperones,2003,8(4):309-316.

[5] Khan M N, Bansal A, Shukla D,etal. Immunogenicity and protective efficacy of DnaJ (hsp40) ofStreptococcuspneumoniaeagainst lethal infection in mice[J]. Vaccine,2006,24(37-39):6225-6231.

[6] Dang W, Zhang M, Sun L.EdwardsiellatardaDnaJ is a virulence-associated molecular chaperone with immunoprotective potential[J]. Fish and Shellfish Immunology,2011,31(2):182-188.

[7] Paliwal P K, Bansal A, Sagi S S K,etal. Intraperitoneal immunization of recombinant HSP70 (DnaK) ofSalmonellaTyphi induces a predominant Th2 response and protective immunity in mice against lethalSalmonellainfection[J]. Vaccine,2011,29(38):6532-6539.

[8] Héchard C, Grépinet O, Rodolakis A. Proteic boost enhances humoral response induced by DNA vaccination with the dnaK gene ofChlamydophilaabortusbut fails to protect pregnant mice against a virulence challenge[J]. Veterinary research,2003,34(1):119-125.

[9] 趙萬鵬,黃斌,張海賓,等.中華鱉嗜水氣單胞菌苗的制備和應用[J].信陽師范學院學報:自然科學版,1999,12(3):300-303.

[10] Ruangpan L, Kitao T, Yoshida T. Protective efficacy ofAeromonashydrophilavaccines in Nile tilapia[J]. Veterinary Immunology and Immunopathology,1986,12(1):345-350.

[11] Azad I S, Shankar K M, Mohan C V,etal. Uptake and processing of biofilm and free-cell vaccines of Aeromonas hydrophila in Indian major carps and common carp following oral vaccination--antigen localization by a monoclonal antibody[J]. Diseases of aquatic organisms,2000,43(2):103-108.

[12] Nayak D K, Asha A, Shankar K M,etal. Evaluation of biofilm ofAeromonashydrophilafor oral vaccination ofClariasbatrachus-a carnivore model[J]. Fish & shellfish immunology,2004,16(5):613-619.

[13] Rahman M H, Kawai K. Outer membrane proteins ofAeromonashydrophilainduce protective immunity in goldfish[J]. Fish & shellfish immunology,2000,10(4):379-382.

[14] Baba T, Imamura J, Izawa K,etal. Immune protection in carp,CyprinuscarpioL., after immunization withAeromonashydrophilacrude lipopolysaccharide[J]. Journal of Fish Diseases,1988,11(3):237-244.

[15] Moral C H, del Castillo E F, Fierro P L,etal. Molecular characterization of theAeromonashydrophilaaroA gene and potential use of an auxotrophicaroAmutant as a live attenuated vaccine[J]. Infection and Immunity,1998,66(5):1813-1821.

[18] Poobalane S, Thompson K D, Ardó L,etal. Production and efficacy of anAeromonashydrophilarecombinant S-layer protein vaccine for fish[J]. Vaccine,2010,28(20):3540-3547.

[19] Khushiramani R, Girisha S K, Karunasagar I,etal. Protective efficacy of recombinant OmpTS protein ofAeromonashydrophilain Indian major carp[J]. Vaccine,2007,25(7):1157-1158.

[20] 燕海峰，肖兵南，Trefil P，等.國內生物疫苗及其產業(yè)發(fā)展現(xiàn)狀[J].中國畜牧獸醫(yī),2005,32(5):45-47.

Construction and Application of Subunit Vaccines againstAeromonasHydrophiliainPelodiscusSinensis

DANG Wei, LU Hongliang, GAO Yuan, DONG Lingyu, ZHENG He, LIU Yahong

(College of Life and Enviromental Sciences, Hangzhou Normal University, Hangzhou 310036, China)

Abstract:Aeromonas hydrophilia is the major pathogen during the culture of Pelodiscus sinensis. Vaccine is an effective method to improve the immunity of Pelodiscus sinensis for the defense of the A. hydrophilia infection. Two antigen genes, DnaK and DnaJ of A. hydrophilia, are cloned by PCR. And then, these two genes are reconstructed into the eukaryotic coli expression vector to obtain two recombination proteins rDnaKAh and rDnaJAh. These two recombination proteins mixed with Freund adjuvant are injected intraperitoneally into young Pelodiscus sinensis. One week after the boost, the young Pelodiscus sinensis is infected by the pathogenic strains isolated from the diseased Pelodiscus sinensis. The results show that the immune protective effect of rDnaK and rDnaJ are 81.8% and 31.8% respectively.

Key words:Pelodiscus sinensis; Aeromonas hydrophilia; DnaK; DnaJ; immune protective effect

通信作者：黨偉(1984—)，女，助理研究員，博士，主要從事爬行動物生態(tài)學研究. E-mail：dang.wei@hotmail.com

基金項目:浙江省公益技術應用研究項目(2012C22060)；杭州市科技局產學研合作項目(20112833N04)；杭州師范大學本科生創(chuàng)新能力提升工程項目(CX2013068)；2013年杭州師范大學研究生創(chuàng)新基金項目.

收稿日期：2014-10-14

文章編號:1674-232X(2015)02-0191-05

中圖分類號:TS209

文獻標志碼:A

doi:10.3969/j.issn.1674-232X.2015.02.015