MTT法測(cè)定補(bǔ)骨脂素和魚腥草素鈉在體外對(duì)陰道毛滴蟲的殺滅作用*

孫寶清 ，蔡納新 ，許子華 ，譚桂蓮 ，董會(huì)霞 ，魏秋芬

1首都醫(yī)科大學(xué)燕京醫(yī)學(xué)院，北京 101300；2首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院

陰道毛滴蟲是一種寄生在人體陰道及泌尿道的寄生蟲，可引起滴蟲性陰道炎、滴蟲性尿道炎等。滴蟲性陰道炎是一種呈世界性分布的性傳播疾病，孕期婦女感染滴蟲可導(dǎo)致早產(chǎn)、死胎及低體質(zhì)量?jī)撼錾?，另外滴蟲病與不孕癥及子宮癌的發(fā)生也密切相關(guān)［1-2］，并可增加HIV感染機(jī)會(huì)。目前，臨床上治療滴蟲性陰道炎主要采用甲硝唑或替硝唑等咪唑類藥物。然而隨著應(yīng)用范圍的擴(kuò)大與應(yīng)用時(shí)間的延長(zhǎng)，不斷有新耐藥株產(chǎn)生，并且研究發(fā)現(xiàn)甲硝唑具有致畸、致癌、惡心、胃腸不適等副作用［3］。多種中藥提取物如大黃酸等［4］、雙氫青蒿素包含物［5］對(duì)陰道毛滴蟲在體外均有殺滅作用。從傳統(tǒng)中藥中選擇安全、有效、低毒的抗陰道毛滴蟲新藥是一個(gè)行之有效的途徑。為此，我們采用MTT法測(cè)定補(bǔ)骨脂素和魚腥草素鈉在體外對(duì)陰道毛滴蟲的殺滅作用。

1 材料與方法

1.1 試劑 補(bǔ)骨脂素 (Psoralen)，批號(hào)：110739-200814；魚腥草素鈉 (Sodium Hout tuyfonate)，批號(hào)：100247-199601；甲硝唑，批號(hào)：100191-200305，以上試劑均購自中國(guó)藥品生物制品檢定所。噻唑藍(lán)(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)，購自北京市欣經(jīng)科生物技術(shù)有限公司，進(jìn)口分裝。

1.2 蟲株 陰道毛滴蟲蟲株取自北京市順義區(qū)醫(yī)院門診已確診為滴蟲性陰道炎患者陰道后穹窿分泌物，實(shí)驗(yàn)室分離培養(yǎng)的陰道毛滴蟲，接種于無菌肝浸湯培養(yǎng)基中，同時(shí)加入青霉素和鏈霉素抗菌，置37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48～72小時(shí)后轉(zhuǎn)種傳代，穩(wěn)定培養(yǎng)3代后用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 儀器 TCQ-250超聲清洗儀(蘇州比能信電氣有限公司)，WD-2102A型酶標(biāo)儀(北京市六一儀器廠)，血球計(jì)數(shù)板(上海市求精生化試劑儀器有限公司)，CX31型生物顯微鏡(日本奧林巴斯株式會(huì)社)，48孔細(xì)胞培養(yǎng)板 (Becton Dickinson Labware，公司)，96孔酶標(biāo)板(上海榮泰生化工程有限公司)。

1.4 方法

1.4.1 肝浸湯培養(yǎng)基制備 取新鮮兔肝30 g，切碎成米粒大小，加入蒸餾水200mL混勻，放置于4℃冰箱中24小時(shí)，取出后煮沸30分鐘，用8層紗布過濾后定容，失去的水分用蒸餾水補(bǔ)足。加入蛋白胨5 g、葡萄糖1.25 g，充分混勻后加熱促溶，經(jīng)濾紙過濾，調(diào)節(jié)pH值5.6～6.0，分裝試管，每管分裝4mL，高壓蒸汽滅菌(113℃、20分鐘)，冷卻后放置37℃恒溫培養(yǎng)箱中24小時(shí)，證明無菌后儲(chǔ)存于-20℃冰箱，備用。接種前取出培養(yǎng)基放置室溫融化，用前每管加1mL滅能無菌小牛血清和青霉素、鏈霉素。

1.4.2 蟲株的培養(yǎng) 取穩(wěn)定培養(yǎng)3代后的陰道毛滴蟲，2 000 r/min離心5分鐘后棄上清，用新鮮滅菌肝浸湯培養(yǎng)基洗滌2～3次棄上清，再加入含20%滅能無菌小牛血清的肝浸湯培養(yǎng)基混勻，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)蟲體密度，調(diào)整蟲體密度為3×105個(gè)/mL濃度，活蟲率大于90%的可用。

1.4.3 試劑配制 3種試劑均用含血清和雙抗的培養(yǎng)基配置。先配置成一定濃度，在用連續(xù)倍比稀釋法稀釋成所用濃度。甲硝唑的5個(gè)濃度為1、0.5、0.25、0.125、0.0625(單位為 mg/mL)。補(bǔ)骨脂素的五個(gè)濃度為 8、4、2、1、0.5(單位為 mg/mL)。魚腥草素納的 5個(gè)濃度 1、0.5、0.25、0.125、0.0625(單位為mg/mL)。超聲助溶，備用。

1.4.4 加樣 實(shí)驗(yàn)組：于48孔細(xì)胞培養(yǎng)板上分別加入以上試劑的不同濃度各0.6mL。對(duì)照組：加入培養(yǎng)基0.6mL/孔。以上各孔設(shè)3個(gè)平行孔。每孔均加入蟲液0.6mL/孔，輕輕搖勻。不加蟲液和藥物的無菌培養(yǎng)基1.2mL為空白對(duì)照。將培養(yǎng)板置37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.4.5 檢測(cè) MTT法測(cè)各管吸光度(A)值。在培養(yǎng) 2、4、8、16、24小時(shí)后將細(xì)胞培養(yǎng)板從培養(yǎng)箱中取出，將各孔混勻后分別吸出200μL，加入EP管中，加MTT 20μL/EP管，37℃繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)后，2 000 r/min離心5分鐘，棄上清液，用無菌生理鹽水洗滌2～3次，2 000 r/min離心5分鐘，棄上清液，加入二甲基亞砜(DMSO)0.2mL/EP管，室溫放置5分鐘，將EP管中的液體移入96孔酶標(biāo)板，用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度。以空白孔調(diào)零，主波長(zhǎng)為492 nm，測(cè)定各孔吸光度A值。本實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，3次實(shí)驗(yàn)結(jié)果反應(yīng)的規(guī)律基本一致。

1.5 計(jì)算 根據(jù)下列公式計(jì)算出陰道毛滴蟲死亡率，見表1。

注：A對(duì)照孔對(duì)照孔吸光度均值；A實(shí)驗(yàn)孔實(shí)驗(yàn)孔吸光度均值

表1 各種藥物不同濃度不同作用時(shí)間陰道毛滴蟲死亡率

2 結(jié)果

2.1 補(bǔ)骨脂素和魚腥草素鈉體外殺滅陰道毛滴蟲的效果 補(bǔ)骨脂素和魚腥草素鈉在相同藥物濃度下，隨著藥物作用時(shí)間的延長(zhǎng)，滴蟲死亡率逐漸升高(P＜0.05)；補(bǔ)骨脂素、魚腥草素鈉在不同濃度下，陰道毛滴蟲死亡率不同(P＜0.05)；不同作用時(shí)間陰道毛滴蟲死亡率不同(P＜0.05)。

2.2 甲硝唑與魚腥草素鈉殺滅陰道毛滴蟲效果比較 在藥物濃度分別為 1、0.5、0.25、0.125、0.0625mg/mL時(shí)，對(duì)甲硝唑與魚腥草素鈉的作用結(jié)果進(jìn)行比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

3 討論

中藥補(bǔ)骨脂為豆科植物補(bǔ)骨脂Psoralea coryl i-foliaL.的干燥成熟果實(shí)，始載于《雷公炮炙論》具有補(bǔ)腎助陽、納氣、止瀉的功效［6］。補(bǔ)骨脂具有抗腫瘤作用、雌激素樣作用和對(duì)骨質(zhì)的作用、光敏性、抗氧化作用、抗菌作用、保肝作用、抗抑郁等作用［7］。補(bǔ)骨脂中的化學(xué)成分主要有香豆類、黃酮和萜酚類化合物。補(bǔ)骨脂素(Psoralen)屬于香豆類的化學(xué)成分。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)補(bǔ)骨脂素具有抗陰道毛滴蟲作用，這與文獻(xiàn)補(bǔ)骨脂藥理作用與臨床應(yīng)用研究進(jìn)展［8］報(bào)道一致。魚腥草為三白草科蕺菜屬植物蕺菜的新鮮全草或干燥地上部分，廣泛分布于我國(guó)南方各省區(qū)，為重要傳統(tǒng)的食藥兩用植物。魚腥草味辛，性微寒，歸肺經(jīng)，始載于《名醫(yī)別錄》［9］現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，魚腥草具有抗病毒、抗菌、抗炎鎮(zhèn)痛、止咳及增強(qiáng)特異性和非特異性免疫的功能［10］。魚腥草素鈉(Sodium Hout tuyfonate)屬魚腥草提取物。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)魚腥草素鈉具有抗陰道毛滴蟲作用。實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果將為高效低毒抗陰道毛滴蟲新藥物的研發(fā)提供依據(jù)。

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