溫腎活血化濕方對(duì)腎間質(zhì)纖維化大鼠腎組織TGF-β1、sm ad7蛋白表達(dá)的影響*

李建省，王寶蕊

甘肅省中醫(yī)院，甘肅 蘭州730050

腎間質(zhì)纖維化（RIF）是幾乎所有慢性腎臟疾病發(fā)展至終末期腎臟病的最后共同通路。RIF主要病理改變?yōu)榇罅砍衫w維細(xì)胞及肌成纖維細(xì)胞增生，細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生和堆積導(dǎo)致腎小管間質(zhì)纖維化、腎小球硬化，最終導(dǎo)致腎功能衰竭。目前，針對(duì)腎間質(zhì)纖維主要采取抑制或清除促纖維化因子方法，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（TGF-β）是腎間質(zhì)纖維化發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵因子。目前所知smads蛋白是TGF-β受體唯一的胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)，TGF-β/smad信號(hào)傳導(dǎo)通路是RIF主要的最終共同通路。因此，阻斷腎間質(zhì)纖維化某些關(guān)節(jié)環(huán)節(jié)，可能阻止腎纖維化的發(fā)生、發(fā)展從而達(dá)到治療慢性腎臟病治療目的。在前期的臨床研究中我們發(fā)現(xiàn)溫腎活血化濕方具有改善腎功能，降低尿蛋白，延緩慢性腎功能衰竭的功效。本研究利用UUO法復(fù)制腎間質(zhì)纖維化大鼠模型，觀察溫腎活血化濕方對(duì)其腎組織結(jié)構(gòu)及 TGF-β1，smad7蛋白表達(dá)的影響，初步探討其對(duì)該模型大鼠腎組織TGF-β/smad信號(hào)傳導(dǎo)通路的影響及其防治腎間質(zhì)纖維化的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥物及試劑 氯沙坦（杭州默沙東公司生產(chǎn)，國(guó)藥準(zhǔn)字：J20B0148）。TGF-β1，smad7(兔抗大鼠多克隆抗體)、免疫組化二抗及DAB試劑盒（武漢博士德）。溫腎活血化濕方（藥物組成：黃芪30 g，川芎10 g，續(xù)斷10g，牛膝10g，菟絲子30g，桂枝30g，白豆蔻10 g）。

1.2 動(dòng)物分組及給藥 清潔級(jí)3～4周齡雄性SD大鼠120只，體質(zhì)量180～210 g，蘭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供，醫(yī)學(xué)動(dòng)物合格證號(hào) SCXK（甘）2009-0004，參照文獻(xiàn)[1]方法采用單側(cè)輸尿管結(jié)扎手術(shù)(UUO法)建立腎間質(zhì)纖維化大鼠模型，隨機(jī)分為假手術(shù)組、UUO組、溫腎活血化濕方組、氯沙坦組，每組20只。以5%水合氯醛腹腔注射麻醉，從右側(cè)旁正中切口剪開(kāi)腹壁，暴露右側(cè)輸尿管，結(jié)扎右側(cè)輸尿管，關(guān)閉腹腔。假手術(shù)組只分離但不結(jié)扎輸尿管。術(shù)后第2天給藥，假手術(shù)組、UUO組給予相應(yīng)生理鹽水，氯沙坦組灌胃給予氯沙坦（10mg·kg-1·d-1）混懸液，溫腎活血化濕方組給予溫腎活血化濕方（我院制劑室經(jīng)水煮提取，含生藥2 g/mL，按換算系數(shù)換算成大鼠灌胃給藥）水煎液(9.8 g·kg-1·d-1)。術(shù)后第 7、14、21天每組處死10只大鼠，切除右腎，腎組織部分行甲醛固定、脫水后包埋備用，其余液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定尿蛋白定量 第7、14、21天分別用代謝籠收集大鼠24小時(shí)尿液，用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定24小時(shí)尿總蛋白定量。

1.3.2 腎組織病理檢測(cè) 取右側(cè)腎組織切片，進(jìn)行蘇木素-伊紅（HE）、Masson染色，在光鏡下觀察腎臟組織形態(tài)結(jié)構(gòu)變化情況

1.3.3 腎組織TGF-β1、smad7蛋白表達(dá) 按照兩步法免疫組化檢測(cè)試劑盒(HRP-多聚體抗兔)操作步驟進(jìn)行，PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，DAB顯色，蘇木素輕度復(fù)染，光鏡下觀察腎組織TGF-β1、smad7蛋白的表達(dá)。光鏡下細(xì)胞核、細(xì)胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性信號(hào)。采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件半定量分析免疫組化圖片。根據(jù)累計(jì)吸光度（A）與面積之比值，選取10個(gè)不重疊視野，計(jì)算單位面積陽(yáng)性染色區(qū)域的平均A進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用(χ±s)表示，采用t檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 24小時(shí)尿總蛋白定量 與模型組相比較，造模后第14天溫腎活血化濕方尿蛋白定量明顯降低（P＜0.05）,第21天溫腎活血化濕方與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表 1。

表1 各組大鼠24小時(shí)尿總蛋白定量(χ±s)mg/24h

2.2 大鼠腎組織TGF-β1蛋白表達(dá) 與模型組比較，假手術(shù)組大鼠在第7、14、21天腎小管上皮細(xì)胞胞漿中TGF-β1蛋白表達(dá)增多（P＜0.05），溫腎活血化濕方組、纈沙坦組與模型組相比較TGF-β1蛋白表達(dá)明顯降低（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

2.3 大鼠腎組織smad7蛋白表達(dá) 與模型組比較，假手術(shù)組大鼠在第7、14、21天腎組織smad7蛋白表達(dá)升高（P＜0.05），溫腎活血化濕方組、氯沙坦組與模型組相比較smad7蛋白表達(dá)明顯增加（P＜0.05）。見(jiàn)表3。

表2 各組大鼠腎組織TGF-β1蛋白表達(dá)的比較(χ±s)

表3 各組大鼠腎組織smad7蛋白表達(dá)的比較(χ±s)

3 討論

腎間質(zhì)纖維化是慢性腎臟病最終的共同通路。TGF-β1誘導(dǎo)肌成纖維細(xì)胞激活并導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)生成，進(jìn)而導(dǎo)致腎纖維化和腎小管萎縮[2]。因此，抑制TGF-β1誘導(dǎo)的肌成纖維細(xì)胞活化是抑制腎間質(zhì)纖維化的治療策略。目前，腎間質(zhì)纖維化動(dòng)物模型有UUO、5/6腎切除(subtotal nephrectomy，STNx)、環(huán)孢素A腎病等多種模型。UUO模型是研究腎小管間質(zhì)纖維化公認(rèn)的模型。輸尿管結(jié)扎導(dǎo)致腎間質(zhì)纖維化，引起腎臟彌漫性損害[3-4]。

腎間質(zhì)纖維化屬于中醫(yī)學(xué)“關(guān)格”“溺毒”“水腫”“虛損”等范疇。劉玉寧認(rèn)為“虛、痰（濁）、瘀、毒”是導(dǎo)致腎間質(zhì)纖維化發(fā)生、發(fā)展之關(guān)鍵。樊均明以“腎痿”立論。王獻(xiàn)耀教授提出“腎絡(luò)微型癥瘕”是腎纖維化的中醫(yī)病機(jī)[5]。益氣活血化濁、補(bǔ)腎活血、溫陽(yáng)法為其治療大法[6]。我們認(rèn)為虛、瘀、痰濕是導(dǎo)致慢性腎臟病腎間質(zhì)纖維化發(fā)生、發(fā)展之關(guān)鍵。腎虛為本，痰（濁）、瘀為標(biāo)，毒是加重腎間質(zhì)纖維化不可忽視的方面。在慢性腎臟病4～5期，以脾腎陽(yáng)虛為主，我們認(rèn)為腎陽(yáng)虛腎絡(luò)瘀阻為腎間質(zhì)纖維化主要病機(jī)，因此我們用溫腎活血化濕法治療慢性腎臟病臨床效果滿意。溫腎活血化濕方由黃芪、川芎、紅花、續(xù)斷、牛膝、菟絲子、淫羊藿、桂枝、干姜、白豆蔻、白芷組成，具有溫腎活血，健脾化濕之功效，為治療慢性腎臟病有效方劑。已有研究證實(shí)，黃芪、川芎能調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫及體液免疫，降低尿蛋白，保護(hù)腎功能。通過(guò)下調(diào)TGF-β表達(dá)，抑制腎小管轉(zhuǎn)分化、下調(diào)ECM的主要成分、下調(diào)CTGF表達(dá)等多途徑多靶點(diǎn)抑制腎小管上皮細(xì)胞增殖，抑制腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，改善腎間質(zhì)纖維化[7]。補(bǔ)腎益氣法能抑制成纖維細(xì)胞過(guò)度活化，促進(jìn)其凋亡[8]。補(bǔ)腎活血中藥可以加速細(xì)胞外基質(zhì)降解，減少細(xì)胞外基質(zhì)積聚，從而防治腎小球硬化[9]。益氣活血方通過(guò)下調(diào)TGF-β、上調(diào)smad7的表達(dá)來(lái)遏制腎纖維化的進(jìn)展[10]。

本研究結(jié)果表明，溫腎活血化濕方具有降低模型大鼠尿蛋白作用，通過(guò)減少TGF-β1表達(dá)，上調(diào)smad7蛋白表達(dá)，減輕腎間質(zhì)纖維化，為進(jìn)一步研究該治法及其方藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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