人參皂甙單體Rb1對(duì)大鼠腦缺血損傷保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究

任慶華　羅江兵　李長(zhǎng)清

529000　廣東省江門(mén)市人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科(任慶華),神經(jīng)外科(羅江兵)；重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科(李長(zhǎng)清)

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人參皂甙單體Rb1對(duì)大鼠腦缺血損傷保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究

任慶華羅江兵李長(zhǎng)清

529000廣東省江門(mén)市人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科(任慶華),神經(jīng)外科(羅江兵)；重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科(李長(zhǎng)清)

中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后康復(fù)是醫(yī)學(xué)界一大難題，缺血性腦血管疾病則是中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的常見(jiàn)原因。人參是傳統(tǒng)中藥，其提取物的多種成分具有藥理活性，其中Rb1可誘導(dǎo)神經(jīng)元的分化，保護(hù)皮質(zhì)神經(jīng)元，誘導(dǎo)其突起生長(zhǎng)，對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)有神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)效應(yīng)[1]。本實(shí)驗(yàn)采用人參皂甙單體Rb1對(duì)鼠實(shí)驗(yàn)性腦缺血后進(jìn)行干預(yù)，觀(guān)察其可能的腦保護(hù)效應(yīng)。

1材料與方法

1.1動(dòng)物成年雄性清潔級(jí)SD大鼠30只(由重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供)隨機(jī)分為5組, 假手術(shù)組(Sham)、缺血對(duì)照組(Con)、干預(yù)組(Tre)，干預(yù)組又分為Rb130 mg/kg、60 mg/kg及90 mg/kg三個(gè)不同劑量組，每組各6只。采用Zea Longa改良法建立大腦中動(dòng)脈閉塞(MCAO)模型[2]。干預(yù)組在術(shù)前用相應(yīng)劑量Rb1 ip qd×7 d，末次給藥后3 h內(nèi)造模，假手術(shù)組與缺血對(duì)照組術(shù)前用相同劑量生理鹽水代替；假手術(shù)組接受手術(shù)，但栓線(xiàn)不插入頸內(nèi)動(dòng)脈顱內(nèi)段。對(duì)照組及干預(yù)組大鼠清醒后無(wú)神經(jīng)功能缺損者或有蛛網(wǎng)膜下腔出血者棄之，隨機(jī)補(bǔ)充大鼠。

1.2標(biāo)本采集術(shù)后48 h再次麻醉大鼠，直視下開(kāi)胸，剪開(kāi)右心耳，以200 ml生理鹽水經(jīng)升主動(dòng)脈快速灌注，然后以4%多聚甲醛400 ml灌注；灌注完畢后立即斷頭取腦，于中1/3處取冠狀位切片(厚約3～4 mm)，4%多聚甲醛中固定過(guò)夜常規(guī)石蠟包埋；用于TTC染色或腦組織含水量測(cè)定的標(biāo)本在麻醉后直接快速斷頭取腦，不做灌注處理。

1.3神經(jīng)功能缺失征象的評(píng)定采用Zea Longa評(píng)分[2]，0分：無(wú)神經(jīng)功能缺損，肢體活動(dòng)正常：1分：神經(jīng)功能輕度局灶性損傷,提尾時(shí)不能伸展左前肢；2分：神經(jīng)功能中度局灶性損傷，向左側(cè)劃圈；3分：神經(jīng)功能重度局灶性損傷，向左側(cè)傾倒；4分：神經(jīng)功能極重度局灶性損傷,無(wú)自主行走、意識(shí)障礙或昏迷。

1.4病理學(xué)觀(guān)察及調(diào)亡細(xì)胞檢測(cè)石蠟切片常規(guī)HE染色觀(guān)察缺血后病理改變。原位末端標(biāo)記DNA片段(TUNEL)檢測(cè)細(xì)胞凋亡。調(diào)亡試劑盒由德國(guó)Roche公司提供，操作過(guò)程按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.5TTC染色測(cè)定梗死面積取大鼠新鮮腦組織，從額極至小腦做冠狀位切片，每片厚2 mm；將腦片浸入37 ℃預(yù)熱的2%TTC溶液中37 ℃中孵育15 min，4%的中性多聚甲醛10 ml固定24 h，數(shù)碼像機(jī)攝像,在TD2000計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)上計(jì)算出梗死區(qū)相對(duì)體積。水腫對(duì)梗死灶體積的影響采用Swanson的方法進(jìn)行糾正，即梗死面積=非缺血側(cè)半球面積-缺血側(cè)半球未梗死區(qū)面積，梗死灶體積以梗死側(cè)體積和非缺血側(cè)半球體積的百分比(%)來(lái)表示[3]。

1.6腦含水量(BWC)測(cè)定(干濕重法)新鮮腦組織放在一個(gè)內(nèi)有生理鹽水潤(rùn)濕的定性濾紙的培養(yǎng)皿中，以防水分蒸發(fā)，去除皮質(zhì)表面的軟腦膜、小腦、腦干；取缺血側(cè)和梗死對(duì)側(cè)大腦半球分別置于稱(chēng)量杯中分析天平稱(chēng)濕重；從取腦到稱(chēng)量完畢時(shí)間控制在5 min，然后放入電熱恒溫箱內(nèi)100 ℃烘烤24 h后取出，至分析天平恒重后稱(chēng)干重(兩次干重之差小于等于0.2 mg)；腦組織含水量按以下公式計(jì)算：腦含水量(%)=(濕重-干重)/濕重× 100%[4]。

1.7NgR表達(dá)的測(cè)定石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，3%過(guò)氧化氫室溫孵育10～15 min，置于0.01 M枸櫞酸鹽緩沖液中進(jìn)行微波抗原修復(fù)，冷卻至室溫后0.01 M的PBS浸泡5 min，滴加正常山羊封閉血清室溫孵育20 min，傾去多余血清，滴加抗NgR(純化的抗Nogo-66受體的IgG抗體，美國(guó)ad公司，按1∶150的比例稀釋)30 ul4 ℃冰箱過(guò)夜，滴加生物素標(biāo)記的二抗工作液，室溫孵育15 min，滴加辣根標(biāo)記鏈霉卵白素，室溫孵育15 min，DAB顯色，鏡下觀(guān)察控制染色時(shí)間，自來(lái)水充分沖洗；蘇木素復(fù)染，鏡下觀(guān)察控制染色時(shí)間，自來(lái)水充分沖洗；脫水、二甲苯透明、中性樹(shù)脂封片。各步驟間均用0.01 M PBS充分沖洗。同時(shí)設(shè)立對(duì)照，用正常羊血清代替抗NgR。二抗試劑盒為中山試劑公司提供的SP-9001。在計(jì)算機(jī)上用TD2000病理圖像分析系統(tǒng)分析并計(jì)算陽(yáng)性表達(dá)面積(μm2)。

2結(jié)果

2.1大鼠局灶性腦缺血再灌注后神經(jīng)功能評(píng)分、腦梗死體積及腦組織含水量的變化。

在缺血后48 h缺血對(duì)照組表現(xiàn)出不同程度神經(jīng)功能缺失，出現(xiàn)梗死病灶及腦水腫。各干預(yù)組與假手術(shù)組或缺血對(duì)照組相比差異顯著。在神經(jīng)功能評(píng)分中干預(yù)組相鄰劑量組間比較無(wú)顯著差異(P>0.05)，干預(yù)各組間腦梗死體積及腦組織含水量比較(P<0.05)(表1)。

2.2大鼠局灶性腦缺血再灌注腦組織病理學(xué)觀(guān)察

缺血后48 h腦組織出現(xiàn)不同程度的腦水腫及神經(jīng)細(xì)胞缺失，失去正常結(jié)構(gòu)形態(tài)，細(xì)胞變形，核固縮，細(xì)胞周?chē)霈F(xiàn)空泡，可見(jiàn)紅色神經(jīng)元。缺血對(duì)照組的病理改變明顯重于干預(yù)各組，出現(xiàn)神經(jīng)細(xì)胞潰變，神經(jīng)纖維網(wǎng)疏松呈海綿狀。

表1　各組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分、腦梗死體積

注：One-way ANOVA，與缺血對(duì)照組比較，△P>0.05，*P<0.05，▲P<0.01；與假手術(shù)組比較，▽P<0.01

2.3大鼠局灶性腦缺血再灌注后調(diào)亡細(xì)胞及NgR表達(dá)的變化。

表2　各組大鼠調(diào)亡細(xì)胞數(shù)及NgR表達(dá)的變化

注：與缺血對(duì)照組比較，*P<0.01；△P>0.05

TUNEL法檢測(cè)調(diào)亡細(xì)胞，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，陽(yáng)性表現(xiàn)為核固縮深染的棕黃色細(xì)胞為調(diào)亡細(xì)胞。在假手術(shù)組腦組織偶見(jiàn)調(diào)亡細(xì)胞。缺血后調(diào)亡細(xì)胞增加，各干預(yù)組增加程度較缺血對(duì)照組小(P<0.01)。各干預(yù)組間比較(P<0.05)(表2)。

NgR主要表達(dá)在細(xì)胞膜及突起上，呈棕黃色。在假手術(shù)組也有表達(dá)，主要在胞膜上，突起上表達(dá)少；缺血后表達(dá)增多，表現(xiàn)為表達(dá)強(qiáng)度增加及突起上表達(dá)增加，突起上表達(dá)主要在近端。各組間均有顯著差異。(圖1～5)

3討論

腦梗死是臨床多發(fā)病，發(fā)病后腦水腫程度、梗死面積大小、神經(jīng)細(xì)胞存活情況等嚴(yán)重影響著病人的功能恢復(fù)及預(yù)后。本實(shí)驗(yàn)觀(guān)察到病理檢查顯示假手術(shù)組形態(tài)結(jié)構(gòu)基本正常，大腦皮質(zhì)分層清楚。缺血后48 h腦組織出現(xiàn)不同程度的腦水腫及神經(jīng)細(xì)胞缺失，失去正常結(jié)構(gòu)形態(tài)，細(xì)胞變形，核固縮，細(xì)胞周?chē)霈F(xiàn)空泡，可見(jiàn)紅色神經(jīng)元。缺血對(duì)照組的病理改變明顯重于干預(yù)各組，出現(xiàn)神經(jīng)細(xì)胞潰變，神經(jīng)纖維網(wǎng)疏松呈海綿狀。干預(yù)組的間質(zhì)水腫明顯輕于缺血對(duì)照組。腦組織受到缺血缺氧刺激，誘發(fā)神經(jīng)細(xì)胞死亡。細(xì)胞在形態(tài)學(xué)上有兩種死亡過(guò)程：一種是有害因素的極度刺激造成的病理性死亡，即壞死；另一種是細(xì)胞內(nèi)外因素激活細(xì)胞本身的主動(dòng)程序性死亡，即凋亡，主要表現(xiàn)為染色質(zhì)凝集，胞膜完整，細(xì)胞內(nèi)容物不釋放，不引起炎癥反應(yīng)。近年來(lái)對(duì)調(diào)亡機(jī)制的研究顯示腦缺血后神經(jīng)細(xì)胞死亡與細(xì)胞調(diào)亡關(guān)系密切。TUNEL法利用分子生物學(xué)與組織化學(xué)相結(jié)合的技術(shù)，特異性標(biāo)記DNA片段，原位檢測(cè)凋亡細(xì)胞,并具有較高的敏感性。如何有效控制腦水腫，防止梗塞體積擴(kuò)大，保護(hù)存活細(xì)胞挽救瀕死細(xì)胞將有重要的臨床意義。本實(shí)驗(yàn)顯示干預(yù)組預(yù)先給人參皂甙單體Rb1能夠顯著減少腦水腫程度、減小梗死面積及梗塞周邊區(qū)調(diào)亡細(xì)胞，改善功能評(píng)分，這與病理改變一致。不同劑量組間顯示出不同的保護(hù)強(qiáng)度。提示Rb1能通過(guò)減輕缺血性損傷后腦水腫等作用發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用且具有劑量依賴(lài)性。

圖1 假手術(shù)組大鼠缺血再灌注48h后NgR的表達(dá)水平(×200倍) 圖2 缺血對(duì)照組大鼠缺血再灌注48h后NgR的表達(dá)水平(×200倍) 圖3 Rb130mg/kg組大鼠缺血再灌注48h后NgR的表達(dá)水平(×200倍) 圖4 Rb160mg/kg組大鼠缺血再灌注48h后NgR的表達(dá)水平(×200倍) 圖5 Rb190mg/kg大鼠缺血再灌注48h后NgR的表達(dá)水平(×200倍)

中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)損傷后的再生能力一直是神經(jīng)病學(xué)家高度關(guān)注的問(wèn)題，這是影響功能恢復(fù)的關(guān)鍵。同發(fā)育中的CNS相比，成熟CNS損傷后的功能恢復(fù)及結(jié)構(gòu)可塑性能力是很有限的。現(xiàn)有研究顯示眾多抑制因子中Nogo-A備受注目，它分布于CNS髓鞘膜中，有兩個(gè)活性區(qū)域。其中Nogo-66與NgR(Nogo-66 receptor)特異性結(jié)合而表現(xiàn)出強(qiáng)大的抑制軸突生長(zhǎng)的作用[5]。用Nogo-66的特異競(jìng)爭(zhēng)性拮抗劑NEP1-40阻止Nogo-66與NgR的結(jié)合，可以促進(jìn)損傷軸突生長(zhǎng)及功能恢復(fù)[6]。已在鼠短暫性半球缺血(缺血10分鐘)后檢測(cè)到NgR的表達(dá)增高[7]。已有研究顯示NgR不僅僅是Nogo-A的作用點(diǎn)，它還是其它中樞髓鞘衍生軸突生長(zhǎng)抑制因子髓鞘相關(guān)糖蛋白(MAG)和少突膠質(zhì)細(xì)胞髓鞘糖蛋白(OMgp)發(fā)揮作用的集中點(diǎn)[8-9]，對(duì)NgR進(jìn)行干預(yù)或許可以收到比干預(yù)單一抑制因子更強(qiáng)大的促軸突生長(zhǎng)作用。本實(shí)驗(yàn)觀(guān)察到實(shí)驗(yàn)性腦梗死后NgR的表達(dá)增高，表現(xiàn)為表達(dá)強(qiáng)度增加及突起上表達(dá)增加。干預(yù)組的增高程度低于缺血對(duì)照組，有顯著差異。這提示Rb1可能在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后康復(fù)中起促進(jìn)作用。但其作用是直接干預(yù)NgR的表達(dá)，還是存在其它環(huán)節(jié)的作用？有待實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究。

人參是傳統(tǒng)醫(yī)藥的重要藥材，Rb1是從中提取的有效單體之一，有著多方面的藥理作用[10-12]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示其提取物Rb1對(duì)鼠實(shí)驗(yàn)性腦缺血再灌注損傷有保護(hù)作用且呈劑量相關(guān)性，這不僅為臨床用藥提供依據(jù)，還為臨床治療中樞神經(jīng)損傷開(kāi)辟新思路。

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(2014-09-18收稿)

【摘要】目的觀(guān)察人參皂甙單體Rb1 對(duì)大鼠實(shí)驗(yàn)性腦缺血的保護(hù)作用。方法健康成年雄性清潔級(jí)SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(Sham)、缺血對(duì)照組(Con)、干預(yù)組(Tre)，干預(yù)組又分為Rb130 mg/kg、60 mg/kg及90 mg/kg三個(gè)不同劑量組。缺血對(duì)照組采用線(xiàn)栓法建立大腦中動(dòng)脈閉塞模型，缺血2 h后撥出線(xiàn)栓再灌注；各干預(yù)組用相應(yīng)劑量Rb1 ip qd×7 d，末次給藥后3 h內(nèi)用同樣方法建立大腦中動(dòng)脈閉塞模型及再灌注；假手術(shù)組不插入線(xiàn)栓，余操作相同。術(shù)后48 h取標(biāo)本TTC染色測(cè)梗死體積、干濕重法腦組織含水量測(cè)定、Tunnel法測(cè)定調(diào)亡細(xì)胞數(shù)及NgR表達(dá)的免疫組化測(cè)定。結(jié)果各干預(yù)組的梗死體積分別為30 mg/kg組(27.629±1.401)%，60 mg/kg組(24.164±1.710)%，90mg/kg組(21.955±2.556)%，缺血對(duì)照組為(29.846±1.153)%；腦組織含水量為30 mg/kg組(80.079±0.726)%，60 mg/kg組(78.984±0.902)%，90 mg/kg組(77.855±0.258)%，假手術(shù)組與缺血對(duì)照組分別為(76.517±0.37)%、(81.799±1.065)%；調(diào)亡細(xì)胞數(shù)分別為30 mg/kg組(89.000±10.296)，60 mg/kg組(59.000±12.522)，90 mg/kg組(36.667±19.054)，假手術(shù)組與缺血對(duì)照組分別為(1.600±1.517)、(132.667±22.223)；NgR表達(dá)陽(yáng)性面積分別為30 mg/kg組(84.827±3.870)，90 mg/kg組(66.040±5.541)，60 mg/kg組(75.577±7.150)，假手術(shù)組與缺血對(duì)照組分別為(48.355±9.720)、(91.485±5.822)。結(jié)論人參皂甙單體Rb1對(duì)大鼠實(shí)驗(yàn)性腦缺血有保護(hù)作用，能減輕缺血再灌注損傷所致的腦水腫及梗塞面積，減少細(xì)胞調(diào)亡，并且該保護(hù)作用呈劑量依賴(lài)性。對(duì)NgR表達(dá)的干預(yù)提示Rb1可能在腦缺血死后神經(jīng)可塑性中起促進(jìn)作用。

【關(guān)鍵詞】腦缺血人參皂甙再灌注損傷Rb1NgR

【DOI】10.3969/j.issn.1007-0478.2015.04.003

Experimental study on the protection of ginseng Rb1 in rats with cerebral ischemic reperfusion injuryRenQinghua,LuoJiangbing,LiChangqing.DepartmentofNeurology,thePeople’sHospitalofJiangmenCity,GuangdongProvince,Jiangmen529000

【Abstract】ObjectiveTo observe the protection of ginseng Rb1 in rats with local cerebral ischemic reperfusion injury.MethodsHealthy Sprague-Dawley rats were divided into three groups: Sham, control and treat group. Treat group was divided into three subgroups : Rb130 mg/kg、60 mg/kg and 90 mg/kg group. MCAO models were created after seven days of Rb1 ip qd in treat group with respective dose and NS ip qd in control group.Tthe line extracted after occlusion 2 h. Sham group only receives sham operation. Rats were sacrificed at 48 h. The markers such as the expression intensity of NgR protein, brain water content, volume of infarction by TTC staining, and the count of apoptosis cell were estimated.ResultsCompared with control groups, the levels of expression of NgR protein, brain water content, volume of infarction and the count of apoptosis cell were lower in treat group and showed statistical difference (P<0.05). In treat group, there was also statistical difference between three subgroups.ConclusionsThe article show ginseng Rb1 has protective effect on rats with local cerebral ischemic reperfusion injury. Rb1 can decrease brain edema, infarction volume and apoptosis cell counting induced by local ischemic perfusion injury. It also indicates Rb1 may play a role in rehabilitation after CNS injury because Rb1 reduced the expression of NgR protein.

【Key words】Cerebral ischemiaGinsengRb1Reperfusion injuryNgR

【中圖分類(lèi)號(hào)】R743

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【文章編號(hào)】1007-0478(2015)04-0203-04