過氧化物酶增殖體激活受體γ通過上調(diào)miR-124表達抑制急性肺損傷肺泡巨噬細胞炎癥反應

王易林　胡明冬

過氧化物酶增殖體激活受體γ通過上調(diào)miR-124表達抑制急性肺損傷肺泡巨噬細胞炎癥反應

王易林1胡明冬2

全軍青年培育基金項目(13QNP114)

作者單位： 400235 重慶，重慶三峽中心醫(yī)院胸外科1

400037 重慶，第三軍醫(yī)大學新橋醫(yī)院呼吸內(nèi)科2

急性肺損傷(acute lung injury, ALI)/急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome, ARDS)是常見的、發(fā)病率高、病死率高的肺部疾病，其本質是全身炎癥失控所致[1]，如何有效減少致炎物質的釋放，是防治ALI/ARDS的發(fā)生發(fā)展的重要策略。核受體超家族成員之一的過氧化物酶增殖體激活受體γ (peroxisome proliferators activated receptor γ, PPARγ) 是配體激活的轉錄因子，具有重要的抗炎作用，在ALI/ARDS過程中具有保護作用，但其具體機制尚需進一步闡明[2-3]。微小RNA(microRNA, miRNA)是一類普遍存在于真核生物細胞中的內(nèi)源性高度保守性的單鏈、非編碼小分子RNA。研究發(fā)現(xiàn)，多種miRNA與ALI相關，包括miR-146、miR-155、miR-200、miR-21、miR-16、miR-130、miR-124等[4-8]。這些miRNA通過作用于炎癥相關通路的靶基因密切參與ALI，成為ALI治療的新靶點。研究發(fā)現(xiàn)，miR-124是一個重要的炎癥相關miRNA，miR-124可抑制TLR通路中TNF受體相關因子6( TNF receptor associated factor 6, TRAF6)和IL-1受體相關激酶1(IL-1 receptor-associated kinase 1, IRAK1)，抑制下游核因子-κB(nuclear factor-κB, NF-κB)的活化，發(fā)揮抗炎作用[9-11]。鑒于PPARγ和miR-124均與ALI密切相互，抑制炎癥反應，那么作為轉錄因子的PPARγ有可能通過上調(diào)miR-124進一步發(fā)揮抗炎作用，密切參與ALI的防治?；谝陨戏治觯狙芯坎捎萌薃LI肺泡巨噬細胞探討PPARγ通過上調(diào)miR-124抑制肺泡巨噬細胞炎癥反應的分子機制，及該通路對小鼠ALI的保護作用，為進一步闡明PPARγ和miR-124對ALI的保護作用，并為PPARγ和miR-124成為ALI防治的新靶標提供實驗依據(jù)。

材料與方法

一、試驗材料

實驗動物artmentSPF級C57BL/6小鼠，5～7周齡，體質量約18～22 g，購于第三軍醫(yī)大學動物中心。PPARγ 激動劑羅格列酮( Rosiglitazone, RGZ) ，PPARγ拮抗劑GW9662購自Cayman Chemical 公司；脂多糖(LPS)購自美國 Sigma 公司；real time RT-PCR檢測試劑盒購自美國Promega公司；miRNA 檢測試劑盒購自美國GeneCopeia公司；PPARγ siRNA、antagomir-124由上海吉瑪制藥公司合成。RNA提取試劑購、M-MLV逆轉錄酶購自美國Invtrogen公司。報告基因檢測試劑購自美國Promega公司；PCR引物由上海生工公司合成。

二、試驗方法

1. 人肺泡巨噬細胞分離培養(yǎng)與處理：10例ALI和10例健康非吸煙者經(jīng)支氣管肺泡灌洗術，獲得肺泡灌洗液，經(jīng)4 ℃ 1 000×g 離心10 min后，去除清液，PBS重懸細胞、再離心、洗滌2次，細胞再用無血清RPMI 1640 培養(yǎng)液制成細胞懸液，于培養(yǎng)皿中，置于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱孵育貼壁2 h，除去未黏附細胞，黏附生長在培養(yǎng)皿壁的細胞即為肺泡巨噬細胞。人肺泡巨噬細胞用含有10%FBS，100 U/ml 青霉素100 μg/ml鏈霉素的RPMI1640 液4 ml 重懸，置孵箱37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h，然后按培養(yǎng)基體積加入相應體積 LPS 溶液，終濃度為1 μg/ml，30 min后加入PPARγ 激動劑羅格列酮，終濃度為2 μM，陰性對照為 DMSO(0.1%)，24 h 后終止實驗，檢測肺泡巨噬細胞中miR-124、TRAF6的表達。

2. Real time PCR：采用Invitrogen 公司RNA提取試劑TRizol，根據(jù)試劑說明方法，提取人肺泡巨噬細胞和小鼠肺組織的總RNA。采用Invitrogen公司的M-MLV逆轉錄酶，按照試劑說明將1μg的總RNA逆轉錄合成cDNA。然后以 cDNA 為模板，根據(jù)試劑說明，采用Promega 公司GoTaq? qPCR Master Mix試劑盒，進行實時熒光定量 PCR實驗，檢測人PPARγ、TRAF6和小鼠TRAF6、IL-6、TNF-α mRNA的表達。引物如下：hPPARγ F: 5′-CTCGAGGACACCGGAGAGG-3′，R: 5′-AGGAGTGG

GAGTGGTCTTCC-3′; hTRAF6: F: 5′-TATGACAGC

CACCTCCCTTG-3′，R: 5′-GGCATCCATTATCTCTTC

GTG-3′; hIL-6 F: 5′- CAATGAGGAGACTTGCCTGG-3′，R: 5′-GGCATTTGTGGTTGGGTCAG-3′; hTNF-α F: 5′-TCTGGGCAGGTCTACTTTGG -3′，R: 5′- GGTT

GAGGGTGTCTGAAGGA -3′；mTRAF6 F: 5′-CCCAA

CAGCTCCAATCCCTT-3′，R: 5′-CTGGGCCAACAGTC

TCATGT-3′; mIL-6 F: 5′-AGTTGCCTTCTTGGGACT

GA-3′，R: 5′-TCCACGATTTCCCAGAGAAC -3′；mTNF-α F: 5′-CAAACCACCAAGTGGAGGAG-3′，R: 5′- GTGGGTGAGGAGCACGTAGT-3′，內(nèi)參照β-引物序列如下： hβ-actin F: 5′-GTGAAGGTGACAGCAGT

CGGTT-3′，R: 5′- GAAGTGGGGTGGTTTTAGGA-3′; mβ-actin F: 5′-TGTTACCAACTGGGACGACA-3′，R: 5′- GGGGTGTTGAAGGTCTCAAA-3′。

3. miRNA的檢測：采用ABI公司的小RNA提取試劑盒，根據(jù)試劑說明，提取小RNA。然后采用美國GeneCopeia公司的All-in-OneTMmiRNA qRT-PCR Detection Kit，根據(jù)試劑說明，實時熒光定量 PCR檢測miR-124的表達，引物如下：has-miR-124 F: 5′- CGTGTTCACAGCGGACCTTGAT-3′; mmu-miR-124 F: 5′-CGTGTTCACAGCGGACCTTG AT-3′，下游通用引物由試劑盒提供。U6 snRNA 作為內(nèi)參照，hU6：F: 5′-CGCTTCGGCAGCACATATACTAA-3′，R：5′-TATGGAACGCTTCACGAATTTGC-3′； mU6：F: 5′- TCCAAAGGTTCTTCTTTACTGCCA -3′，R：5′- CAGGCCAGGCTGACATGAA -3′。

4.熒光素報告質粒的構建，細胞轉染及報告基因檢測：提取THP-1細胞的基因組DNA，以基因組DNA為模板PCR擴增has-miR-124基因的啟動子區(qū)，并連接至報告基因質粒pGL3-Basic上，重組質粒命名為pGL3/ miR-124-pro。常規(guī)培養(yǎng)THP-1細胞至對數(shù)生長期，于轉染前一天以一定密度(約 1×105個細胞/孔)接種于 24 孔板，以不含有抗生素的培養(yǎng)基培養(yǎng)繼續(xù)培養(yǎng) 12～16 h 后，采用TurboFect轉染試劑(美國Fermentas公司)，根據(jù)試劑說明將pGL/ pro-miR-124報告質粒和海腎報告基因質粒p-TK(內(nèi)參)共轉染THP-1細胞，6 h后再經(jīng)PPARγ激動劑羅格列酮(終濃度為2 μM)處理細胞，DMSO(0.1%) 作為對照，，24 h后收集細胞，采用Promega公司Dual-Luciferase? Reporter Assay System試劑盒，根據(jù)說明于 GloMaxTM20/20 發(fā)光檢測儀上檢測蟲熒光和海腎熒光強弱，以蟲熒光和海腎熒光的比值進行統(tǒng)計學分析。每組3復孔，3次獨立重復實驗。

5.PPARγ 激動劑羅格列酮通過上調(diào)miR-124對 LPS 所誘導小鼠ALI的保護作用：體質量約為 18～22 g 的 SPF 級 C57BL/6小鼠，隨機分為4組，每組6只：①正常對照組：小鼠進行尾靜脈注射生理鹽水+DMSO；②LPS處理組：小鼠尾靜脈注射 LPS(10 mg/kg)；③激動劑RGZ處理組：小鼠尾靜脈注射 LPS(10 mg/kg)，30 min 后注射 PPARγ 激動羅格列酮(3 mg/kg)；④antagomir-124處理組：小鼠尾靜脈注射antagomir-124 NC 、antagomir-124(50 mg/kg)，一周后小鼠尾靜脈注射 LPS(10 mg/kg)，30min 后注射 PPARγ 激動羅格列酮(3 mg/kg)；24 h后，各組小鼠采用 1.5%戊巴比妥鈉腹腔注射施行麻醉，取肺組織，檢測肺組織中miR-124、IL-6、TNF-α的表達。

三、統(tǒng)計學方法

結果

一、人ALI肺泡巨噬細胞中PPARγ、miR-124及其靶基因TRAF6的表達

經(jīng)支氣管肺泡灌洗術獲取10例ALI和10例健康非吸煙者肺泡巨噬細胞，提取總RNA，并進行real time RT-PCR檢測PPARγ、miR-124及其靶基因TRAF6的表達結果，見圖1。ALI患者肺泡巨噬細胞中PPARγ與miR-124的表達均降低，而miR-124靶基因TRAF6表達顯著升高，這提示PPARγ、miR-124及其靶基因TRAF6可能存在一定表達調(diào)控關系。

二、活化的PPARγ上調(diào)miR-124，并下調(diào)miR-124靶基因TRAF6的表達

采用real time RT-PCR檢測人肺泡巨噬細胞中PPARγ對miR-124及其靶基因TRAF6表達的影響。如圖2A所示，相對于對照(DMSO)組，PPARγ激動劑羅格列酮(RGZ)顯著上調(diào)miR-124的表達，同時抑制miR-124靶基因TRAF6的表達。為了進一步證明 PPARγ 對 miR-124表達的影響，人肺泡巨噬細胞轉染miR-124抑制劑(antagomir-124)及其對照(antagomir-124 negative control, NC)抑制miR-124的功能，再經(jīng)PPARγ激動劑羅格列酮處理后，采用real time RT-PCR檢測miR-124靶基因TRAF6的表達，結果顯示相對于對照組，antagomir-124處理組，TRAF6的表達得以回復(圖2B)。此外，人肺泡巨噬細胞轉入PPARγ siRNA基因沉默PPARγ，再經(jīng)PPARγ激動劑羅格列酮處理，real time RT-PCR檢測miR-124、TRAF6的表達，結果顯示相對于對照組，PPARγ siRNA 組中miR-124表達降低，而其靶基因TRAF6表達增強(圖2C)。以上結果提示，PPARγ可能在轉錄水平上促進miR-124的表達，進而抑制炎癥相關因子TRAF6的表達。

三、活化的PPARγ促進miR-124啟動子的轉錄活性

為了進一步證實PPARγ可能在轉錄水平上促進miR-124的表達，我們構建了含miR-124啟動子區(qū)的蟲熒光素酶(Luc)報告基因質粒，并轉染人單核細胞THP-1，再經(jīng)PPARγ激動劑RGZ或拮抗劑GW9662處理，經(jīng)Luc報告基因活性檢測顯示，活化的PPARγ顯著促進miR-124啟動子活性。而PPARγ拮抗劑GW9662組，明顯減弱PPARγ激動劑羅格列酮對miR-124啟動子的轉錄活性的上調(diào)作用(圖3)。以上結果顯示，活化的PPARγ可通過促進miR-124啟動子的轉錄活性而上調(diào)miR-124的表達。

注：A：PPARγ表達；B：miR-124表達；C：PPARγ表達

圖2　人肺泡巨噬細胞中PPARγ激動劑上調(diào)miR-124，并下調(diào)TRAF6的表達(**P<0.01)

圖3　PPARγ促進miR-124啟動子的轉錄活性(**P<0.01)

四、PPARγ通過上調(diào)miR-124抑制 LPS 誘導的小鼠ALI的炎癥反應

LPS誘導的小鼠ALI，經(jīng)PPARγ 激動劑RGZ處理小鼠，檢測小鼠肺組織中miR-124、炎癥相關因子TRAF6、IL-6、TNF-α的表達。結果顯示，相對于對照組，激動劑RGZ組中，肺組織中miR-124表達上調(diào)，TRAF6、IL-6、TNF-α的表達顯著降低(圖4A)，而antagomir-124預處理組，肺組織TRAF6、IL-6、TNF-α的表達升高(圖4B)。以上結果提示，PPARγ通過上調(diào)miR-124對LPS 誘導的小鼠ALI具有保護作用。

圖4　PPARγ通過上調(diào)miR-124抑制 LPS 誘導的小鼠

討論

ALI /ARDS 是機體膿毒癥、外傷、感染等一系列刺激因素而引發(fā)的一種復雜的呼吸系統(tǒng)疾病。肺內(nèi)炎癥細胞(肺泡巨噬細胞、中性粒細胞) 為主導的肺內(nèi)炎癥反應失控導致嚴重的低氧血癥、彌漫性肺細胞損傷和肺水腫，體內(nèi)一系列基因表達調(diào)控的失調(diào)最終導致ALI/ARDS的發(fā)生。目前尚缺乏有效的臨床治療手段，因此進一步探討其病理過程中基因表達調(diào)控機制無疑對ALI /ARDS的防治具有有重要的理論意義和臨床價值。

miRNA廣泛存在于真核生物中，通過與靶mRNA的3′-UTR結合，降解靶mRNA 或抑制靶mRNA 轉錄后翻譯，從而調(diào)節(jié)基因表達。miRNA在生命活動中具有十分廣泛的調(diào)節(jié)功能，與多種疾病密切相關，包括腫瘤、炎癥、心血管疾病、代謝疾病等[12-15]。miRNA主要通過與這些疾病密切相關的基因中的3′-UTR結合后，抑制靶基因的表達，進而影響疾病的發(fā)生與發(fā)展。研究發(fā)現(xiàn)，目前有多種miRNA與通過影響炎癥通路在內(nèi)的重要基因而與炎癥密切相關，包括miR-146、miR-181、miR-223、miR-155、miR-124、miR-214、miR-21等。其中miR-124可通過抑制NF-κB，JAK-STAT3通路中的TRAF6、IRAK1、ILR6抑制下游NF-κB、STAT3的活化，發(fā)揮抗炎作用。本研究在人ALI患者的肺泡巨噬細胞中發(fā)現(xiàn)miR-124的表達顯著降低，這提示有效上調(diào)miR-124可能有利于治療ALI /ARDS。

重要的抗炎核受體PPARγ經(jīng)配體(TGZ、RGZ、PGZ、L-764406、GW0072、GW1929、BRL49653等)激活后，RXR或GR結合形成異二聚體，結合于靶基因啟動子區(qū)的PPAR反應元件(peroxisome proliferator responsive element, PPRE)調(diào)控基因的轉錄。其通過競爭抑制炎癥信號通路或上調(diào)抗炎因子的表達發(fā)揮抗炎作用[16-17]。而在ALI中PPARγ是否通過上調(diào)抗炎miR-124發(fā)揮抗炎作用，尚不明確，本研究用PPARγ激動處理人肺泡巨噬細胞發(fā)現(xiàn)，miR-124的表達顯著升高，其靶基因TRAF6的表達顯著降低。進一步的研究發(fā)現(xiàn)，PPARγ可促進miR-124啟動子的轉錄活性，這提示PPARγ可通過轉錄水平上調(diào)miR-124的表達，但PPARγ是否直接還是間接作用miR-124啟動子還需要進一步實驗證明。已有研究發(fā)現(xiàn)，PPARγ對通過直接抑制炎癥因子進而對LPS誘導的ALI小鼠具有保護作用，那么是否是通過調(diào)節(jié)抑炎miRNA 的間接機制而起效應，尚未見報道。本研究發(fā)現(xiàn)，在LPS誘導的ALI小鼠模型中，活化的PPARγ可通過上調(diào)miR-124抑制小鼠的炎癥反應，但其具體分子機制尚需深入研究。

基于以上分析，本研究通過對ALI患者的肺泡巨噬細胞中PPARγ、miR-124及其靶基因TRAF6的表達變化發(fā)現(xiàn)，PPARγ可能通過調(diào)節(jié)miR-124的表達而發(fā)揮對ALI的保護作用；進一步PPARγ激動劑對原代人肺泡巨噬細胞的處理后發(fā)現(xiàn)，激動劑活化的PPARγ可以上調(diào)miR-124的表達，并下調(diào)其靶因TRAF6的表達，而這一上調(diào)作用依賴于在轉錄水平上促進miR-124的啟動子活性；此外，我們也在LPS誘導的ALI小鼠模型上驗證了PPARγ/miR-124通路的抗炎作用。

綜上所述，本研究在人ALI肺泡巨噬細胞中探討PPARγ通過上調(diào)miR-124抑制肺泡巨噬細胞炎癥反應的分子機制，及該通路對小鼠ALI的保護作用，為進一步深入闡明PPARγ和miR-124對ALI保護作用提供了新的實驗依據(jù)，從而使得PPARγ和miR-124有望成為ALI防治的新靶標。

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(本文編輯：黃紅稷)

王易林，胡明冬. 過氧化物酶增殖體激活受體γ通過上調(diào)miR-124表達抑制急性肺損傷肺泡巨噬細胞炎癥反應[J/CD]. 中華肺部疾病雜志： 電子版， 2015， 8(2)： 160-165.

·論著·

【摘要】目的探討PPARγ上調(diào)miR-124表達對急性肺損傷(ALI)肺泡巨噬細胞炎癥反應的抑制作用及分子機制。方法分離和培養(yǎng)10例ALI和10例健康非吸煙者的肺泡巨噬細胞，檢測PPARγ、miR-124及其靶基因TRAF6的表達變化；分別用PPARγ 激動劑羅格列酮(RGZ)、PPARγ 拮抗劑GW9662或miR-124抑制劑(antagomir-124)干預人肺泡巨噬細胞后，real time RT-PCR檢測miR-124及其靶基因TRAF6的表達；人單核細胞THP-1細胞轉染含miR-124啟動子區(qū)的蟲熒光素酶報告基因質粒，再經(jīng)PPARγ激動劑RGZ或拮抗劑GW9662處理，檢測報告基因活性；小鼠經(jīng)LPS刺激后再經(jīng)PPARγ 激動劑RGZ處理，或經(jīng)antagomir-124預處理后，再經(jīng)PPARγ 激動劑RGZ處理后，real time RT-PCR檢測小鼠肺組織中miR-124、炎癥相關因子TRAF6、IL-6、TNF-α的表達。結果ALI患者肺泡巨噬細胞中PPARγ與miR-124的表達均降低，而miR-124靶基因TRAF6表達顯著升高；激動劑活化的PPARγ能上調(diào)人肺泡巨噬細胞的miR-124，并下調(diào)miR-124靶基因TRAF6，而PPARγ拮抗劑GW9662可削弱羅格列酮上調(diào)miR-124的表達進而減弱miR-124對其靶基因TRAF6表達的抑制作用，并且miR-124抑制劑減弱PPARγ對TRAF6表達的抑制作用；活化的PPARγ顯著促進miR-124啟動子活性，而PPARγ拮抗劑GW9662，明顯減弱PPARγ激動劑羅格列酮對miR-124啟動子的轉錄活性的上調(diào)作用；在LPS 誘導的小鼠ALI模型上，活化的PPARγ通過上調(diào)miR-124抑制小鼠肺組織IL-6、TNF-α的表達，而PPARγ拮抗劑GW9662和antagomir-124預處理均減弱PPARγ對小鼠肺組織IL-6、TNF-α的表達的抑制作用。結論PPARγ激活后可通過上調(diào)miR-124表達抑制ALI肺泡巨噬細胞的炎癥反應。

【關鍵詞】急性肺損傷;肺泡巨噬細胞;增殖激活受體γ，過氧化物酶;微小RNA;炎癥反應

Peroxisome proliferators activated receptor γ protects against acute lung injury alveolar macrophages inflammation by upregulating miR-124 expressionWangYilin1,HuMingdong2.1DepartmentofThoracicSurgery,theThreeGorgesCenterHospital,Chongqing400235,China;2DepartmentofRespiratoryDisease,XinqiaoHospital,ThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing400037,ChinaCorrespondingauthor：HuMingdong,Email:huhanshandd@126.com

【Abstract】ObjectiveTo explore the roles and molecular mechanisms of peroxisome proliferators activated receptor γ(PPARγ) in suppression of acute lung injury(ALI) alveolar macrophages inflammation via miR-124 induction. MethodsHuman alveolar macrophages were collected from 10 cases of ALI and health nonsmokers to detect the expression of PPARγ, miR-124 and TRAF6. Treatment of the PPARγ agonist rosiglitazone (RGZ), antagonist GW9662, or miR-124 inhibitor (antagomir-124) on human alveolar macrophages, the levels of PPARγ, miR-124 and TRAF6 were determined by real time RT-PCR. THP-1 cells were transfected with the miR-124 promoter reporter, and then treated with PPARγ agonist rosiglitazone or antagonist GW9662, the report gene activities were detected. Mice were divided into two groups, one group were treated with LPS, then administered antagonist GW9662, another group were pretreatment of antagomir-124, after LPS intraperitoneal injection, the PPARγ agonist rosiglitazone were administered, the lung tissue were collected and the miR-124, TRAF6, IL-6, TNF-αwere detected using real time RT-PCR. ResultsBoth PPARγ and miR-124 were decreased, but miR-124 target gent TRAF6 increased, in alveolar macrophages in ALI patients contrast to health nonsmokers. Activation of PPARγ upregulated the expression of miR-124 and downregulates its target gene TRAF6. The upregulation of miR-124 was attenuated by PPARγ antagonist GW9662, which weaken inhibition of TRAF6 targeted by miR-124. PPARγ agonist RGZ promoted the miR- 124 promoter activity significantly, but the antagonist GW9662 attenuated miR- 124 promoter activity that induced by RGZ. In mice with ALI induced by LPS, activation of PPARγ can inhibit the expression of IL-6 and TNF-α in lung. However, the expression of IL-6 and TNF-α of lung tissues in ALI mice were enhanced by treatment of antagonist GW9662 and antagomir-124. ConclusionsActivation of PPARγ inhinbits alveolar macrophage inflammatory response by upregulation of miR-124.

【Key words】Acute lung injury;Alveolar macrophages;Peroxisome proliferators activated receptor γ;miRNA;Inflammation response

收稿日期：(2015-02-23)

文獻標識碼：中圖法分類號： R563 A

通訊作者：胡明冬，Email: huhanshandd@aliyun.com

基金項目：國家自然科學基金面上項目(8117006)

DOI：10.3877/cma.j.issn.1674-6902.2015.02.005