甘草干姜湯治療變應(yīng)性鼻炎大鼠的實(shí)驗(yàn)研究*

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甘草干姜湯治療變應(yīng)性鼻炎大鼠的實(shí)驗(yàn)研究*

***貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院2011級(jí)本科學(xué)生網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2015-01-13

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20150113.1915.023.html

張燕平1， 吳寧2**， 王煒妍1， 王時(shí)敏2***

(1.貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院， 貴州 貴陽(yáng)550003； 2.貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院 生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室， 貴州 貴陽(yáng)550004)

[摘要]目的： 觀察甘草干姜湯對(duì)變應(yīng)性鼻炎大鼠外周血中γ-干擾素(IFN-γ)、白細(xì)胞介素-4(IL-4)的表達(dá)及鼻黏膜組織的影響。方法： 120只大鼠隨機(jī)分為正常組、甘草干姜湯組、模型組及西藥組4組，后3組用卵清蛋白(AVO)制作變應(yīng)性鼻炎動(dòng)物模型，分別給予甘草干姜湯2~2.5 mL/只、西替利嗪溶液2~2.5 mL/只、生理鹽水2~2.5 mL/只灌胃(模型組及對(duì)照組)，每天1次；每組大鼠分別在灌胃10、20及30 d時(shí)處死10只，檢測(cè)大鼠血清中IFN-γ和IL-4水平，同時(shí)觀察各組大鼠各時(shí)點(diǎn)的行為學(xué)和鼻黏膜組織學(xué)變化。結(jié)果： 灌胃10 d，甘草干姜湯組和西藥組與模型組大鼠行為學(xué)表現(xiàn)無(wú)明顯差異(P>0.05)，但與正常組存在明顯差異(P<0.01)；灌胃20 d，甘草干姜湯組和西藥組大鼠與模型組和正常組均有明顯的差異(P<0.01)；灌胃30 d，甘草干姜湯組和西藥組行為學(xué)變化接近正常組(P>0.05)；甘草干姜湯組和西藥組灌胃10和20 d 時(shí)，血清中IFN-γ、IL-4水平與正常組、模型組均有明顯差異(P<0.01)；灌胃30 d，甘草干姜湯組、西藥組IFN-γ和IL-4與模型組比較，分別有明顯升高和下降(P<0.01)，但與正常組無(wú)明顯差異(P>0.05)；HE染色示甘草干姜湯組與西藥組灌胃30 d，鼻黏膜結(jié)構(gòu)逐漸修復(fù)，嗜酸細(xì)胞顯著減少，而正常組與模型組未見(jiàn)明顯改變。結(jié)論： 甘草干姜湯能改善變應(yīng)性鼻炎大鼠的癥狀，對(duì)鼻黏膜有一定修復(fù)作用，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)IFN-γ-及IL-4水平有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]鼻炎，變應(yīng)性； 白細(xì)胞介素4； γ-干擾素； 鼻粘膜； 甘草干姜湯

變應(yīng)性鼻炎又稱過(guò)敏性鼻炎，是由于易感個(gè)體接觸致敏變應(yīng)原后導(dǎo)致的多種免疫活性細(xì)胞、細(xì)胞因子參與的鼻黏膜慢性炎癥性疾病，臨床以頻繁發(fā)作的噴嚏，過(guò)量的鼻水樣分泌物等癥狀為主要特征，是耳鼻咽喉頭頸外科常見(jiàn)多發(fā)病及難治性疾病[1]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)提出一些改善變應(yīng)性鼻炎癥狀的治療手段，但對(duì)遠(yuǎn)期療效還缺乏滿意的治療方法和手段，且費(fèi)用高，藥物副作用大，治療手段要求高，患者堅(jiān)持系統(tǒng)治療的依從性不高。中醫(yī)藥對(duì)治療變應(yīng)性鼻炎有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，但缺乏對(duì)其治療機(jī)理的科學(xué)依據(jù)。甘草干姜湯是張仲景的經(jīng)方，具有溫中復(fù)陽(yáng)，培土生金之功，全方藥味精簡(jiǎn)，理方甚深，臨床用甘草干姜湯煎水口服可明顯減輕變應(yīng)性鼻炎癥狀[2]，為探究其治療機(jī)理，本研究采用甘草干姜湯治療變應(yīng)性鼻炎動(dòng)物模型，總結(jié)如下。

1材料與方法

1.1材料與試劑

健康清潔級(jí)SD大鼠120只，體重180~220 g，雌雄各半，由重慶騰鑫生物技術(shù)有限公司提供，合格證號(hào)SCXK(渝)2007-005。參照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與人臨床用藥劑量體重?fù)Q算的轉(zhuǎn)換公式計(jì)算，將甘草干姜湯(甘草30 g、干姜15 g)按原方劑量要求在蒸餾水煎汁后用生理鹽水配成濃度相當(dāng)于生藥0.384 g/mL煎液[3]。西替利嗪(宜昌長(zhǎng)江藥業(yè)有限公司提供，批號(hào)20120314)，10 mg/片，用生理鹽水配制成0.05%溶液。卵清白蛋白(OVA，sigma產(chǎn)品，A5503-1G)；氫氧化鋁[AL(OH)3]、ELISA法血清試劑、白細(xì)胞介素-4(IL-4)含量測(cè)定試劑盒、干擾素-γ(IFN-γ)含量測(cè)定試劑盒，由上海巧伊生物科技有限公司提供，批號(hào)JER-03、JER-06。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1造模參照章如新[4]、Konno A[5]變應(yīng)性鼻炎動(dòng)物模型制作方法并改進(jìn)：將120只大鼠，常規(guī)飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)選90只采用卵清蛋白致敏的方法造模，用配好的含[OVA 0.3 mg+AL(OH)3凝膠30 mg]的變應(yīng)原混懸液每鼠1 mL腹腔注射，隔日1次，共7次，為基礎(chǔ)致敏。腹腔注射完成后，每只大鼠以0.25%OVA生理鹽水溶液2 mL霧化吸入強(qiáng)化致敏，每日1 次，連續(xù)5 d。間歇3 d后，用5%OVA生理鹽水攻擊雙側(cè)鼻腔，每側(cè)50 μL，每日1次，共7次。剩余30只大鼠用相應(yīng)等量的生理鹽水腹腔注射、霧化和滴鼻攻擊。

1.2.2動(dòng)物分組致敏后的90只大鼠隨機(jī)分為甘草干姜湯組、模型組和西藥組，各30只；剩余30只為正常組。甘草干姜湯組和西藥組分別給予甘草干姜湯和西替利嗪溶液2~2.5 mL/只，其余兩組給予2~2.5 mL/只的生理鹽水灌胃，每天1次；給藥期間，甘草干姜湯組、西藥組和模型組每日仍以1%OVA滴鼻維持致敏，正常組以生理鹽水滴鼻，每日1次，每次20 μL，直至給藥結(jié)束。各組大鼠分別在灌胃10、20、30 d時(shí)處死10只。

1.2.3行為學(xué)觀察參照1997年(?？?修訂的全國(guó)變應(yīng)性鼻炎診斷及療效評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)：從給藥開(kāi)始，觀察大鼠的噴嚏、抓鼻和流涕情況，觀察時(shí)間為鼻腔滴藥(給予1%OVA，每側(cè)50 μL)30 min內(nèi)，采用疊加量化記分法對(duì)大鼠進(jìn)行行為學(xué)指標(biāo)評(píng)分[6]。(1)噴嚏：1次連續(xù)3～9個(gè)為1分，10～14個(gè)為2分，≥15個(gè)為3分。(2)鼻癢：輕搔鼻2～3次為1分，3～5次為2分，5次以上為3分。(3)流涕：流至鼻孔為1分，超過(guò)前鼻孔為2分，涕流滿面為3分。疊加總分≥5分表示制造模型成功。

1.2.4外周血IL-4、INF-γ測(cè)定大鼠末次給藥24 h內(nèi)，股動(dòng)脈放血取血，分離血清，采用定量ELISA 法檢測(cè)血清IFN-γ和IL-4的含量。

1.2.5鼻黏膜組織取材大鼠處死后，剝除上頜骨部皮膚，將上頜骨從顱骨中游離出來(lái)，沿鼻中線切開(kāi)，暴露鼻中隔及雙側(cè)鼻腔，取鼻黏膜組織。將部分鼻中隔前部黏膜固定于10%甲醛溶液中，脫水，石蠟包埋，常規(guī)切片4 μm厚，HE染色，光鏡下觀察組織形態(tài)學(xué)改變。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2結(jié)果

2.1行為學(xué)表現(xiàn)

模型組、甘草干姜湯組和西藥組全部動(dòng)物疊加記分均>5分，出現(xiàn)典型的變應(yīng)性鼻炎癥狀，頻繁的噴嚏，搔抓鼻周?chē)?，大量清涕流出及覓食減少等行為學(xué)表現(xiàn)；正常組動(dòng)物偶有輕微噴嚏和搔抓鼻部的癥狀，但疊加記分均<5；模型組、甘草干姜湯組和西藥組3組大鼠變應(yīng)性鼻炎造模成功。灌胃10 d，甘草干姜湯組與西藥組大鼠仍有的噴嚏、撓鼻、流清涕表現(xiàn)，與模型組大鼠行為學(xué)表現(xiàn)無(wú)明顯差異(P>0.05)，但與正常組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。甘草干姜湯組與西藥組給藥20 d后，癥狀明顯好轉(zhuǎn)，噴嚏、撓鼻次數(shù)較前明顯減輕，鼻部癥狀未完全恢復(fù)，仍有變應(yīng)性鼻炎癥狀表現(xiàn)，與模型組與正常組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；甘草干姜湯組與西藥組治療30 d后，鼻部癥狀與正常組大鼠差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)表1。

表1　各組大鼠干預(yù)后的行為學(xué)指標(biāo)

(1)與正常組比較，P<0.01；(2)與模型組比較，P>0.05；(3)與正常組比較，P<0.01；(4)與模型組比較，P<0.01；(5)與正常組比較，P>0.05；(6)與模型組比較，P<0.01

2.2血清IFN-γ、IL-4

甘草干姜湯組和西藥組給藥10、20 d時(shí)，與模型組比較，血清IFN-γ水平明顯升高，IL-4水平明顯下降(P<0.01)；用藥30 d時(shí)，與模型組比較，甘草干姜湯組和西藥組IFN-γ明顯升高，IL-4明顯下降(P<0.01)，但甘草干姜湯組和西藥組IFN-γ、IL-4與正常組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2。

2.3大鼠鼻黏膜變化

圖1顯示，正常組大鼠鼻粘膜上皮細(xì)胞無(wú)增生，排列整齊，杯狀細(xì)胞少，固有層無(wú)水腫；模型組大鼠鼻粘膜上皮增厚，杯狀細(xì)胞增生，固有層水腫，嗜酸細(xì)胞浸潤(rùn)，腺體增生；甘草干姜湯組10 d時(shí)，鼻粘膜纖毛排列不整齊，上皮細(xì)胞增生，嗜酸細(xì)胞浸潤(rùn)；甘草干姜湯組20 d時(shí)，上皮細(xì)胞逐漸變薄，嗜酸細(xì)胞浸潤(rùn)變少；甘草干姜湯組30 d時(shí)，鼻粘膜纖毛排列整齊，上皮細(xì)胞逐漸恢復(fù)正常，僅有少量的嗜酸細(xì)胞存在；西藥組10 d時(shí)，上皮細(xì)胞增生，嗜酸細(xì)胞浸潤(rùn)；西藥組20 d時(shí)，上皮細(xì)胞變薄，嗜酸細(xì)胞浸潤(rùn)變少；西藥組30 d時(shí)，纖毛整齊，上皮細(xì)胞逐漸恢復(fù)正常，嗜酸細(xì)胞減少。

表2　各組大鼠干預(yù)后血清IFN-γ、IL-4水平

(1)與正常組比較，P<0.01；(2)與模型組比較，P<0.01；(3)與正常組比較，P<0.01；(4)與模型組組比較，P<0.01；(5)與正常組比較，P>0.05；(6)與模型組比較，P<0.01

圖1　各組大鼠干預(yù)后鼻黏膜病理學(xué)觀察(HE,×400)Fig.1　The pathological changes of nasal mucosa of rats in each group after medication

3討論

變應(yīng)性鼻炎時(shí)患者體內(nèi)T淋巴細(xì)胞亞群的失衡，尤其是Th1/Th2細(xì)胞在數(shù)量、活化及功能方面的比例失衡是其發(fā)病機(jī)制中的重要環(huán)節(jié)，是導(dǎo)致鼻黏膜慢性炎癥和組織損傷的重要因素[7]。IL-4是Th2細(xì)胞釋放的關(guān)鍵性細(xì)胞因子，對(duì)Th2細(xì)胞極化有重要的誘導(dǎo)作用，并可抑制Th1細(xì)胞的增殖[8]。IFN-γ為T(mén)h1細(xì)胞的標(biāo)志性細(xì)胞因子，可抑制Th2細(xì)胞的增殖活化，減少I(mǎi)L-4的產(chǎn)生，并拮抗IL-4的各種生物學(xué)效應(yīng)，阻止IgE的合成[9]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)甘草干姜湯有改善變應(yīng)性鼻炎的癥狀，對(duì)變應(yīng)性鼻炎細(xì)胞因子失衡方面有一定的調(diào)節(jié)作用，作用機(jī)制可能是甘草干姜湯可糾正失衡的Th1/Th2細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò),使變應(yīng)性鼻炎大鼠血清中的IFN-γ水平升高、IL-4水平降低，從而使體內(nèi)Th細(xì)胞分化偏移發(fā)生逆轉(zhuǎn),促使Th1/Th2分泌的細(xì)胞因子比值恢復(fù)平衡，從而抑制并改善變應(yīng)性鼻炎臨床癥狀。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示變應(yīng)性鼻炎大鼠在服用甘草干姜湯治療20~30 d有效，為臨床上服用甘草干姜湯治療變應(yīng)性鼻炎提供有效的用藥周期。通過(guò)觀察病理切片HE染色大鼠鼻粘膜組織結(jié)構(gòu)的改變及炎癥因子數(shù)量變化，說(shuō)明甘草干姜湯有一定修復(fù)鼻粘膜組織損傷的作用，有利于炎癥的消除。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果初步探討甘草干姜湯治療變應(yīng)性鼻炎的作用機(jī)制，為甘草干姜湯合理運(yùn)用于臨床提供了一定的實(shí)驗(yàn)理論支持。

參考文獻(xiàn)4

[1] 顧之燕,董震.變應(yīng)性鼻炎的診治原則和推薦方案(2004 年,蘭州)[J].中華耳鼻咽喉頭頸外科雜志， 2005(3)：166-167.

[2] 張燕平.運(yùn)用甘草干姜湯的臨床點(diǎn)滴體會(huì)[J]. 中國(guó)中醫(yī)藥現(xiàn)代遠(yuǎn)程教育, 2011(18):62.

[3] 陳奇.中藥藥理研究方法學(xué)[M]. 北京:人民衛(wèi)生出版社， 2006:1168，1180.

[4] 章如新,江德勝,李兆基,等.P物質(zhì)能神經(jīng)阻滯劑治療變應(yīng)性鼻炎的實(shí)驗(yàn)研究[ J ] .中華耳鼻咽喉科雜志, 1994(5):282-285.

[5] Konno A,Terada N,Okamoto Y.changes of adrenergic andmuscarinic cholinergic recePtors in nasal mucosa in nasal allergy[J].ORL, 1987(49):103.

[6] 中華醫(yī)學(xué)會(huì)耳鼻咽喉科分會(huì)，中華耳鼻咽喉科雜志編委會(huì).變應(yīng)性鼻炎診斷標(biāo)準(zhǔn)及療效評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)[J].中華耳鼻咽喉科雜志， 1998(3)：134-135.

[7] 熊瑛, 章詩(shī)富, 成麗蘭,等. 濱蒿內(nèi)酯治療變應(yīng)性鼻炎的實(shí)驗(yàn)研究[J]. 貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 2011(5):452-459.

[8] 張明,趙利敏.Th2細(xì)胞的極化[J].山東大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 2003(6):369.

[9] 趙義造,黃益燈,黃加云.針刺對(duì)變應(yīng)性鼻炎大鼠IL-4、IFN-γ水平影響的研究[J].福建中醫(yī)藥, 2010(5):52-53.

(2014-09-03收稿，2014-10-23修回)

中文編輯： 文箐潁； 英文編輯： 周凌

Experimental Study on the Role of Licorice and Dried Ginger

in Treating Rats with Allergic Rhinitis

ZHANG Yanping1, WU Ning2, WANG Weiyan1, WANG Shimin2

(1.TheSecondAffiliatedHospitalofGuiyangCollegeofTraditionalChineseMedicine,Guiyang550003,Guizhou,China;

2.DepartmentofBiochemistryandMolecularbiology,GuiyangMedicalCollege,Guiyang550004,Guizhou,China

[Abstract]Objective: To observe the impact of licorice and dried ginger on peripheral blood levels of γ-interferon (IFN-γ) and interleukin-4 (IL-4) as well as nasal tissue of allergic rhinitis rats. Methods: A total of 120 rats were randomly divided into four groups: the normal control group (group C), licorice and dried ginger group (group L), model group (group M), and western medicine control group (group W). Rats in the latter three groups were given ovalbumin (OVA) to establish allergic rhinitis model and were given licorice and dried ginger soup, physiological saline and cetirizine by gavage respectively. On the 10th, 20thand 30thday after administration, 10 rats were sacrificed respectively, and serum levels of IFN-γ, IL-4 were detected, changes of rat behavior and nasal mucosa tissues in each time point were observed. Results: On the 10thday after medication, there was no significant difference in rat behavior among groups L, M and W (P>0.05), while significant difference was found between the three groups and group C (P<0.01). On the 20thday after medication, there were significant differences in rat behavior and serum levels of IFN-γ, IL-4 between groups L, W and groups C, M (P<0.01). On the 30th day after medication, rat behavior and serum levels of IFN-γ, IL-4 in groups L and W were close to group C (P>0.05), and the structure of nasal mucosa gradually repaired, eosinophils significantly reduced in groups L and W. Conclusions: Licorice and dried ginger can improve the symptoms of allergic rhinitis rat and repair the nasal mucosa. The mechanism may relate to regulate the serum levels of IFN-γ and IL-4.

[Key words]rhinitis,allergic; interleukin-4; γ-interferon; nasal mucosa; licorice and dried ginger

[中圖分類號(hào)]R34; R765.21

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1000-2707(2015)01-0036-05

通信作者**E-mail:Zhang＿ypdjl@sina.com

[基金項(xiàng)目]*貴州省科技廳項(xiàng)目[黔科合中藥字(2011)LKZ7012號(hào)]