虹鱒腸炎紅嘴病病原菌的確定及其生長(zhǎng)特性研究

連浩淼，盧彤巖，劉紅柏，尹家勝，張輝，李紹戊

(1．中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，黑龍江哈爾濱150070;2．東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，黑龍江哈爾濱150030)

虹鱒Oncorhynchus mykiss作為一種珍貴的鮭科魚類，具有肉味鮮美、營(yíng)養(yǎng)豐富、蛋白質(zhì)含量高、生長(zhǎng)迅速等特點(diǎn)，在1959年被引入中國(guó)后逐漸成為主要的冷水魚養(yǎng)殖品種之一。但是在養(yǎng)殖過程中，由于養(yǎng)殖密度增加、水環(huán)境惡化、飼料質(zhì)量不佳和管理不當(dāng)?shù)纫蛩兀琪V細(xì)菌性病害頻發(fā)［1-3］。目前，中國(guó)養(yǎng)殖虹鱒所患細(xì)菌性疾病主要有癤瘡病、弧菌病、爛鰓病、腸炎病等［4］，疾病已經(jīng)嚴(yán)重影響了虹鱒魚類的健康養(yǎng)殖，同時(shí)影響了人類飲食健康。國(guó)內(nèi)外已報(bào)道了嗜水氣單胞桿菌Aeromonas hydrophila［5］、遲鈍愛德華菌 Edwardsiella tarda［6］、弧菌 Vibriosis［7］、約氏黃桿菌 Flavobacterium johnsoniae［8］、殺鮭氣單胞菌殺鮭亞種 Aeromonas salmonicida［9］等幾種虹鱒的致病菌，但中國(guó)還沒有對(duì)虹鱒感染魯氏耶爾森菌Yersini ruckeri的系統(tǒng)性研究報(bào)道。

2013年7月，青海地區(qū)某冷水魚養(yǎng)殖廠虹鱒發(fā)生急性傳染病，造成虹鱒大量死亡。病魚主要癥狀表現(xiàn)為吻端紅腫，體表和腸道出血，肛門紅腫，有紅色囊腫包裹肛門等，此癥狀表現(xiàn)為虹鱒腸炎紅嘴病。本研究中，從發(fā)病虹鱒組織中分離出一種可疑致病菌，并對(duì)其進(jìn)行了病原性確定，在API 20E試劑條及常規(guī)生化鑒定的基礎(chǔ)上，應(yīng)用Bioloy微生物鑒定系統(tǒng)進(jìn)行初步鑒定，并且采用16S rRNA序列測(cè)定系統(tǒng)發(fā)育分析的方法對(duì)該菌進(jìn)行鑒定，并對(duì)該菌的生長(zhǎng)特性以及藥物敏感性進(jìn)行了分析，以期為虹鱒魯氏耶爾森菌的防治提供有效參考。

1 材料與方法

1.1 材料

患病虹鱒采自青海地區(qū)某冷水魚養(yǎng)殖廠，體質(zhì)量為20～50 g。健康虹鱒購(gòu)自牡丹江某冷水魚養(yǎng)殖基地，平均體質(zhì)量為20 g左右。

1.2 方法

1．2．1 常規(guī)生化鑒定及API生化鑒定 在無菌條件下，從患病魚肝臟和脾臟處取樣劃線接種于TSA瓊脂平板上，28℃下倒置培養(yǎng)24 h，挑取單個(gè)優(yōu)勢(shì)菌落在TSA平板上純化培養(yǎng)，獲得純培養(yǎng)菌株，編號(hào)為BH1206。肉眼觀察菌落形態(tài)、大小、顏色，革蘭染色后應(yīng)用光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)菌形態(tài)特征，同時(shí)應(yīng)用API 20E試劑條和常規(guī)生化鑒定管 (杭州天和微生物有限公司)鑒定。

1．2．2 Biolog系統(tǒng)鑒定 供試菌株在TSA培養(yǎng)基上連續(xù)接種2～3次后，劃線接種到BUG培養(yǎng)基上，于28℃下培養(yǎng)24 h，用無菌棉簽蘸生理鹽水濕潤(rùn)后輕輕擦拭培養(yǎng)基上的單菌落，轉(zhuǎn)入無菌稀釋緩沖液中，混勻得到菌懸液，測(cè)定其濁度，控制在濁度標(biāo)準(zhǔn)的±3%以內(nèi)。然后接種培養(yǎng)到96孔板上，置于28℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。分兩次讀數(shù)，在接種到板上4～6 h讀一次，之后16～24 h再讀一次。

1．2．3 人工感染試驗(yàn) 將健康虹鱒置于室內(nèi)水族箱中暫養(yǎng)一周，試驗(yàn)期間水溫為 (14±1)℃，放養(yǎng)密度為30尾/m3。

將優(yōu)勢(shì)菌株BH1206接種于TSA瓊脂平板上，28℃下恒溫培養(yǎng)24 h后，用無菌生理鹽水洗下，并參照麥?zhǔn)媳葷岱▽⒕鷳乙合♂屩?．3×104、1．3×105、1．3 × 106、1．3 × 107、1．3 × 108、1．3 × 109、1．3×1010、1．3×1011CFU/mL。人工感染試驗(yàn)設(shè) 8組，分別記為A、B、C、D、E、F、G、H組。從每組隨機(jī)選取虹鱒10尾，按照0．1 mL/20 g(體質(zhì)量)的劑量，將每尾魚腹腔注射不同濃度的菌液，并且設(shè)立注射等比例生理鹽水的對(duì)照組，分別于12、24、48、72 h后觀察記錄魚的死亡情況及病理癥狀，同時(shí)按改良的寇氏法計(jì)算菌株的半致死量(LD50)。

取具有自然發(fā)病癥狀的人工感染魚，在無菌條件下進(jìn)行細(xì)菌再分離培養(yǎng)，并比較分離到的細(xì)菌和攻毒用菌株的理化特征，若為同種細(xì)菌則說明所分離純化的細(xì)菌為病原菌。

1．2．4 16S rRNA序列測(cè)定及系統(tǒng)發(fā)育分析 將BH1206菌株接種于TSB液體培養(yǎng)基中，28℃下以220 r/min震搖16 h后離心收集菌液，按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說明書提取細(xì)菌DNA并作為PCR模板DNA。利用細(xì)菌16S rRNA通用引物F27:5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'和R1492:5'-GRTACCTTGTTACGACTT-3'對(duì) BH1206菌株 16S rRNA基因進(jìn)行擴(kuò)增［10］。PCR產(chǎn)物由上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。

將BH1206菌株的16S rRNA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中已知的氣單胞菌屬不同種和其他水產(chǎn)常見致病菌16S rRNA的核苷酸序列進(jìn)行比較分析，采用ClustalW軟件進(jìn)行多序列匹配排列 (Multiple A-lignments)，用軟件包 Mega 5．0進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析［11］。用Neighbor-joining法，使用Kimura-2-parameter模型構(gòu)建分子系統(tǒng)樹，抽樣1000次重復(fù)檢測(cè)分子系統(tǒng)樹各分支的置信度。

1．2．5 生長(zhǎng)特性測(cè)定 無菌條件下將BH1206菌株接種于TSB培養(yǎng)基中，28℃下以220 r/min震搖過夜培養(yǎng)，將1 mL菌液接種于50 mL TSB培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定OD600nm值達(dá)到0．556。無菌條件下取擴(kuò)大培養(yǎng)菌液稀釋106倍后的菌液0．1 mL，均勻涂布于 TSA培養(yǎng)基上，于15、20、24、28、30、32、36、40℃下培養(yǎng)14 h觀察計(jì)數(shù);取稀釋后的菌液均勻涂布于pH值分別為 4．0、5．0、6．0、6．5、7．0、7．5、8．0、8．5、9．0、9．5、10．0、11．0 的 TSA 培養(yǎng)基上，以及含鹽量為0%、1%、2%、3%、4%的TSA培養(yǎng)基上，28℃下培養(yǎng)16 h，觀察計(jì)數(shù)。

1．2．6 藥敏試驗(yàn) 采用擴(kuò)散法 (K-B法)進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。將BH1206菌株挑入MH肉湯培養(yǎng)基中，28℃下震蕩培養(yǎng)過夜后將菌液濃度調(diào)至1．0×107CFU/mL，取0．1 mL培養(yǎng)菌液均勻涂布于9 cm MH瓊脂平板上，按4片/平板等距貼上藥敏紙片 (杭州天和微生物有限公司)，測(cè)定分離菌株對(duì)21種常見藥物的敏感程度。將處理好的平板倒置于培養(yǎng)箱中，25℃下培養(yǎng)24 h，測(cè)定其抑菌圈直徑，并根據(jù)CLSI標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行藥敏結(jié)果判定［10］。

2 結(jié)果與分析

2.1 人工感染試驗(yàn)

從患病虹鱒的肝臟和脾臟中分離到一株優(yōu)勢(shì)菌株，編號(hào)為BH1206，通過腹腔注射的方式進(jìn)行人工感染試驗(yàn)。不同菌液濃度下虹鱒的死亡率見表1，隨著菌液濃度的增大，死亡率不斷增大。采用改良后的寇氏法計(jì)算菌株的半致死劑量LD50，結(jié)果表明，以腹腔注射方式對(duì)20 g左右虹鱒的半致死劑量為 6．46×107CFU/mL。

人工感染的患病魚出現(xiàn)病癥與自然發(fā)病癥狀相一致，表現(xiàn)為吻端紅腫出血，體表有出血點(diǎn)，肛門處有紅色囊腫物包裹。解剖病魚發(fā)現(xiàn)，肝部出血，脾腫大，腸壁充血，腸腔有血色液體。

通過鏡鑒未發(fā)現(xiàn)寄生蟲，另外從肝臟和脾臟分離出的細(xì)菌經(jīng)純化培養(yǎng)，通過形態(tài)觀察、理化特征鑒定和16S rRNA序列測(cè)定，發(fā)現(xiàn)與BH1206菌株一致，由此證明，BH1206菌株為虹鱒腸炎紅嘴病的病原菌。

表1 分離菌株對(duì)虹鱒的人工感染試驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Artificial challenge of rainbow trout with BH1206 strain

2.2 BH1206菌株的生長(zhǎng)特性

從溫度、pH和含鹽量3個(gè)方面對(duì)BH1206菌株的生長(zhǎng)特性進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明:該菌在20～40℃范圍內(nèi)能生長(zhǎng)，溫度為28～30℃時(shí)生長(zhǎng)狀態(tài)最佳;在pH為6～10范圍內(nèi)能生長(zhǎng)，在pH為6．5～7．5時(shí)生長(zhǎng)狀態(tài)最佳;在NaCl濃度為3%內(nèi)的培養(yǎng)基中能生長(zhǎng)，并且NaCl含量為0時(shí)生長(zhǎng)狀態(tài)最佳 (圖1)。

2.3 BH1206菌株的形態(tài)及生化特征

BH1206菌株在TSA平板上生長(zhǎng)良好，形成表面光滑、邊緣整齊、稍微隆起的白色菌落，菌落直徑為1．1～1．5 mm。該菌為革蘭陰性短桿菌，采用API 20E試劑條及常規(guī)生化鑒定管鑒定BH1206菌株，其生化特征表現(xiàn)為氧化酶反應(yīng)陰性，為非發(fā)酵型需氧菌，其他生理生化特征見表2。

圖1 BH1206菌株在不同溫度、pH和NaCl濃度下的生長(zhǎng)特性Fig.1 Growth of BH1206 strain at various temperature，pH and salinity

在Biolog系統(tǒng)鑒定過程中，供試菌株BH1206能夠充分利用糊精、D-麥芽糖、D-海藻糖、N-乙酰-D-葡萄糖胺、D-葡萄糖、D-甘露糖、D-果糖、D-半乳糖、肌苷、甘氨酸-L-脯氨酸、L-丙氨酸、D-半乳糖醛酸、D-葡萄糖酸、檸檬酸等多種碳源，且4～6 h和16～24 h的讀數(shù)結(jié)果一致。Biolog系統(tǒng)讀取值顯示，BH1206菌株與魯氏耶爾森菌的相似值為0．617，按照 Biolog系統(tǒng)讀取的16～24 h相似值＞0．50，即可判定為系統(tǒng)給出的對(duì)應(yīng)菌種。

通過上述3種常規(guī)生理生化方法鑒定可知，BH1206菌株為魯氏耶爾森菌。

2.4 16S rRNA序列的測(cè)定及系統(tǒng)發(fā)育分析

PCR擴(kuò)增BH1206菌株的16S rRNA基因片段約1500 bp，測(cè)序結(jié)果表明，該片段大小為1446 bp，在GenBank中的登陸序列號(hào)為KJ850444，同源性檢索結(jié)果表明，BH1206菌株與參考株魯氏耶爾森菌核苷酸的一致性達(dá)到98%。

從NCBI核苷酸數(shù)據(jù)庫(kù)中選取14株水產(chǎn)動(dòng)物致病菌的16S rRNA序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析，利用Mega 5．0軟件構(gòu)建進(jìn)化樹，結(jié)果如圖2所示。BH1206與魯氏耶爾森菌(NBRC102019和ATCC29473)聚成一個(gè)分支，與氣單胞菌屬、愛德華菌屬和鏈球菌屬的細(xì)菌遺傳距離較遠(yuǎn)。

綜合常規(guī)生理生化和16S rRNA序列分析結(jié)果表明，BH1206菌株為魯氏耶爾森菌。

2.5 藥敏試驗(yàn)

BH1206菌株對(duì)21種抗菌藥物的敏感性研究表明:該菌株對(duì)氟喹諾酮類藥物如氧氟沙星、環(huán)丙沙星、諾氟沙星、恩諾沙星、左氧氟沙星敏感;對(duì)氯霉素、四環(huán)素、強(qiáng)力霉素、羧芐青霉素和復(fù)方新諾明敏感;對(duì)氨芐西林、青霉素、慶大霉素、卡那霉素、鏈霉素、新霉素和呋喃唑酮中度敏感;對(duì)紅霉素、利福平、阿莫西林、多黏菌素B不敏感，其中對(duì)阿莫西林、多黏菌素B、利福平的抑菌圈直徑為0(表3)。

表2 BH1206菌株的生理生化特征分析Tab.2 Physiological and chemical characteristics of BH1206 strain in this study

圖2 基于16S rRNA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic tree of Yersinia species and other bacteria based on 16S rRNA sequences

3 討論

虹鱒腸炎紅嘴病由腸桿菌科Enterobacteriaceae、耶爾森氏菌屬Yersinia的魯氏耶爾森菌Yersinia ruckeri感染引起，此病最早于1952年在美國(guó)發(fā)現(xiàn)，在1966年分別由Rucker和Ross從發(fā)病的虹鱒體內(nèi)分離到該病原菌［14］。國(guó)外已有學(xué)者對(duì)虹鱒感染魯氏耶爾森氏菌疫苗方面進(jìn)行了研究［15-16］，而中國(guó)尚未有虹鱒感染魯氏耶爾森菌系統(tǒng)的報(bào)道。魯氏耶爾森菌屬于革蘭陰性短桿菌，為冷水性鮭鱒魚類的常見病原菌之一［17-18］。患病魚臨床癥狀表現(xiàn)為食欲減退，吻端紅腫，有紅色囊腫包裹肛門;解剖魚體，肝臟充血發(fā)黑，脾臟腫大，腸壁充血，腸腔有血色膿狀物。魯氏耶爾森菌的感染傳播機(jī)制目前尚不明確。

本研究中，從青海某冷水魚養(yǎng)殖廠的患病虹鱒魚肝臟和脾臟分離出一株BH1206菌株，對(duì)虹鱒有明顯的致病性。人工感染試驗(yàn)表明，BH1206菌株可感染健康虹鱒，并且具有致病和致死性，人工感染癥狀與自然發(fā)病癥狀相一致，均表現(xiàn)為吻端出血、肛門紅腫、腸壁出血等，從人工感染患病虹鱒中分離的細(xì)菌經(jīng)鑒定與BH1206菌株在形態(tài)及特征、理化特性和16S rRNA序列上一致，表明BH1206菌株為本研究中虹鱒腸炎紅嘴病的致病菌，該結(jié)果也與科赫法則完全相符。根據(jù)該菌的形態(tài)學(xué)特征和理化特性初步確定為魯氏耶爾森菌。從表2可以看出，由于其在精氨酸雙水解酶、山梨醇、衛(wèi)矛醇、明膠的利用上與標(biāo)準(zhǔn)魯氏耶爾森菌株存在差異，也與Fan等［19］在斑點(diǎn)叉尾鮰體內(nèi)分離的魯氏耶爾森菌不同，只能做初步鑒定而不能進(jìn)行準(zhǔn)確的鑒定。本研究中分離的BH1206菌株其16S rRNA序列與GenBank中登錄的魯氏耶爾森菌16S rRNA一致性達(dá)到98%以上;基于該序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹表明，BH1206菌株與魯氏耶爾森菌聚成一支;Biolog系統(tǒng)試驗(yàn)結(jié)果表明，BH1206菌株與魯氏耶爾森菌的相似值為0．617，按照Biolog系統(tǒng)讀取的16～24 h相似值＞0．50即可判定為系統(tǒng)給出的對(duì)應(yīng)菌種。通過一系列的分子及理化試驗(yàn)結(jié)論，進(jìn)一步確認(rèn)BH1206菌株為魯氏耶爾森菌。

虹鱒肉質(zhì)鮮美、營(yíng)養(yǎng)豐富，自從虹鱒被引入中國(guó)以來，便開始大量養(yǎng)殖，近年來人工養(yǎng)殖的虹鱒由于養(yǎng)殖密度變大、管理水平不高、水環(huán)境惡化等原因，造成其細(xì)菌性疾病愈發(fā)嚴(yán)重。自20世紀(jì)50年代，魯氏耶爾森氏菌在美國(guó)的人工養(yǎng)殖虹鱒中被發(fā)現(xiàn)以來［20］，在德國(guó)、法國(guó)、英國(guó)等歐洲各國(guó)，以及澳大利亞、中國(guó)均有所發(fā)現(xiàn)［21-25］，根據(jù)流行病學(xué)研究，近幾年虹鱒腸炎紅嘴病頻發(fā)，該病對(duì)虹鱒養(yǎng)殖業(yè)的危害逐漸加大。在虹鱒養(yǎng)殖過程中對(duì)該菌的感染要引起高度重視，采取一定的防治措施，有效控制該病的發(fā)生，減小該病對(duì)中國(guó)虹鱒養(yǎng)殖業(yè)的危害。本研究中，對(duì)魯氏耶爾森菌生長(zhǎng)特性進(jìn)行了研究，對(duì)病原菌生理特性的進(jìn)一步了解，有助于養(yǎng)殖生產(chǎn)的科學(xué)管理。本研究表明，該菌在15℃以下基本不生長(zhǎng)，但隨著溫度的升高，該菌生長(zhǎng)越加活躍，夏季高溫時(shí)節(jié)為該菌暴發(fā)最為嚴(yán)重的時(shí)期。管標(biāo)等［26］通過急性溫度脅迫對(duì)虹鱒的研究表明，虹鱒受高溫影響時(shí)內(nèi)臟酶指標(biāo)變化顯著，養(yǎng)殖戶應(yīng)控制好夏季冷水魚養(yǎng)殖溫度。Thorsen等［27］報(bào)道，該細(xì)菌在含鹽量為0～2%的水中至少能存活4個(gè)月，但在含鹽量為3．5%的水中存活時(shí)間就明顯減少，本研究表明，該菌在含鹽量為3%內(nèi)能生長(zhǎng)，與上述文獻(xiàn)相符合。班紅琴等［28］通過對(duì)虹鱒的鹽度馴化研究表明，虹鱒在高滲環(huán)境下能啟動(dòng)海水中滲透壓的調(diào)節(jié)機(jī)制，提高對(duì)鹽度的適應(yīng)能力，可以嘗試在對(duì)虹鱒養(yǎng)殖中提高鹽度環(huán)境來降低細(xì)菌生長(zhǎng)。本研究表明，該菌在pH值為6．5～7．5時(shí)生長(zhǎng)狀態(tài)最佳，因此，在冷水魚虹鱒的養(yǎng)殖過程中要時(shí)刻注意水質(zhì)及用具的消毒，殺滅水體中或用具上的魯氏耶爾森氏菌，并且可以應(yīng)用鹽及適宜酸堿度來控制魯氏耶爾森菌的生長(zhǎng)，減少該菌所致魚病的暴發(fā)。

本試驗(yàn)中感染BH1206菌株的病魚出現(xiàn)的癥狀與魯氏耶爾森菌感染鱘魚的癥狀［18，29］有相似之處，但性腺潰爛不明顯。感染魯氏耶爾森菌BH1206株而發(fā)病的虹鱒內(nèi)部臟器均有不同程度的充血現(xiàn)象，經(jīng)過解剖可見體內(nèi)臟器均有明顯的異常表現(xiàn)，病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)，肝臟和脾臟細(xì)胞壞死，產(chǎn)生大量的炎癥細(xì)胞，腸道組織極度萎縮變形，腎臟也有明顯病變。

目前，中國(guó)控制水產(chǎn)養(yǎng)殖細(xì)菌疾病的主要方式仍然是利用抗生素，藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，魯氏耶爾森菌BH1206株對(duì)氯霉素、四環(huán)素、強(qiáng)力霉素等10種藥物高度敏感，對(duì)氨芐西林、青霉素、慶大霉素、卡那霉素、鏈霉素、新霉素和呋喃唑酮7種藥物中度敏感，而對(duì)紅霉素、利福平、阿莫西林、多黏菌素B 4種藥物具有耐藥性。因此，對(duì)虹鱒腸炎紅嘴病的防治應(yīng)采用耐藥性高的抗生素，科學(xué)用藥，防治細(xì)菌性疾病對(duì)藥物本身的耐藥，以免導(dǎo)致防治失敗以及造成藥物殘留。國(guó)外學(xué)者已有研發(fā)魯氏耶爾森菌福爾馬林滅活苗浸泡免疫虹鱒的成功案例［30］，因此，可采用疫苗免疫虹鱒來預(yù)防和控制魯氏耶爾森菌病的發(fā)生，而中國(guó)對(duì)控制虹鱒腸炎紅嘴病的疫苗研發(fā)較少。通過本次研究，以期為虹鱒腸炎紅嘴病的防治提供參考，并為該病的免疫防控奠定基礎(chǔ)。

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